考點(diǎn)1????重組DNA技術(shù)的基本工具
知識(shí)拓展????基因工程中的同尾酶同尾酶是指識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶, 如圖:?由同尾酶產(chǎn)生的黏性末端,能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)彼此連接,可用于基因表達(dá)載體的 構(gòu)建。
易混易錯(cuò)????DNA連接酶和DNA聚合酶的異同
考點(diǎn)2　基因工程的基本操作程序及應(yīng)用
一、DNA的粗提取、PCR、電泳鑒定1.DNA的粗提取及鑒定
2.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))
小表達(dá)????(選必3 P77 改編)PCR技術(shù)操作中為什么需要用2種不同的引物?　　　　???? 　　　　　　　　　　　　　　　 　　　????。
DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈構(gòu)成,PCR擴(kuò)增時(shí)只能從各自模板鏈的3'端開始,故需堿基序列不同的2種引物
二、基因工程的基本操作程序及應(yīng)用1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(基因工程的核心步驟)
易混易錯(cuò)????啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比
知識(shí)拓展????(1)標(biāo)記基因的常見類型及相應(yīng)篩選方法
(2)對(duì)空質(zhì)粒的篩選——藍(lán)白斑篩選法:載體上攜帶有抗生素抗性基因及l(fā)acZ基因。 lacZ基因表達(dá)產(chǎn)物可分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì),使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色,否則菌落為白色。該 載體上僅在lacZ基因中存在目的基因插入位點(diǎn),若目的基因插入lacZ基因,則lacZ基因 失去相應(yīng)功能。在大腸桿菌的培養(yǎng)基中加入相應(yīng)抗生素和X-gal后,未導(dǎo)入質(zhì)粒的菌 株不能生長,白色的菌落便是成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌,呈現(xiàn)藍(lán)色的菌落則是轉(zhuǎn) 入空質(zhì)粒的大腸桿菌。
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
知識(shí)拓展????農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖?(1)兩次重組①第一次重組:目的基因(①)與Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體。②第二次重組:重組Ti質(zhì)粒上的T-DNA插入染色體DNA。(2)兩次導(dǎo)入①第一次導(dǎo)入:將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入經(jīng)Ca2+處理的農(nóng)桿菌細(xì)胞。②第二次導(dǎo)入:將T-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞染色體DNA上。
4.目的基因的檢測(cè)與鑒定
小表達(dá)????蛋白質(zhì)工程中為什么通過對(duì)基因操作來實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造?　　　???? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　????　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　????。
蛋白質(zhì)一般具有十分復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單,容易改造;改造后的基因可以遺傳給下一代,而直接改造的蛋白質(zhì)無法遺傳
題型　核酸序列的閱讀及引物、限制酶的選擇(熱考點(diǎn))1.核酸序列的閱讀
(2023湖南,19,12分)(2023山東,25,10分)(2023江蘇,22,12分)(2022重慶,24,14分)
(2020北京,12,2分)(2023重慶,12,3分)(2023浙江6月選考,19,2分)(2023山東,25,10分)(20 22天津,15,10分)
3.限制酶的選擇(1)限制酶選擇的原則:①限制酶不能破壞目的基因的完整結(jié)構(gòu),也不能破壞載體上的啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制 原點(diǎn)等必要元件;②應(yīng)使目的基因按照正確的轉(zhuǎn)錄方向插入載體的啟動(dòng)子和終止子之間;③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接,盡量選用不同的限制酶切割目的基 因和質(zhì)粒,即雙酶切。
(2)實(shí)例分析:圖1質(zhì)粒為載體,圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙鏈為 轉(zhuǎn)錄模板鏈(MfeⅠ和EcRⅠ為同尾酶,可切出相同的黏性末端)。
限制酶選擇分析:圖1質(zhì)粒中含2個(gè)EcRⅠ識(shí)別位點(diǎn),選用EcRⅠ會(huì)切去終止子,選用 BamHⅠ會(huì)破壞啟動(dòng)子,故可選用的限制酶有MfeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ;W基因以乙鏈為 轉(zhuǎn)錄模板鏈,RNA聚合酶從模板鏈的3'端開始轉(zhuǎn)錄,故W基因乙鏈的3'端與啟動(dòng)子相連, 5'端與終止子相連,為保證W基因與質(zhì)粒正確連接,質(zhì)粒的終止子一側(cè)應(yīng)選用與W基因 右側(cè)相同的HindⅢ,故切割質(zhì)粒可選的限制酶為MfeⅠ、HindⅢ。圖2中選用MfeⅠ會(huì) 破壞W基因,故只能選擇同尾酶EcRⅠ,因此選用EcRⅠ、HindⅢ切割圖2中的 DNA。(2020北京,17,12分)(2023新課標(biāo),6,6分)
典例1????(2024朝陽一模,14)為了構(gòu)建可以直接利用纖維素發(fā)酵的釀酒酵母工程菌,研 究人員構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖所示),并導(dǎo)入不能合成尿嘧啶的酵母菌。下列相關(guān)分析不正確的是?(　????)A.尿嘧啶合成基因可以作為表達(dá)載體上的 標(biāo)記基因B.該方法需利用限制酶和DNA連接酶實(shí)現(xiàn) 目的基因與載體的連接C.擴(kuò)增目的基因時(shí)應(yīng)在引物的5'端添加與 線性化載體兩端相同的DNA序列D.在以纖維素為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中檢測(cè)酒精含量確定工程菌發(fā)酵效果
? 解析????依據(jù)表達(dá)載體導(dǎo)入不能合成尿嘧啶的酵母菌,可知尿嘧啶合成基因可作為表達(dá)載體上的標(biāo)記基因,若導(dǎo)入表達(dá)載體后酵母菌能產(chǎn)生尿嘧啶,說明導(dǎo)入成功,A正確; 該方法利用載體和目的基因兩側(cè)的同源序列進(jìn)行重組進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連 接,該方法需要使用DNA連接酶,不需要使用限制酶,B錯(cuò)誤;PCR擴(kuò)增時(shí),子鏈的延伸方 向?yàn)?'→3',引物的5'端可被修飾,故擴(kuò)增目的基因時(shí)應(yīng)在引物的5'端添加與線性化載體 兩端相同的DNA序列,以便后續(xù)目的基因與載體的連接,C正確;在以纖維素為唯一碳 源的液體培養(yǎng)基中檢測(cè)酒精含量,若能利用纖維素發(fā)酵且酒精含量高,則證明工程菌 構(gòu)建成功且發(fā)酵效果好,D正確。
典例2????(2022天津,15,10分)研究者擬構(gòu)建高效篩選系統(tǒng),將改進(jìn)的苯丙氨酸合成關(guān)鍵 酶基因P1導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌,以提高苯丙氨酸產(chǎn)量。?(1)如圖是該高效篩選系統(tǒng)載體的構(gòu)建過程。載體1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)
和SacB兩個(gè)標(biāo)記基因, 為去除篩選效率較低的SacB,應(yīng)選擇引物　　????和　　 ????,并在引物的　　　????(5'/3')端引入XhⅠ酶識(shí)別序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接后環(huán)化成載體2。(2)PCR擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因RpsL(鏈霉素敏感基因)時(shí),引物應(yīng)包含 　　　????(EcRⅠ/Hind Ⅲ/XhⅠ)酶識(shí)別序列,產(chǎn)物經(jīng)單酶切后連接到載體2構(gòu)建高效 篩選載體4。(3)將改進(jìn)的P1基因整合到載體4構(gòu)建載體5。將載體5導(dǎo)入鏈霉素不敏感(由RpsL突變 造成)、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株,應(yīng)采用含有　　　???? 的平板進(jìn)行初步篩選。
(4)用一定的方法篩選出如下菌株:P1基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA,且載 體5上其他DNA片段全部丟失。該菌的表型為　　　????。A.卡那霉素不敏感、鏈霉素敏感B.卡那霉素敏感、鏈霉素不敏感C.卡那霉素和鏈霉素都敏感D.卡那霉素和鏈霉素都不敏感(5)可采用　　　????技術(shù)鑒定成功整合P1基因的菌株。之后以發(fā)酵法檢測(cè)苯丙氨酸產(chǎn)量。
PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),答案合理即可)
? 解析????(1)結(jié)合題圖中載體1分析,要去除SacB區(qū)域,應(yīng)擴(kuò)增SacB區(qū)域外的DNA片段,所選擇的兩種引物應(yīng)方向相反,且位于擴(kuò)增部位兩端,故應(yīng)選引物1和4。由于PCR擴(kuò)增時(shí),子鏈從引物的3'端開始延伸,因此應(yīng)在引物的5'端引入合適的限制酶識(shí)別序列。(2)根據(jù)題圖中構(gòu)建載體4的過程可知,從載體3擴(kuò)增出的RpsL片段插入了載體2中含有的XhⅠ位點(diǎn),故以載體3為模板擴(kuò)增RpsL時(shí)所需引物應(yīng)包含XhⅠ酶識(shí)別序列。(3)因受 體菌的表型為鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感,載體5上具有RpsL(鏈霉素敏感基因)和 KanR(卡那霉素抗性基因),故成功導(dǎo)入載體5的菌株鏈霉素不敏感、卡那霉素不敏感, 所以,為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株,應(yīng)利用含有卡那霉素的平板進(jìn)行初步篩選,選擇平 板上出現(xiàn)的單菌落即可。(4)P1基因整合到受體菌擬核DNA上,且載體5上其他DNA片

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