基礎梳理——系統(tǒng)化知識點一　基因工程的概念分析
知識點二　基因工程的操作工具　　　　3種工具，其中有兩種工具酶1．限制性內切核酸酶（又稱限制酶）（1）來源：主要是從　　生物中分離純化出來的。（2）作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的　　　　 ，并切開特定部位的兩個核苷酸之間的　　　　 。（3）結果：產生　　　　或平末端。
特別提醒正確認識限制酶①限制酶是一類酶，而不是一種酶。②將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產生四個黏性末端或平末端。 ③不同DNA分子用同一種限制酶切割，產生的末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產生的末端一般不相同。 ④限制酶切割位點應位于標記基因之外，不能破壞標記基因，以便進行檢測。 ⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
3.載體（1）作用：攜帶外源DNA片段進入　　　　。（2）種類：　　、噬菌體、　　　　 等。
特別提醒基因載體與膜載體的區(qū)別基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因導入受體細胞內，它能在宿主細胞內穩(wěn)定存在，并可對目的基因進行大量復制；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。
知識點三　基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取（1）目的基因：用于　　　　　 或獲得　　　　　 等的基因。
2．基因表達載體的構建（1）構建基因表達載體的目的：①使目的基因在受體細胞中　　　　，并且可以　　給下一代。②使目的基因能夠　　和發(fā)揮作用。（2）基因表達載體的組成：
3．將目的基因導入受體細胞　 該過程未涉及堿基互補配對
4.目的基因的檢測與鑒定
知識點四　基因工程的應用1．基因工程在農牧業(yè)方面的應用（1）轉基因　　植物；（2）轉基因　 植物；（3）轉基因　　　　植物；（4）改良植物的品質；（5）提高動物的　　　??；（6）改善畜產品的品質。2．基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領域的應用（1）對　　　　　　　　　　進行基因改造，使它們能夠生產藥物。（2）讓哺乳動物批量生產　　　。（3）可能使建立　　　　工廠的設想成為現實。3．在食品工業(yè)方面的應用：利用工程菌生產食品工業(yè)用酶、　　　　　　 等。
新的蛋白質
知識點六　生物技術的安全性與倫理問題1．轉基因產品的安全性（1）引發(fā)對轉基因產品安全性爭論的原因①基因工程對原本是自然造就的生命形式進行了改造，使之具有了　　　　。②人們所生活的國家或社會，　　　　、意識形態(tài)、宗教信仰、　　　　水平、歷史背景、傳統(tǒng)文化和　　　　觀念等的差異，決定了人們具有不同的價值觀取向。（2）理性看待轉基因技術①以完備的　　　　　 為基礎，即清晰地了解　　　　　的原理和操作規(guī)程。②應該看到人們的觀點受到許多復雜的　　　、經濟和文化等因素的影響。③要靠確鑿的　　　和嚴謹的　　進行思考和辯論。
2．關注生殖性克隆人（1）生殖性克隆與治療性克?、偕承钥寺。褐竿ㄟ^克隆技術產生_________________。②治療性克隆：指利用克隆技術產生　　　　　　 ，用來修復或替代受損的細胞、組織和器官，達到治療疾病的目的。（2）生殖性克隆人面臨的倫理問題①生殖性克隆人“有違　　　　”。②生殖性克隆人是人為地制造在　　上和　　　　上都不健全的人。③克隆技術還不成熟，生殖性克隆人會面臨　　、死胎和　　　等問題。
特定的細胞、組織和器官
（3）警惕用新技術研究生殖性克隆人①利用　　　　　 技術，有可能產生人的iPS細胞，從而產生克隆人。②如果按照“人類基因組編寫計劃”合成人類的　　　　 ，就有可能造出“無父母”人類或者擁有相同基因組的“克隆人”。
3．禁止生物武器（1）種類：包括　　　　類、病毒類和　　　　類等。（2）特點：致病能力強、攻擊范圍廣。（3）散布途徑：直接或者通過　　、生活必需品和　　　　等散布，經由　　　　　 等侵入人、畜體內，造成大規(guī)模傷亡，也能大量損害植物。
基能過關——問題化一、判一判（判斷正誤并找到課本原話）（一）重組DNA技術的基本工具1．基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。（選擇性必修3 P67正文）（　?。?．基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA連接酶、載體。（選擇性必修3 P70正文）（　?。?．限制酶能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的氫鍵斷開。（選擇性必修3 P71正文）（　　）4．基因工程中實際用到的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。（選擇性必修3 P72正文）（　　）5．質粒上標記基因的存在便于重組分子的篩選。（選擇性必修3 P72正文）（　　）
（二）基因工程的基本操作程序1．引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。（選擇性必修3 P77相關信息）（　?。?．構建基因表達載體是轉基因工程的核心工作。（選擇性必修3 P80正文）（　?。?．啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部分，有了它才能驅動DNA的復制過程。（選擇性必修3 P80正文）（　?。?．構建基因表達載體過程中通常用同種限制酶切割質粒和目的基因。（選擇性必修3 P80正文）（　?。?．轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。（選擇性必修3 P81正文）（　　）
（三）基因工程的應用及蛋白質工程的原理和應用1．科學家將外源生長素基因導入鯉魚，轉基因鯉魚的生長速率提高了42%～115%。（選擇性必修3 P89正文）（　?。?．干擾素是一種具有干擾病毒復制作用的糖蛋白，在臨床上被廣泛應用。（選擇性必修3 P90資料卡）（　?。?．基因工程中可以將目的基因與乳腺中特異表達的基因的啟動子等調控元件重組在一起，得到乳腺生物反應器。（選擇性必修3 P90正文）（　　）4．蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學科的綜合科技工程。（選擇性必修3 P93正文）（　?。?br/>（四）生物技術的安全性與倫理問題1．基因工程中研究最早、最廣泛和取得實際應用成果最多的領域是微生物基因工程。（選擇性必修3 P101正文）（　?。?．人們所生活的國家或社會，政治制度、意識形態(tài)、宗教信仰、經濟發(fā)展水平、歷史背景、傳統(tǒng)文化和倫理道德觀念等的差異，決定了人們具有相同的價值觀取向。（選擇性必修3 P103正文）（　?。?．理性看待轉基因技術最重要的是，要靠確鑿的證據和嚴謹的邏輯進行思考和辯論。（選擇性必修3 P103正文）（　?。?．我國對轉基因技術的方針是研究上要大膽，堅持自主創(chuàng)新；推廣上要慎重，做到確保安全；管理上要嚴格，堅持依法監(jiān)管。（選擇性必修3 P104正文）（　　）
5．很多生物學家認為，克隆技術已經很成熟，可以推廣使用，甚至可以克隆人。（選擇性必修3 P107正文）（　?。?．生殖性克隆人破壞了人類基因多樣性的天然屬性，不利于人類的生存和進化。（選擇性必修3 P108正文）（　?。?．生物武器相對容易獲得，也便于攜帶和施放，但不會引起公眾恐慌。（選擇性必修3 P112正文）（　?。?．1972年4月，蘇聯、美國、英國分別在其首都簽署了《禁止試制、生產和儲存并銷毀細菌（生物）和毒劑武器公約》（簡稱《禁止生物武器公約》）。（選擇性必修3 P113正文）（　?。?br/>三、連一連 　生物武器的種類
三、議一議 【教材易漏拾遺】1．[選擇性必修3 P71正文拓展]限制酶主要來源于原核生物，為什么不能切割自身DNA分子？
提示：限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的位點進行切割。限制酶不切割自身DNA分子的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
2．[選擇性必修3 P72正文拓展]DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
提示：不是。DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。
3．[選擇性必修3 P80正文拓展]構建基因表達載體的目的是什么？
提示：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代；同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
4．[選擇性必修3 P80正文拓展]為什么不能將目的基因插入載體的標記基因中？
提示：標記基因用于鑒定目的基因是否成功導入受體細胞，以便將含目的基因的細胞篩選出來，若標記基因中有目的基因插入，則標記基因被破壞，無法進行篩選。
5．[選擇性必修3 P93正文拓展]基因工程能否完全滿足人們生產和生活的需要，為什么？
提示：不能，因為基因工程原則上只能生產自然界中已存在的蛋白質，不能完全滿足人類的需要。
6．[選擇性必修3 P94正文拓展]蛋白質工程為什么通過對基因進行操作來實現對天然蛋白質的改造？
提示：①蛋白質具有十分復雜的空間結構，基因的結構相對簡單，容易改造；②改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質無法遺傳。
7．[選擇性必修3 P103正文拓展]轉入生長激素基因的魚生長速度快，餌料轉化率高。但魚類易于逃逸、擴散，因此轉基因魚存在生態(tài)安全性問題，我國科學家只將三倍體的轉基因魚投入自然系統(tǒng)。請根據材料思考回答下列問題：（1）轉基因魚成功的物質基礎是什么？???（2）試從保障生態(tài)安全性問題分析只投放三倍體魚的原因。
提示：轉基因技術能夠進行的物質基礎是各種細胞生物都以DNA分子作為遺傳物質。
提示：三倍體魚不能繁殖，可以人工控制養(yǎng)殖數量和范圍，避免發(fā)生雜交、競爭，引起生態(tài)危機。
8．[選擇性必修3 P106正文發(fā)掘]生殖性克隆與治療性克隆最主要的區(qū)別是什么？
提示：克隆的目的不同，生殖性克隆的目的是用于生育，產生新個體；治療性克隆的目的是治療人類疾病。
9．[選擇性必修3 P112正文發(fā)掘]對待生物武器的態(tài)度與轉基因安全性的態(tài)度有何不同？
提示：對待生物武器的態(tài)度是在任何情況下不發(fā)展、不生產、不儲存生物武器，并反對生物武器及其技術和設備的擴散。對待轉基因生物的安全性的態(tài)度是趨利避害，而不能因噎廢食。
考點一　基因工程的概念及操作工具任務1　完善基因工程的理論基礎
任務2　與DNA有關的酶的比較
任務3　明確載體上標記基因的標記原理載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如圖所示：
1.基因載體與膜載體的區(qū)別基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因導入受體細胞內，它能在宿主細胞內穩(wěn)定存在，并可對目的基因進行大量復制；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。
2．正確認識限制酶（1）限制酶是一類酶，而不是一種酶。 （2）將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產生四個黏性末端或平末端。 （3）不同DNA分子用同一種限制酶切割，產生的末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產生的末端一般不相同。 （4）限制酶切割位點應位于標記基因之外，不能破壞標記基因，以便進行檢測。 （5）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
考向一 基因工程操作工具的基礎考查1.用Xh Ⅰ和Sal Ⅰ兩種限制性內切核酸酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產物分離結果如圖。以下敘述錯誤的是（　?。〢．圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同B．圖2中酶切產物可用于構建重組DNAC．泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產物D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
解析：限制酶識別特定的核苷酸序列，不同的限制酶能識別不同的核苷酸序列，由電泳圖可知XhⅠ和SalⅠ兩種酶分別切割時，識別的序列不同，A正確；同種限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA連接酶進行連接，可以構成重組DNA，B正確；SalⅠ將DNA片段切成4段，XhⅠ將DNA片段切成3段，根據電泳結果可知泳道①為SalⅠ，泳道②為XhⅠ，C正確；限制酶切割雙鏈DNA，酶切后的DNA片段仍然是雙鏈DNA為主，只在黏性末端出現部分單鏈，D錯誤。
2．[2023·江蘇省東臺中學高三檢測]“工欲善其事，必先利其器”。限制性內切核酸酶、DNA連接酶的發(fā)現為DNA切割、連接、功能基因的獲得以及表達載體的構建創(chuàng)造了條件，下列關于限制性內切核酸酶和DNA連接酶的敘述，正確的是（　　）A．兩者都是從原核生物中分離純化出來的B．兩者的催化都會導致磷酸二酯鍵數目的改變C．限制性內切核酸酶都能在特定位點切割產生黏性末端D．T4 DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端
3．下列關于載體的敘述中，錯誤的是（　?。〢．載體與目的基因結合后，實質上就是一個重組DNA分子B．對某種限制酶而言，載體最好只有一個切點，但還要有其他多種酶的切點C．目前常用的載體有質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒D．載體具有某些標記基因，便于對其進行切割
解析：載體與目的基因結合后會形成一個重組DNA分子，A正確；載體中，對某種限制酶而言，最好只有一個切點，但還要有其他多種限制酶的切點，便于與目的基因定向連接，B正確；目前常用的載體有質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒，C正確；載體上要具有某些標記基因，便于篩選重組DNA分子，D錯誤。
4．近年誕生的 CRISPR/Cas9基因編輯技術可進行基因定點編輯。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括Cas9（限制性內切核酸酶）和向導RNA，其原理是由向導RNA引導Cas9到一個特定的基因位點進行切割（上述過程見下圖）。下列相關敘述正確的是（　?。〢．CRISPR/Cas9的組成物質是在核糖體上合成的B.向導RNA的合成需要逆轉錄酶的參與C．基因的定點編輯過程只涉及堿基A—U，G—C的互補配對D．切割后形成的每個DNA片段均含有兩個游離的磷酸基團
解析：CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括Cas9(限制性內切核酸酶)和向導RNA，前者是在核糖體上合成，后者是通過轉錄形成的，其場所不在核糖體，A錯誤；向導RNA可通過轉錄形成，逆轉錄酶以RNA為模板合成DNA，B錯誤；向導RNA和目標DNA互補配對過程中，涉及的配對方式有A—U，G—C，T—A，C—G，C錯誤；由于DNA分子是雙鏈結構，因此切割后形成的每個DNA分子的片段中均含有2個游離的磷酸基團，D正確。
考向二 基因工程操作工具的綜合考查5.[2023·湖北高三模擬]大米的鐵含量極低，科研人員通過基因工程、植物組織培養(yǎng)等現代生物技術，培育出了鐵含量比普通大米高60%的轉基因水稻，改良了稻米的營養(yǎng)品質。下圖為培育轉基因水稻過程示意圖，其中①～⑥為過程，EcRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ為限制酶。
（1）該轉基因水稻培育過程中選取目的基因用到的限制酶是　　　　　　。這么操作的優(yōu)點是　　　　　　　　　　　　。（回答3點）（2）PCR是獲取大量目的基因的一種方法，反應體系的成分中有兩種引物，對兩種引物的設計要求之一是：兩種引物之間不能堿基互補配對，試分析原因　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　??；下圖展示了用PCR技術從DNA分子中獲取鐵合蛋白基因的過程，A、B、C、D是四種引物，選擇圖中的　　　　引物通過PCR三次循環(huán)就可將鐵合蛋白基因分離出來。
BamHⅠ和HindⅢ
防止自身環(huán)化，避免反向連接，防止目的基因被破壞
防止引物之間結合形成雙鏈，并因此降低了引物與DNA模板鏈結合的效率
（3）圖中④⑤⑥過程，屬于　　　　　　　技術，制備的培養(yǎng)基是由無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、　　　　　四部分組成。
考點二　基因工程的基本操作程序及應用?任務1　結合抗蟲棉的培育過程圖填空（1）從圖中可以看出，目的基因是　　　　　，使用的載體是　　，將目的基因表達載體導入受體細胞的方法是　　　　　　　。（2）請寫出兩種檢測目的基因是否表達的方法：　　　　　　　。
抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲
任務2　觀察基因工程的操作過程，分析每一步驟的操作程序?
任務3　目的基因的檢測和鑒定
任務4　完善基因工程的應用
1.基因工程操作的四個易錯點（1）目的基因的插入位點不是隨意的，基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入啟動子與終止子之間的部位。（2）基因工程操作過程中只有第三步（將目的基因導入受體細胞）沒有堿基互補配對現象。（3）農桿菌轉化法原理：農桿菌易感染雙子葉或裸子植物的細胞，并將其Ti質粒上的T-DNA轉移并整合到受體細胞染色體DNA上。（4）啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子啟動子和終止子位于DNA片段上，分別控制轉錄過程的啟動和終止；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
2．限制酶的選擇技巧（1）根據目的基因兩端的限制酶切點來確定限制酶的種類①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用Pst Ⅰ和EcR Ⅰ兩種限制酶（但要確保質粒上也有這兩種酶的切點）。
（2）根據質粒的特點來確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產生相同的黏性末端。②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶Sma Ⅰ會破壞標記基因。如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復制。
考向一 對基因工程的操作程序的考查1．[經典模擬]如圖表示用化學方法合成目的基因Ⅰ的過程。據圖分析，下列敘述正確的是（　?。〢．過程①需要DNA連接酶B．過程②需要限制性內切核酸酶C．目的基因Ⅰ的堿基序列是已知的D．若某質粒能與目的基因Ⅰ重組，則該質粒和目的基因Ⅰ的堿基序列相同
解析：過程①僅僅是單鏈a和單鏈b之間形成氫鍵，不需要DNA連接酶，A錯誤；過程②與過程①的本質相同，故不需要DNA限制性內切核酸酶，B錯誤；圖中顯示的是人工合成基因的流程圖，因此需要知道目的基因Ⅰ的堿基序列，C正確；形成重組DNA分子的過程中，質粒與目的基因Ⅰ的堿基序列是不可能相同的，D錯誤。
2. 甲基對硫磷是常見的農藥污染物。科研人員嘗試改造并分離得到能夠降解甲基對硫磷的微生物。下列操作中錯誤的是（　　）A．構建含有甲基對硫磷分解酶基因的表達載體B．將甲基對硫磷分解酶基因表達載體導入受體菌C.用甲基對硫磷為唯一碳源的培養(yǎng)基選擇所需工程菌D．提取工程菌的質粒并檢測甲基對硫磷基因的含量
解析：要改造能夠降解甲基對硫磷的微生物，需要構建含有甲基對硫磷分解酶基因的表達載體，A正確；將甲基對硫磷分解酶基因表達載體導入受體菌，是基因表達載體的構建，是基因工程的核心步驟，B正確；甲基對硫磷是一種含碳農藥，故用甲基對硫磷為唯一碳源的培養(yǎng)基選擇所需工程菌，C正確；目的基因的檢測和鑒定應重點監(jiān)測目的基因的插入與否及插入后的表達結果，可采用DNA分子雜交技術等手段，而非提取工程菌的質粒并檢測甲基對硫磷基因的含量，D錯誤。
考向二 基因工程的綜合考查3．[2023·重慶市江津中學高三模擬]黃萎病是危害棉花種植的常見疾病，科學家通過基因工程技術將抗黃萎病基因——葡萄糖氧化酶基因（GO）導入棉花，獲得抗黃萎病棉花。已知T-DNA上的基因在農桿菌中不表達，在植物細胞中可以表達，請將轉基因棉花培育步驟補充完整：
（1）構建上圖所示重組Ti質粒，用　　　　處理農桿菌，使重組Ti質粒進入農桿菌中，將農桿菌接種到含　　　　的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)適宜時間后，離心，去除上清液，加入適量MS液體培養(yǎng)基，可通過測定菌液在600 nm波長處的OD值來確定農桿菌密度是否適宜。（2）切取經　　　　培養(yǎng)的棉花幼苗的下胚軸，直接轉入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用滅菌濾紙吸取下胚軸表面多余菌液，將下胚軸放入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。2天后，向培養(yǎng)基中加入適量　　　　和青霉素，其目的是篩選出轉化成功的棉花細胞和　　　　　　　　。
（3）將所得愈傷組織接種到適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導形成胚狀體，在適宜人工條件下繼續(xù)發(fā)育成棉花幼苗。利用　　　　　　　　技術檢測棉花細胞是否合成　　　　　　，選出抗黃萎病棉花。通過　　　　　　　可以從個體水平上鑒定該棉花對黃萎病的抗性。
考點三　DNA的粗提取與鑒定及PCR技術任務1　完善實驗原理（1）DNA與蛋白質在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同
（2）DNA不溶于　　　　，但是細胞中的某些蛋白質則溶于酒精，利用這一原理可將DNA與蛋白質進一步分離。（3）DNA與二苯胺在沸水浴加熱，呈　　色。
任務2　實驗步驟①稱取30 g洋蔥，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。②漏斗中墊　　，將研磨液過濾到燒杯中，　　 ℃處理，取上清液。③在上清液中加入體積相等的、預冷的　　溶液，靜置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分。④取兩支20 mL的試管編號A、B，各加入2 ml/L的　　　　溶液5 mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4 mL的　　　　?；靹蚝螅瑢⒃嚬苤糜凇　≈屑訜? min。⑤結果觀察：A試管　　　，B試管　　。
任務3　通過PCR技術（聚合酶鏈式反應）擴增DNA片段（1）PCR原理：在一定的緩沖溶液中提供　　　　　，分別與兩條模板鏈相結合的兩種　　　，四種脫氧核苷酸，耐高溫的　　　　，同時控制溫度使DNA復制在體外反復進行。（2）PCR的反應過程①　　　：當溫度上升到　　　以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，如下圖：
　　　　：系統(tǒng)溫度下降至　　　左右時，兩種　　　通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合，如下圖：③　　?。寒斚到y(tǒng)溫度上升至72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸（A、T、G、C）在　　　　　　　　　的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如下圖：
（3）結果①PCR一般要經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為　　　、復性和　　　三步。②兩引物間固定長度的DNA序列呈　　擴增（即　　?。?。
1.DNA粗提取過程中的注意事項（1）破碎細胞應徹底、充分。（2）酒精必須經過充分預冷后才能使用。（3）實驗過程中，攪拌時玻璃不能直插燒杯底部，并且攪拌要輕緩，并沿一個方向攪拌以便獲得完整的DNA分子。（4）將絲狀物溶于2 ml/L的NaCl溶液中時，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量。（5）二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
2．瓊脂糖凝膠電泳注意事項（1）為避免外源DNA等的影響，實驗中的微量離心管、一次性吸液槍頭和蒸餾水等使用前必須進行高壓蒸汽滅菌處理。（2）緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，放在冰塊上緩慢融化。（3）移液器每吸取一種試劑后，都必須更換槍頭。（4）操作時，戴好一次性手套。
3．PCR與DNA復制的比較（1）DNA復制與PCR技術的區(qū)別①解旋方式：DNA復制是解旋酶催化；PCR技術是DNA在高溫作用下變性解旋。②場所：DNA復制在細胞內（主要在細胞核內）；PCR技術在細胞外（主要在PCR擴增儀內）。③酶：DNA復制需要DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等；PCR技術需要耐熱的DNA聚合酶。
④溫度條件：DNA復制需要在細胞內的溫度條件下進行；PCR技術需控制溫度，在較高溫度下進行。⑤合成的對象：DNA復制的合成對象是DNA分子；PCR技術合成的對象是DNA片段或基因。⑥引物：DNA復制的引物是RNA；PCR技術的引物是DNA或RNA。（2）DNA復制與PCR技術的聯系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成。②原料：均為四種脫氧核苷酸。③酶：均需要DNA聚合酶進行催化。
考向一 對DNA粗提取過程的考查1.圖1、2分別為“DNA的粗提取與鑒定”實驗中部分操作步驟示意圖，下列敘述不正確的是（　?。〢．圖1、2中加入蒸餾水稀釋的目的相同B．圖1中完成過濾之后保留濾液C．圖2中完成過濾之后棄去濾液D．在圖1雞血細胞液中加入少許嫩肉粉有助于去除雜質
解析：圖1中加入蒸餾水的目的是使雞血細胞吸水漲破，釋放其中的核物質，圖2中加入蒸餾水的目的是降低NaCl的濃度，使DNA的溶解度降低而析出，A錯誤；DNA溶于水，圖1中完成過濾后，DNA溶解于濾液中，需保留濾液，B正確；圖2中DNA已析出，則過濾后棄去濾液，保留含DNA的黏稠物，C正確；在圖1中雞血細胞液中加入少許嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的雜質蛋白，有利于去除雜質蛋白，D正確。
2．下列關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗敘述，錯誤的是（　?。〢．酵母和菜花均可作為提取DNA的材料B．DNA既溶于2 ml/L NaCl溶液也溶于蒸餾水C．過濾時用濾紙代替紗布效果更好D．DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍
解析：只要含DNA的生物材料原則上都可進行本實驗，只是DNA含量高的成功的可能性更大，所以酵母和菜花均可作為提取DNA的材料，A正確；DNA在2 ml/L NaCl溶液中溶解度較大，也可溶解于蒸餾水中，B正確；DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量，C錯誤；DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍，故D正確。
考向二 對PCR技術的考查3.目前廣泛應用的新型冠狀病毒檢測方法是實時熒光RT－PCR技術。RT－PCR是將RNA逆轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應相結合的技術，具體過程如圖所示。下列說法錯誤的是（　?。〢．與該mRNA結合的引物，可以是A也可以是BB.引物A與引物B的基本單位都是脫氧核苷酸C．過程Ⅱ通過控制溫度的變化實現目標序列的循環(huán)擴增D．該反應體系中應加入逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶等物質?
解析：通過圖示可知，與該mRNA結合的是引物A，A錯誤；引物A與引物B是一段DNA序列，其基本單位都是脫氧核苷酸，B正確；過程Ⅱ為PCR的反應階段，通過控制溫度的變化實現變性、復性、延伸，實現目標序列的循環(huán)擴增，C正確；RT－PCR反應體系中應加入緩沖液、引物、四種脫氧核糖核苷酸、逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶等物質，D正確。
4．熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中某種DNA含量。其原理是在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針（探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記的已知核苷酸序列的核酸片段），當Taq DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成。下列相關敘述錯誤的是（　?。?br/>A．引物與探針均具特異性，與模板結合時遵循堿基互補配對原則B．反應最終的熒光強度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈正相關C．若用cDNA（部分基因文庫）作模板，上述技術也可檢測某基因的轉錄水平D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向總是從子鏈的3′端向5′端延伸
考向三 PCR技術的應用5.[2023·四省八校高三開學考試]用PCR技術將DNA分子中的A1片段進行擴增，實驗中設計了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶的識別序列。擴增后得到的絕大部分DNA片段是下圖中的（　?。?br/>解析：利用PCR技術將DNA分子中的A1片段進行擴增，當引物與母鏈通過堿基互補配對結合后，子鏈延伸的方向總是從5′端到3′端，據此依題意和圖示分析可知，A、B、C均錯誤，D正確。
6．SRY基因為Y染色體上的性別決定基因，可用SRY－PCR法鑒定胚胎性別，其基本程序如圖。相關說法正確的是（　?。〢．PCR擴增的操作步驟依次是：高溫變性、中溫復性、低溫延伸B．上述過程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶C．PCR技術中以核糖核苷酸為原料，以指數方式擴增D．SRY探針能與雄性胚胎樣品中DNA配對
解析：PCR擴增的操作步驟依次是高溫變性、低溫復性及適溫延伸等，A錯誤；上述過程需要使用的工具酶之一是耐高溫的DNA聚合酶，B錯誤；PCR技術的原理是DNA雙鏈的復制，其產物是大量的DNA，所以需要以脫氧核苷酸為原料，C錯誤；SRY基因為Y染色體上的性別決定基因，SRY探針是用位于Y染色體上的性別決定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探針能與雄性胚胎樣品中DNA配對，D正確。
考點四　蛋白質工程、轉基因技術的安全性及生物武器?任務1　完善蛋白質工程概念的相關填空
滿足人類生產和生活需求
任務2　完善轉基因技術的安全性的相關內容（1）安全性問題①　　　　安全：滯后效應、　　　　、營養(yǎng)成分改變等。②生物安全：對　　　　　　　的影響等。③環(huán)境安全：對　　　　　　　的影響等。（2）理性看待轉基因技術①需要正確的社會輿論導向：　　　　　　，不能因噎廢食。②制定　　　　　　，最大程度保證轉基因技術和產品的安全性。任務3　完善生物武器的相關內容（生物武器的特點）①致病力強、　　　??；②污染面廣、危害時間長；③難以防治；④具有一定的　　　?。虎菔堋　　　∮绊懘?。
任務4　蛋白質工程與基因工程的區(qū)別和聯系
任務5　填寫蛋白質工程流程圖中字母代表的含義A.　　　　，B.　　　　，C.　　　　　　，D.　　　　　　　　，E.　　　　　　。?
1.轉基因生物存在安全性問題的原因（1）目前對基因的結構、調控機制及基因間的相互作用了解有限。（2）目的基因往往是異種生物的基因。（3）外源基因插入宿主細胞基因組的部位往往是隨機的。2．根據改造蛋白質的部位的多少，對蛋白質的改造可分為三類：（1）“大改”：設計并制造出自然界不存在的全新蛋白質。（2）“中改”：在蛋白質分子中替換某一個肽段或某一個特定的結構域。（3）“小改”：改造蛋白質分子中的幾個氨基酸殘基。
考向一 對蛋白質工程的考查1.[2023·寧夏石嘴山三中高三月考]目前科學家們通過蛋白質工程制造出了藍色熒光蛋白、黃色熒光蛋白等。采用蛋白質工程技術制造出藍色熒光蛋白過程的正確順序是（　?。?①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列②藍色熒光蛋白的功能分析和結構設計序列③藍色熒光蛋白基因的合成④表達出藍色熒光蛋白A．①②③④ B．②①③④C．②③①④ D．④②①③
解析：蛋白質工程的基本途徑是：從預期的蛋白質功能出發(fā)→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列(基因)或合成新的基因→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質→相應的表達。因此，采用蛋白質工程技術制造出藍色熒光蛋白過程的正確順序是：②藍色熒光蛋白的功能分析和結構設計→①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列→③藍色熒光蛋白基因的合成→④表達出藍色熒光蛋白。
2．下圖表示蛋白質工程的操作過程，相關說法不正確的是（　?。〢．蛋白質工程中對蛋白質分子結構的了解是非常關鍵的工作B．蛋白質工程是完全擺脫基因工程技術的一項全新的生物工程技術C．a、b過程分別是轉錄、翻譯D．蛋白質工程中可能構建出一種全新的基因
解析：蛋白質工程中了解蛋白質分子結構如蛋白質的空間結構、氨基酸的排列順序等，對于合成或改造基因至關重要；蛋白質工程的進行離不開基因工程，對蛋白質的改造是通過對基因的改造來完成的；圖中a、b過程分別是轉錄、翻譯過程；蛋白質工程中可根據已經明確的蛋白質的結構構建出一種全新的基因。
考向二 轉基因技術安全性的考查3.下列關于轉基因生物安全性的敘述中，錯誤的是（　?。〢．我國已經對轉基因食品和轉基因農產品強制實施了產品標識制度B．國際上大多數國家都在轉基因食品標簽上警示性注明可能的危害C．開展風險評估、預警跟蹤和風險管理是保障轉基因生物安全的前提D．目前對轉基因生物安全性的爭論主要集中在食用安全性和環(huán)境安全性上
解析：為了維護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，我國對轉基因食品和轉基因農產品實行了標識制度，A正確；轉基因食品上只標明原料來自轉基因生物，并未標明其危害，B錯誤；為保障轉基因生物的安全性，可開展風險評估、預警跟蹤和風險管理等措施，C正確；轉基因生物是否安全的爭論主要集中在它是否能保證食用安全及環(huán)境安全上，D正確。
4．病毒疫苗的研制是現代生物技術應用最廣泛的領域，現在研發(fā)的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重組技術而建立。請分析并回答下列問題：（1）第二代疫苗是以編碼病毒抗原蛋白的RNA為模板，經　　　.酶的作用而獲得目的基因，再利用　　　　　　　　這些工具酶來構建重組質粒。形成的重組質粒與經過　　　　　　　　處理的大腸桿菌細胞混合可轉化大腸桿菌，再擴增大腸桿菌以獲得大量的抗原蛋白。
限制酶和DNA連接酶　
氯化鈣溶液(Ca2＋)　
（2）在構建好的重組質粒中，引導目的基因表達的序列是　　　，它是　　　　　的識別和結合位點。（3）第三代疫苗即“DNA疫苗”，是將編碼某種抗原蛋白的DNA注射到動物體內，該DNA可在生物體內　　　　　出相應的抗原蛋白。（4）現代對于基因工程產品安全性的爭論越來越激烈，轉基因生物的安全性主要體現在　　　　、　　　　、　　　　三個方面。
[長句應答必備]1．限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點上切割DNA分子。2．DNA連接酶的作用部位是磷酸二酯鍵。3．質粒是常用的載體，它是一種小型的雙鏈環(huán)狀DNA分子，具有一個至多個限制酶切割位點及標記基因。4．基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。5．目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法；導入動物細胞常用顯微注射法，導入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法。
[等級選考研考向]1．[2023·浙江1月]以哺乳動物為研究對象的生物技術已獲得了長足的進步。對生物技術應用于人類，在安全與倫理方面有不同的觀點，下列敘述正確的是（　?。〢．試管嬰兒技術應全面禁止B．治療性克隆不需要監(jiān)控和審查C．生殖性克隆不存在倫理道德方面的風險D．我國不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗
解析：試管嬰兒屬于有性生殖，合理范圍內，試管嬰兒技術是可以使用的，A錯誤；治療性克隆要在嚴格監(jiān)管下進行，B錯誤；生殖性克隆會引起嚴重的道德、倫理、社會和法律問題，C錯誤。
2．[2022·遼寧卷]抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12－5是我國自主研發(fā)的轉基因品種。為給監(jiān)管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監(jiān)測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是（　?。〢．預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制B．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分C．延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制D．轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市
解析：預變性是使引物完全變性解開，A錯誤；后延伸過程是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產物完全退火形成雙鏈結構，可使目的基因的擴增更加充分，B正確；延伸過程需引物參與，C錯誤；轉基因品種不只需要檢測是否含有目的基因，還要檢測是否表達，還有安全性問題，D錯誤。
3．[2022·江蘇卷]采用基因工程技術調控植物激素代謝，可實現作物改良。下列相關敘述不合理的是（　　）A．用特異啟動子誘導表達iaaM（生長素合成基因）可獲得無子果實B．大量表達ipt（細胞分裂素合成關鍵基因）可抑制芽的分化C．提高ga2x（氧化赤霉素的酶基因）的表達水平可獲得矮化品種D．在果實中表達acs（乙烯合成關鍵酶基因）的反義基因可延遲果實成熟
解析：生長素能促進果實發(fā)育，用特異啟動子誘導表達iaaM(生長素合成基因)可獲得無子果實，A正確；大量表達ipt(細胞分裂素合成關鍵基因)，細胞分裂素含量升高，細胞分裂素和生長素的比例高時，有利于芽的分化，B錯誤；赤霉素能促進細胞伸長，從而引起莖稈伸長和植物增高，提高ga2x(氧化赤霉素的酶基因)的表達水平使赤霉素含量降低從而能獲得矮化品種，C正確；乙烯有催熟作用，在果實中表達acs(乙烯合成關鍵酶基因)的反義基因，即是抑制乙烯的合成，果實成熟會延遲，D正確。
4．[2022·廣東卷]“綠水逶迤去，青山相向開”大力發(fā)展低碳經濟已成為全社會的共識?；谀承┧缶奶厥獯x能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣（含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業(yè)）為原料，通過厭氧發(fā)酵生產丙酮，構建一種生產高附加值化工產品的新技術。
回答下列問題：（1）研究者針對每個需要擴增的酶基因（如圖）設計一對　　　，利用PCR技術，在優(yōu)化反應條件后擴增得到目標酶基因。（2）研究者構建了一種表達載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　，終止子的作用是______________________________。
作為標記基因，篩選含有基因表達載體的受體細胞　
終止轉錄，使轉錄在需要的地方停下來
（3）培養(yǎng)過程中發(fā)現重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現了生長遲緩的現象，推測其原因可能？此外丙酮的積累會傷害細胞，需要進一步優(yōu)化菌株和工藝才能擴大應用規(guī)模。（4）這種生產高附加值化工產品的新技術，實現了　　　　　　，體現了循環(huán)經濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術的優(yōu)勢在于______________________________________________________，具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。
二氧化碳等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長
不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業(yè)廢氣中的二氧化碳
5．[2022·河北卷] 蛋白酶抑制劑基因轉化是作物抗蟲育種的新途徑。某研究團隊將胰蛋白酶抑制劑（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（StPin1A）的基因單獨或共同轉化棉花，獲得了轉基因植株?；卮鹣铝袉栴}：（1）蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是______________________________________________________。（2）　　　　　　　　　是實施基因工程的核心。（3）利用農桿菌轉化法時，必須將目的基因插入到質粒的　　　上，此方法的不足之處是　　　　　　　　　　　　。（4）為檢測目的基因在受體細胞基因組中的整合及其轉錄和翻譯，可采用的檢測技術有　　　　　　　　　　　?。▽懗鰞牲c即可）。
調節(jié)害蟲胰蛋白酶活性，從而使害蟲不能正常消化食物，達到抗蟲的目的
該方法不適用于單子葉植物
基因—DNA分子雜交技術、mRNA—分子雜交技術、抗原—抗體雜交技術
（5）確認抗蟲基因在受體細胞中穩(wěn)定表達后，還需進一步做抗蟲　　　以鑒定其抗性程度。下圖為三種不同遺傳操作產生的轉基因棉花抗蟲實驗結果，據結果分析　?。ㄌ睢癗aPI”或“StPin1A”或“NaPI＋StPin1A”）轉基因棉花的抗蟲效果最佳，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
飼喂NaPI轉基因的蟲體質量較對照組差，且每株棉鈴數較對照組少
（6）基因突變可產生新的等位基因，在自然選擇的作用下，昆蟲種群的基因頻率會發(fā)生　　　　。導致昆蟲朝著一定的方向不斷進化。據此推測，胰蛋白酶抑制劑轉基因作物長期選擇后，某些害蟲具有了抗胰蛋白酶抑制劑的能力，其分子機制可能？（寫出兩點即可）。
由于害蟲發(fā)生基因突變后，在胰蛋白酶抑制劑的選擇下，抗性基因頻率逐漸增高，從而提升了其抗胰蛋白酶抑制劑的能力，或胰蛋白酶抑制劑基因發(fā)生突變后不能編碼出胰蛋白酶抑制劑
6．[2022·湖南卷]水蛭是我國的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}：（1）蛋白質工程流程如圖所示，物質a是　　　　　　　　，物質b是　　　　。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是　　　　　　　　。（2）蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　　　　　　.和利用 PCR 技術擴增。PCR 技術遵循的基本原理是　　　　　　　。
從基因文庫中獲取目的基因
通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成
（3）將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的　　　?。ㄌ睢胺N類”或“含量”）有關，導致其活性不同的原因是________________________________。
提取的水蛭蛋白的酶解時間和處理的酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞　
（4）若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路____________________________________________。
取3支試管，分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統(tǒng)計三支試管中血液凝固時間
[國考真題研規(guī)律]7．[2022·全國乙卷]新冠疫情出現后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用?；卮鹣铝袉栴}。（1）新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA（核酸檢測）可以采取RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是　　　　，再通過PCR技術擴增相應的DNA片段。根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。（2）為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的　　　　　　來進行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是　　。

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