我國是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國。棉花在種植過程中，常常會(huì)受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。
如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？
將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因 轉(zhuǎn)入普通棉花
培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程
普通棉花（無抗蟲特性）
抗蟲棉 （有抗蟲特性）
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
4.目的基因的檢測與鑒定
基因工程的基本操作程序
在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。
根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。
在我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家人工合成了目的基因。現(xiàn)在，常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。
獲取目的基因的方法有多種
利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因
在我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家采用的是人工合成的方法。
（2）從基因文庫中獲取
基因文庫概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。
基因組文庫：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體
cDNA文庫含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體
cDNA：先由mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下獲得單鏈DNA，再利用DNA聚合酶，將單鏈DNA復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈DNA，即為cDNA。
（3）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：DNA半保留復(fù)制，即在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）
對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制
可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因
穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）
什么是引物？引物的作用是什么？
定義：引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單 鏈核酸。（長度通常為20-30個(gè)核苷酸）
作用：引物為DNA聚合酶提供了游離的3’端，使DNA聚合酶從3’端開 始拼接單個(gè)的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈
當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。
溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。
第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；
第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；
問題4： PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？
一個(gè)DNA，一對(duì)引物（A與B），復(fù)制n次：
（1）子代DNA分子等長的DNA分子數(shù)為：_________個(gè)（2）子代DNA分子中不等長鏈DNA分子數(shù)為：_________個(gè)（3）子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：__________個(gè)（4）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：____個(gè)（5）復(fù)制過程中共需引物________個(gè)（6）第n次復(fù)制需要引物_________個(gè)
（1）方法：瓊脂糖凝膠電泳
DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就叫電泳。
較小的DNA片段在凝膠中的移動(dòng)相對(duì)容易，較大的DNA片段移動(dòng)難。
當(dāng)電泳結(jié)束時(shí)，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(標(biāo)準(zhǔn))，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。
1.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯(cuò)誤的是A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實(shí)現(xiàn)解旋C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相同
問題1：獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞呢？
目的：確?；蛟谑荏w細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代； 使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
思考：各個(gè)元件有什么作用？
基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段
編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。
非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。
1.原核生物的基因結(jié)構(gòu)
RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段
也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段
2.真核生物的基因結(jié)構(gòu)
能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。
能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。
目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀
啟動(dòng)子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)
終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄
標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。
1、基因表達(dá)載體的組成
問題2：目的基因應(yīng)該插入什么位置？
目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入 ，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。
啟動(dòng)子和終止子之間的部位
激活或抑制目的基因表達(dá)
問題3：如何構(gòu)建抗蟲棉的基因表達(dá)載體？
用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口
用同一種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，形成了一個(gè)重組DNA分子。
（1）使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？
目的基因與目的基因連接
正向連接 反向連接
A、質(zhì)粒重新環(huán)化B、目的基因自身環(huán)化C、質(zhì)粒與目的基因反向連接
選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割
（2）如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？
A、防止質(zhì)粒重新環(huán)化B、防止質(zhì)粒與目的基因反向連接C、防止目的基因自身環(huán)化
1.請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問題：
（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？
因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。
質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。
（2）只使用EcRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？
①質(zhì)粒、目的基因發(fā)生自身環(huán)化；
②質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接。
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
（1）花粉管通道法 (我國獨(dú)創(chuàng))
①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。
冠癭瘤農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤等
A、農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。B、農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有的 Ti 質(zhì)粒上的 T - DNA 可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且將其整合到該受體細(xì)胞染色體 DNA 上。
Ti質(zhì)粒的T-DNA中
受體細(xì)胞的染色體DNA上（使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)）
含目的基因的重組Ti質(zhì)粒
T-DNA攜帶目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中
常用受體細(xì)胞：動(dòng)物受精卵最常用的方法：利用顯微注射直接將目的基因注入動(dòng)物的受精卵中，這個(gè)受精卵將發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物。
生物：在基因工程操作中，常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛。方法：一般先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。
棉花細(xì)胞中，重組表達(dá)載體是否導(dǎo)入成功？是否可以穩(wěn)定維持并表達(dá)出Bt蛋白？表達(dá)出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？
③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因
M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果
①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因
一段帶放射性標(biāo)記的、與目的基因互補(bǔ)的特異核苷酸序列?？梢允荄NA，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA，探針的長度可以包括整個(gè)基因，或基因的一部分。
原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。
方法2：DNA分子雜交技術(shù)
過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。
方法：抗原-抗體雜交技術(shù)
實(shí)驗(yàn)：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
常采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA 雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控 溫度的儀器。
1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：
（2）PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。 一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。
1.了解PCR和電泳鑒定的基本原理
2.嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物
2.DNA片段電泳鑒定的原理：
（1）DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。
（2）PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）等有關(guān)。
（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
①無菌水、瓊脂糖；②電泳緩沖液（TAE或TBE）；③凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán)）；④核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。
① PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）
注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭
用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。
待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。
將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。
參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。
可根據(jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間
預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。
①將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子， 以形成加樣孔。
根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
②凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。
③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。
——加樣孔側(cè)連電極負(fù)極。
電泳緩沖液用來維持pH值，使DNA帶負(fù)電荷。
將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。
凝膠載樣緩沖液類似層析液
接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻
將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜
將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物
接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相
1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、 槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。
2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成 小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放 在冰塊上緩慢融化。
3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后， 移液器上的槍頭都必須更換。
4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。
5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。
1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？
可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。
如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。
2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶， 請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。
1.下列利用洋蔥進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述， 正確的是（ ）A.將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，要棄去上清液B.采用體積分?jǐn)?shù)為95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分雜質(zhì)C.用塑料離心管是因?yàn)橛貌Ａщx心管容易破損D.將白色絲狀物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后振蕩， 觀察顏色變化

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第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

版本： 人教版 (2019)

年級(jí)： 選擇性必修3

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