一、理清主干知識(shí)
基因工程的基本操作程序
eq \x(\a\al(目的基因的,篩選與獲取))→eq \x(\a\al(基因表達(dá)載,體的構(gòu)建))→eq \x(\a\al(將目的基因?qū)?入受體細(xì)胞))→eq \x(\a\al(目的基因的,檢測(cè)與鑒定))
一、目的基因的篩選與獲取
1．目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
2．篩選合適的目的基因
從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。
3．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
(1)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
(2)PCR反應(yīng)的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。
(3)PCR擴(kuò)增的過(guò)程
(4)PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。
二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建
1．目的
(1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
2.組成及作用(連線)
三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
1．轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。
2．將目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的方法(連線)
四、目的基因的檢測(cè)與鑒定(連線)
二、診斷自學(xué)效果
1．判斷下列敘述的正誤
(1)表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均起始于啟動(dòng)子(×)
(2)目的基因?qū)腚p子葉植物細(xì)胞一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(√)
(3)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體(×)
(4)抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)(√)
(5)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原抗體雜交技術(shù)(×)
2．下列有關(guān)PCR的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A．PCR反應(yīng)是一種酶促反應(yīng)
B．PCR反應(yīng)所需要的引物，化學(xué)本質(zhì)為DNA或RNA片段
C．PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需的酶相同
D．PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行
解析：選C PCR反應(yīng)需要DNA聚合酶催化，是一種酶促反應(yīng)，A正確；PCR反應(yīng)所需要的引物，化學(xué)本質(zhì)為單鏈的DNA片段或RNA片段，B正確；PCR反應(yīng)所需要的酶為耐高溫的DNA聚合酶，以適應(yīng)高溫下的反應(yīng)，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需的DNA聚合酶不同，C錯(cuò)誤；為保證pH的穩(wěn)定，PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，D正確。
3．下列關(guān)于基因表達(dá)載體的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是( )
A．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟
B．基因表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因等
C．啟動(dòng)子位于目的基因的上游，能夠啟動(dòng)翻譯
D．不同的目的基因所需的啟動(dòng)子不一定相同
解析：選C 基因表達(dá)載體使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并且遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用，是基因工程的核心步驟，A正確；基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因等，B正確；啟動(dòng)子位于目的基因的上游，是驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA，C錯(cuò)誤；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其啟動(dòng)子也不盡相同，D正確。
4．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以維持穩(wěn)定和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)和鑒定才能知道。下列不屬于目的基因檢測(cè)和鑒定的是( )
A．檢測(cè)受體細(xì)胞是否有目的基因
B．檢測(cè)受體細(xì)胞是否有致病基因
C．檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
D．檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
解析：選B 目的基因的檢測(cè)包括：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，可以用PCR等技術(shù)；檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，也可以用PCR等技術(shù)；檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是進(jìn)行抗原抗體雜交。

eq \a\vs4\al(新知探究一 目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建)
[在探究中學(xué)明]
1．獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步，目前獲取目的基因的常用方法有利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因、通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因等。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)中DNA復(fù)制的過(guò)程和細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程是類似的。請(qǐng)結(jié)合已學(xué)過(guò)的DNA分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制的相關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：
(1)什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？
提示：所謂引物是指兩段與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的一小段DNA或RNA片段。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。
(2)PCR擴(kuò)增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列嗎？
提示：不需要，只要知道目的基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。
(3)PCR過(guò)程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？
提示：PCR過(guò)程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過(guò)程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。
2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。填圖并回答下列問(wèn)題：
(1)完善基因表達(dá)載體構(gòu)成圖
(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要限制酶和DNA連接酶。
(3)目的基因的插入位點(diǎn)是隨意的嗎？為什么？
提示：不是?；虮磉_(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間，若目的基因插入啟動(dòng)子內(nèi)部，啟動(dòng)子將失去原有的功能。
(4)啟動(dòng)子和終止子與起始密碼子和終止密碼子相同嗎？
提示：不相同。啟動(dòng)子和終止子位于DNA上，是基因表達(dá)必需的部分；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。
[在深化中提能]
1．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
(1)PCR反應(yīng)的過(guò)程
PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。在循環(huán)之前，常要進(jìn)行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。
①變性：當(dāng)溫度超過(guò)到90 ℃時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。
②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50 ℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。
③延伸：當(dāng)溫度上升到72 ℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。
(2)PCR反應(yīng)的結(jié)果
從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，耐高溫的DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)式擴(kuò)增。
2．生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的比較
3．構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程
目的基因與載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。其過(guò)程大體為用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。用同一種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子(重組質(zhì)粒)(如圖)。
eq \a\vs4\al([典例]) 如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過(guò)程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅠ、ApaⅠ為四種限制酶。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是( )
A．圖示對(duì)質(zhì)粒和目的基因切割用到了兩種限制酶
B．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來(lái)
C．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要用到限制酶SmaⅠ
D．除圖示組成外，表達(dá)載體中還應(yīng)該含有啟動(dòng)子和終止子等結(jié)構(gòu)
[解析] 為防止酶切后單個(gè)含目的基因的DNA片段及質(zhì)粒自身連接成環(huán)狀，圖示對(duì)質(zhì)粒和目的基因切割用到了兩種限制酶，A正確；抗卡那霉素基因作為標(biāo)記基因，主要作用是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，B正確；限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)位于目的基因上，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)不能用限制酶SmaⅠ，應(yīng)用限制酶PstⅠ、EcRⅠ，C錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體一般包括目的基因(抗原基因)、標(biāo)記基因(抗卡那霉素基因)、啟動(dòng)子和終止子等，D正確。
[答案] C
eq \a\vs4\al([方法規(guī)律])
構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)限制酶的選擇
(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類
①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免含目的基因的外源DNA片段和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcRⅠ兩種限制酶；但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保具有相同的黏性末端。
②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因。

[在應(yīng)用中落實(shí)]
1．在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，下列敘述錯(cuò)誤的是( )
A．基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法不完全相同
B．有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
C．終止子的作用是終止翻譯過(guò)程
D．基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等
解析：選C 因?yàn)槭荏w細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞之分，且目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法是不完全相同的；啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)；終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止，終止密碼子的作用是使翻譯在所需要的地方停止；基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因等。
2．(2020·濟(jì)南期末)PCR是將某一特定DNA片段在體外酶的作用下，復(fù)制出許許多多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異地?cái)U(kuò)增任何要求的目的基因或DNA分子片段。 它的基本過(guò)程如下：
注：圖中“”表示每次擴(kuò)增過(guò)程中需要的引物。每個(gè)引物含20個(gè)脫氧核苷酸，并分別與DNA片段兩端堿基互補(bǔ)，其作用是引導(dǎo)合成DNA子鏈。
請(qǐng)據(jù)圖分析回答下列問(wèn)題：
(1)PCR的原理是模擬生物體內(nèi)__________的過(guò)程。
(2)PCR擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)DNA片段進(jìn)行高溫加熱處理，其目的是________________________，其作用相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)________酶的作用。
(3)在③適溫延伸過(guò)程中，必須加入一種特定的DNA聚合酶，從圖示中可判斷，該酶與一般人體細(xì)胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特點(diǎn)是________。
(4)假如引物都用3H標(biāo)記，從理論上計(jì)算，DNA片段經(jīng)3次擴(kuò)增所得的8個(gè)DNA分子中，含有3H標(biāo)記的DNA分子占________%。
(5)假如DNA片段含200對(duì)脫氧核苷酸，經(jīng)3次擴(kuò)增，從理論上計(jì)算，除需要引物14個(gè)外，還需要游離的脫氧核苷酸________個(gè)。
解析：(1)PCR是指在體外模擬生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程，因此其原理是DNA復(fù)制。(2)PCR擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)DNA片段進(jìn)行高溫加熱處理，其目的是使DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，形成單鏈DNA分子，而在生物體內(nèi)DNA分子解旋形成單鏈?zhǔn)窃诮庑傅淖饔孟峦瓿傻摹?3)在③適溫延伸過(guò)程中，必須加入一種特定的DNA聚合酶，從圖示中可判斷，該酶與一般人體細(xì)胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特點(diǎn)是耐高溫。(4)DNA分子的復(fù)制方式為半保留復(fù)制，如果引物都用3H標(biāo)記，從理論上計(jì)算，所得所有DNA分子中都含有3H標(biāo)記。(5)DNA片段含200對(duì)脫氧核苷酸，經(jīng)3次擴(kuò)增，形成了8個(gè)DNA分子，其中只有兩條DNA單鏈上沒(méi)有引物，因此該過(guò)程中需要的游離脫氧核苷酸數(shù)是200×2×(8－1)－14×20＝2 520(個(gè))。
答案：(1)DNA復(fù)制 (2)使DNA雙鏈解開成為單鏈 解旋 (3)耐高溫 (4)100 (5)2 520
eq \a\vs4\al(新知探究二 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定)
[在探究中學(xué)明]
1．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞是實(shí)施基因工程的第三步。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。結(jié)合圖1、圖2、圖3，根據(jù)教材相關(guān)內(nèi)容完成下列問(wèn)題：
(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等，其中由我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法是花粉管通道法，適用于雙子葉植物和裸子植物的是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用了農(nóng)桿菌的什么特性？
提示：農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的TDNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。
(3)為什么植物基因工程常用的受體細(xì)胞可以是體細(xì)胞，而動(dòng)物基因工程一般只用受精卵？
提示：植物體細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程形成完整植物體，因此受體細(xì)胞可以是體細(xì)胞；動(dòng)物體細(xì)胞的全能性受到嚴(yán)格限制，因此動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般只用受精卵。
(4)從細(xì)胞器的功能上分析，若通過(guò)基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌作受體細(xì)胞嗎？
提示：不可以。因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含有這兩種細(xì)胞器。
2．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以維持穩(wěn)定和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作，也是檢查基因工程是否成功的一步。結(jié)合相關(guān)內(nèi)容，回答下列問(wèn)題：
(1)目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是什么？如何檢測(cè)？
提示：目的基因是否插入受體細(xì)胞的染色體DNA上，這是其能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。可以用DNA分子雜交、PCR等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
(2)檢測(cè)棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達(dá)的最簡(jiǎn)便的方法是什么？
提示：用葉片飼喂棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。如果棉鈴蟲死亡，說(shuō)明抗蟲基因已經(jīng)表達(dá)；否則，抗蟲基因沒(méi)有表達(dá)。
[在深化中提能]
1．目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的過(guò)程
2．目的基因的檢測(cè)與鑒定的方法
eq \a\vs4\al([典例]) 下列關(guān)于目的基因檢測(cè)與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A．可以根據(jù)受體細(xì)胞是否具有某種抗性來(lái)判斷受體細(xì)胞是否獲得了目的基因
B．受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出目的基因控制的特定性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)過(guò)程
C．目的基因檢測(cè)的第一步是檢測(cè)目的基因是否插入到轉(zhuǎn)基因生物的(染色體)DNA上
D．檢測(cè)到受體細(xì)胞含有目的基因就標(biāo)志著基因工程操作成功
[解析] 目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞只是基因工程操作成功的必要一步，基因工程操作成功的標(biāo)志是目的基因在受體細(xì)胞中成功表達(dá)。
[答案] D
[在應(yīng)用中落實(shí)]
1．在將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的相關(guān)操作中，敘述正確的是( )
A．導(dǎo)入植物細(xì)胞時(shí)均采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
B．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得多數(shù)運(yùn)用基因槍法
C．大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí)通常需要使用Ca2＋處理
D．導(dǎo)入目的基因的動(dòng)物受精卵在培養(yǎng)液中發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
解析：選C 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；顯微注射法是將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞中最為有效的方法；大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí)通常需要使用Ca2＋處理，使其成為感受態(tài)細(xì)胞；導(dǎo)入目的基因的動(dòng)物受精卵在培養(yǎng)液中發(fā)育成早期胚胎，再經(jīng)胚胎移植進(jìn)入母體子宮內(nèi)，其在母體子宮內(nèi)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
2．(2020·濟(jì)寧期末)2019年6月17日，新華社發(fā)布《屠呦呦團(tuán)隊(duì)放“大招”：“青蒿素抗藥性”等研究獲新突破》，屠呦呦團(tuán)隊(duì)近期提出應(yīng)對(duì)“青蒿素抗藥性”難題的切實(shí)可行治療方案，并在“青蒿素治療紅斑狼瘡等適應(yīng)癥”方面取得新進(jìn)展。某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，讓青蒿素合成過(guò)程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過(guò)量表達(dá)，其過(guò)程圖如下：
結(jié)合圖示回答下列問(wèn)題：
(1)酶1是________。利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解旋為單鏈的條件是加熱至90～95 ℃，目的是破壞DNA分子中的________鍵。
(2)在構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒的過(guò)程中，需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的________中。
(3)檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠裾系角噍锘蚪M中，可以將放射性同位素標(biāo)記的________________________做成分子探針與青蒿基因組DNA雜交。理論上，與野生型相比，該探針與轉(zhuǎn)基因青蒿DNA形成的雜交帶的量________(填“較多”或“較少”)。
(4)判斷該課題組的研究目的是否達(dá)到，必須檢測(cè)轉(zhuǎn)基因青蒿植株中的____________。
解析：(1)據(jù)圖示可知，酶1催化逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，故為逆轉(zhuǎn)錄酶；利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解旋為單鏈的條件是加熱超過(guò)90℃，目的是破壞DNA分子中的氫鍵，使DNA解旋為單鏈。(2)在構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒的過(guò)程中，需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA中，以使目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的染色體DNA上。(3)檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠裾系角噍锘蚪M中，可用DNA分子雜交法，即將fps基因、fps基因的mRNA做成分子探針與青蒿基因組DNA雜交。由于青蒿素產(chǎn)量增高，故與野生型相比，該探針與轉(zhuǎn)基因青蒿DNA形成的雜交帶的量較多。(4)判斷該課題組的研究目的是否達(dá)到，必須檢測(cè)轉(zhuǎn)基因青蒿植株中的青蒿素產(chǎn)量，若產(chǎn)量增高，則說(shuō)明達(dá)到了目的。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶 氫 (2)TDNA (3)fps基因、fps基因的mRNA 較多 (4)青蒿素產(chǎn)量
eq \a\vs4\al(新知探究三 DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定)
[在探究中學(xué)明]
1．實(shí)驗(yàn)原理
(1)PCR反應(yīng)的原理
PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合， PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)控制溫度的儀器。
(2)電泳鑒定的原理
①DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。
②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。
③凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300_nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。
2．實(shí)驗(yàn)操作
[在深化中提能]
1．PCR過(guò)程中用到的重要儀器
(1)PCR儀：該儀器能自動(dòng)調(diào)控溫度，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒(méi)有PCR儀，可用3個(gè)恒溫水浴鍋代替，操作時(shí)按程序在3個(gè)水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。
(2)微量離心管：總?cè)莘e為0.5 mL，實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所。
(3)微量移液器：用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體。
2．DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的注意事項(xiàng)
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。
(2)緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
(4)在進(jìn)行操作時(shí)，一定戴好一次性手套。
eq \a\vs4\al([例1]) 下列關(guān)于PCR操作過(guò)程的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌
B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲(chǔ)存
C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
[解析] 在冰箱中放置的緩沖液和酶，取出后應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速融化。
[答案] C
eq \a\vs4\al([例2]) (2020·揚(yáng)州一模)二倍體新疆野生油菜(P1)具有低芥酸、抗病蟲等特性，為了改良二倍體甘藍(lán)型油菜(P2)，研究人員將兩種植物的體細(xì)胞進(jìn)行融合獲得了屬間雜種F1，然后加入1對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是( )
A．雜種F1的形成依賴細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞的全能性
B．雜種F1含4個(gè)染色體組
C．引物能與DNA上多個(gè)不同位點(diǎn)結(jié)合
D．電泳結(jié)果表明F11具有P1、P2的全部遺傳信息
[解析] 植物體細(xì)胞的融合依賴細(xì)胞膜的流動(dòng)性，形成新的植株依賴細(xì)胞的全能性，A正確；雜種F1為二倍體與二倍體的體細(xì)胞雜交體，因此F1含4個(gè)染色體組，B正確；從圖中的電泳結(jié)果可以看出，電泳結(jié)果圖上出現(xiàn)了多種DNA片段，這表明引物能與DNA上多個(gè)不同位點(diǎn)結(jié)合，C正確；從電泳圖結(jié)果能夠看到F11只具有P1、P2的部分遺傳信息，D錯(cuò)誤。
[答案] D
[在應(yīng)用中落實(shí)]
1．獲取目的基因的方法有多種，其中利用PCR可特異性地?cái)U(kuò)增目的基因，以下對(duì)PCR操作過(guò)程的敘述，正確的是( )
A．PCR擴(kuò)增DNA時(shí)必須使用解旋酶和Taq DNA聚合酶
B．PCR過(guò)程中引物的作用是保證新鏈的合成方向?yàn)?′端→5′端
C．在95 ℃、55 ℃和72 ℃的溫度下，Taq DNA聚合酶都有活性
D．高壓滅菌的微量移液器槍頭每吸取一種試劑后不需要更換
解析：選C PCR中通過(guò)高溫解旋，因此不需要解旋酶；新鏈合成的方向是5′端→3′端；Taq DNA聚合酶耐高溫，所以在上述三個(gè)溫度下該酶均有活性；微量移液器槍頭每吸取一種試劑后都需要更換。
2．用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜。其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號(hào)為蒸餾水，PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是( )
A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500 bp之間
B．3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNA
C．9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株
D．10號(hào)確定反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果沒(méi)有干擾
解析：選B PCR過(guò)程中，可以通過(guò)設(shè)計(jì)特定的引物來(lái)擴(kuò)增特定的DNA片段。4～9號(hào)是轉(zhuǎn)基因植株，理論上都應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號(hào)野生型和10號(hào)蒸餾水組的結(jié)果，推測(cè)包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500 bp，A正確；3號(hào)PCR結(jié)果包含250～500 bp片段，應(yīng)包含目的基因，B錯(cuò)誤；9號(hào)PCR結(jié)果不包含250～500 bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C正確；10號(hào)為蒸餾水，可排除反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果的干擾，D正確。
[課堂鞏固落實(shí)]
1．下列對(duì)基因工程的敘述，正確的是( )
A．基因工程必須使用的工具酶是限制酶、DNA連接酶和RNA聚合酶
B．基因工程的核心步驟是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
C．載體上的標(biāo)記基因可用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞
D．目的基因是否表達(dá)可通過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)
解析：選C 基因工程使用的工具酶是限制酶和DNA連接酶，其核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建；標(biāo)記基因的作用是鑒別和篩選含目的基因的細(xì)胞；目的基因是否表達(dá)可通過(guò)PCR和抗原抗體雜交來(lái)檢測(cè)，因?yàn)榛虮磉_(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過(guò)程。
2．下列有關(guān)PCR的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A．變性過(guò)程破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵
B．引物的設(shè)計(jì)要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C．延伸過(guò)程中需要耐高溫的DNA聚合酶和四種核糖核苷酸等
D．利用DNA雙鏈復(fù)制的原理
解析：選C 變性過(guò)程破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，A正確；引物的設(shè)計(jì)要有一段已知目的基因的核苷酸序列，B正確；延伸過(guò)程中需要耐高溫的DNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸等，C錯(cuò)誤；PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制，D正確。
3．如圖為科學(xué)家利用耐鹽堿植物中的耐鹽基因培育耐鹽水稻新品系的過(guò)程。下列相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是( )
A．階段Ⅰ、Ⅱ應(yīng)用的技術(shù)分別是重組DNA技術(shù)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)
B．對(duì)耐鹽基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)可采用抗原抗體雜交技術(shù)
C．可用抗生素抗性基因作為探針來(lái)檢測(cè)受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因
D．可用PCR檢測(cè)受體細(xì)胞中的耐鹽基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
解析：選C 階段Ⅰ將目的基因?qū)胨炯?xì)胞需要采用重組DNA技術(shù)，階段Ⅱ?qū)⑺炯?xì)胞培養(yǎng)成完整植株需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，A正確；耐鹽基因表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，可用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè)，B正確；可以用含有耐鹽基因的DNA探針檢測(cè)細(xì)胞中是否插入了目的基因，而不能用抗生素抗性基因作為探針來(lái)檢測(cè)目的基因，C錯(cuò)誤；可用PCR檢測(cè)受體細(xì)胞中的耐鹽基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，D正確。
4．(2019·全國(guó)卷Ⅰ，節(jié)選)基因工程中可以通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝袉?wèn)題。
(1)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是________________。上述兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(2)目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶)而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，通過(guò)解旋酶解開DNA雙鏈。在體外利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過(guò)高溫(超過(guò)90 ℃)使反應(yīng)體系中的模板DNA解聚為單鏈。上述兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了雙鏈DNA分子中的氫鍵。(2)大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會(huì)失活，而PCR反應(yīng)體系中加入的聚合酶需耐高溫，故在PCR反應(yīng)中要用能耐高溫的Taq酶。
答案：(1)解旋酶 加熱超過(guò)90 ℃ 氫鍵 (2)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活
學(xué)有目標(biāo)——新課程標(biāo)準(zhǔn)必明
記在平時(shí)——核心語(yǔ)句必背
1.闡明基因工程的基本操作程序主要包括哪些步驟。
2．闡述基因工程每個(gè)操作步驟涉及的技術(shù)和方法。
3．利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定。
1.PCR每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性和延伸三步。
2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。
3．目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用花粉管通道法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法(Ca2＋處理法)。
4．檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA常用PCR等技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)常用抗原抗體雜交技術(shù)。
比較項(xiàng)目
體內(nèi)DNA復(fù)制
PCR反應(yīng)
解旋
在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分DNA雙鏈解開
90 ℃以上高溫下解旋，DNA雙鏈全部解開，不需要解旋酶
酶
解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶
耐高溫的DNA聚合酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈
在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成；另一條鏈不連續(xù)合成，再由DNA連接酶連接
分別從兩條鏈的引物的3′端開始延伸，都是連續(xù)合成
過(guò)程
循環(huán)次數(shù)
受生物體自身控制
30多次
產(chǎn)物
完整DNA
兩個(gè)引物之間的DNA片段
相同點(diǎn)
都需要DNA模板、4種脫氧核苷酸、分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；都是半保留復(fù)制，嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
項(xiàng)目
植物
動(dòng)物
微生物
常用方法
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
顯微注射技術(shù)
感受態(tài)細(xì)胞法
受體細(xì)胞
體細(xì)胞或受精卵
受精卵
原核細(xì)胞
轉(zhuǎn)化過(guò)程
將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上→表達(dá)
將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物
Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子
類型
檢測(cè)內(nèi)容
方法
結(jié)果顯示
分子水平檢測(cè)
目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA上
DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間)或PCR等
是否成功
顯示出雜交帶
目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
核酸分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)或PCR等
目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
抗原抗體雜交(蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間)
個(gè)體生物
學(xué)水平
鑒定
是否具有抗性及抗性程度
對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗性的接種實(shí)驗(yàn)
是否賦予了
預(yù)期抗性或
蛋白質(zhì)活性
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比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性

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第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

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