1.基因工程的誕生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技術(shù)(含PCR技術(shù)Ⅱ)。3.基因工程的應(yīng)用(Ⅱ)。4.蛋白質(zhì)工程(Ⅰ)。5.實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定。
考點(diǎn)一　基因工程的操作工具及程序
1．限制酶和DNA連接酶的關(guān)系 (1)限制酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。(3)限制酶是一類酶，而不是一種酶。(4)DNA連接酶起作用時(shí)，不需要模板。
2. 與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
3. 基本操作程序(1)獲取目的基因①直接分離
從基因組文庫(kù)中獲取：即用限制酶進(jìn)行切割、分離
從cDNA文庫(kù)中獲?。杭蠢胢RNA反轉(zhuǎn)錄形成
利用PCR擴(kuò)增技術(shù)：獲取大量目的基因
②人工化學(xué)合成：適用于分子較小的基因
(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
啟動(dòng)子：為RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA
終止子：使轉(zhuǎn)錄終止的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA段片段
標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因
(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
(4)目的基因的檢測(cè)與鑒定
1. 獲取目的基因和切割載體時(shí)不能選用識(shí)別兩種序列的限制酶，否則產(chǎn)生的堿基末端不相同。2. 當(dāng)限制酶剪切目的基因一次時(shí)，獲得的黏性末端或平末端有2個(gè)，而不是1個(gè)，若剪切目的基因兩次，共產(chǎn)生4個(gè)黏性末端或平末端。3. 限制酶切割載體的切割位點(diǎn)并不是任意的，必須保證至少有1個(gè)標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測(cè)。
限制酶的使用及作用特點(diǎn)的三點(diǎn)提醒
1. 位置要求：限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須在標(biāo)記基因外，進(jìn)而保證標(biāo)記基因的完整性。2. 數(shù)量要求：選擇限制酶切割目的基因時(shí)，被選擇的限制酶在目的基因的兩側(cè)都要有識(shí)別序列，這樣切割出來(lái)的目的基因才能與質(zhì)粒結(jié)合。
對(duì)限制酶切割位點(diǎn)的兩點(diǎn)要求
1. 基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了目的基因。2. 目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位，若目的基因插入到啟動(dòng)子內(nèi)部，啟動(dòng)子將失去原功能。 3. 啟動(dòng)子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子：?jiǎn)?dòng)子和終止子位于DNA片段上，分別控制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的啟動(dòng)和終止；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯的啟動(dòng)和終止。
基因工程操作程序易錯(cuò)點(diǎn)剖析
4. 切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶。如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時(shí)，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來(lái)。5. 基因工程操作過(guò)程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)不涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象：第一步存在反轉(zhuǎn)錄法獲得DNA，第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象，第四步存在檢測(cè)分子水平雜交。
【典例1】（2012·浙江高考）天然的玫瑰沒(méi)有藍(lán)色花，這是由于缺少控制藍(lán)色色素合成的基因B，而開(kāi)藍(lán)色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B?，F(xiàn)用基因工程技術(shù)培育藍(lán)玫瑰，下列操作正確的是( )A. 提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA，再擴(kuò)增基因BB. 利用限制性核酸內(nèi)切酶從開(kāi)藍(lán)色花矮牽牛的基因文庫(kù)中獲取基因BC. 利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞D. 將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌，然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞
【解析】選A。欲獲得目的基因B，可先獲取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA，然后再經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增；基因文庫(kù)構(gòu)建時(shí)是將包括目的基因在內(nèi)的各種基因與載體連接起來(lái)，形成重組載體，再導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存和擴(kuò)增，提取目的基因時(shí)不需使用限制性核酸內(nèi)切酶；DNA聚合酶用于DNA復(fù)制，不能用于目的基因B與質(zhì)粒的連接；基因B與質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒后，才能導(dǎo)入大腸桿菌，但大腸桿菌不能侵染玫瑰細(xì)胞。
【典例2】. (2011·浙江高考)將ada(腺苷酸脫氨酶基因)通過(guò)質(zhì)粒pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯(cuò)誤的是( )A. 每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞至少含一個(gè)重組質(zhì)粒B. 每個(gè)重組質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)C. 每個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少插入一個(gè)adaD. 每個(gè)插入的ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子
【解析】選C。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中并成功表達(dá)，說(shuō)明大腸桿菌內(nèi)至少含有一個(gè)重組質(zhì)粒；每個(gè)重組質(zhì)粒都含有目的基因ada，則該重組質(zhì)粒至少含一個(gè)能被該限制性核酸內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)；限制性核酸內(nèi)切酶具有特異性，種類不同，識(shí)別的位點(diǎn)不同，切割出的粘性末端也就不同，因此并不是每個(gè)位點(diǎn)都能插入ada；根據(jù)題干信息，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌成功表達(dá)出腺苷酸脫氨酶，說(shuō)明插入的ada至少表達(dá)出一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子。
【典例3】(2010·浙江高考)在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過(guò)程中，下列操作錯(cuò)誤的是( )A. 用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸B. 用DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因和載體C. 將重組DNA分子導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體D. 用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞
【解析】選Ａ。構(gòu)建重組DNA分子時(shí)，需用同種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和載體，再用DNA連接酶連接形成重組DNA分子，而煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，所以A項(xiàng)錯(cuò)誤。重組DNA分子形成后要導(dǎo)入受體細(xì)胞(若是植物細(xì)胞，則可導(dǎo)入其原生質(zhì)體)，若導(dǎo)入的受體細(xì)胞是體細(xì)胞，經(jīng)組織培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)基因植物。目的基因?yàn)榭钩輨┗颍晕闯晒?dǎo)入目的基因的細(xì)胞不具有抗除草劑的能力，可用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞。
考點(diǎn)二　基因工程的應(yīng)用成果
1. 乳腺生物反應(yīng)器。(1)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高、質(zhì)量好、成本低、易提取等。(2)操作過(guò)程：獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵中→形成早期胚胎→將胚胎移植到母體動(dòng)物子宮內(nèi)→發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物→在雌性個(gè)體中目的基因表達(dá)，從分泌的乳汁中提取所需蛋白質(zhì)。
2. 基因工程藥品。(1)生產(chǎn)方式：利用基因工程培育“工程菌”來(lái)生產(chǎn)藥品。a.“工程菌”：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達(dá)的菌類細(xì)胞株系，如含有人胰島素基因的大腸桿菌菌株、含有抗蟲(chóng)基因的土壤農(nóng)桿菌菌株等。b.用基因工程生產(chǎn)的藥品，從化學(xué)成分上分析都應(yīng)該是蛋白質(zhì)類。(2)成果：生產(chǎn)出細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素等。
3. 基因診斷。(1)方法：DNA分子雜交技術(shù)(即DNA探針?lè)?。(2)主要過(guò)程： 將互補(bǔ)的雙鏈DNA解旋　 ↓　 獲得單鏈DNA片段　 ↓ 用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑標(biāo)記單鏈DNA片段　 ↓ 引入待檢測(cè)的DNA樣品中　 ↓ 　 檢測(cè)DNA樣品
4. 基因治療(1)方法：基因置換、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)、基因失活等。(2)途徑。a.體外基因治療：先從病人體內(nèi)獲得某種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后在體外完成轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)，如腺苷酸脫氨酶基因的轉(zhuǎn)移。b.體內(nèi)基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的方法。
1. 并非所有個(gè)體都可作為乳腺生物反應(yīng)器操作成功的應(yīng)該是雌性個(gè)體，個(gè)體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應(yīng)該考慮的因素。2. 基因治療后，缺陷基因沒(méi)有改變基因治療是把正?；?qū)胧荏w細(xì)胞中，以表達(dá)正常產(chǎn)物從而治療疾病，對(duì)原來(lái)細(xì)胞中存在缺陷的基因沒(méi)有清除或改變。
3．五種DNA相關(guān)酶的比較
4.蛋白質(zhì)工程與基因工程：
【典例1】. （2010·江蘇高考）下表中列出了幾種限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
（1）一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有_______個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。（2）若對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越_______。（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________________________。（4）與只使用EcRⅠ相比較，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止____________________________________________。
（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入________酶。（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了_____________________________________________________________。（7）為了從cDNA文庫(kù)中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在______的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測(cè)。
【解析】（1）質(zhì)粒切割前是雙鏈環(huán)狀DNA分子，所有磷酸基團(tuán)參與形成磷酸二酯鍵，故不含游離的磷酸基團(tuán)。從圖1可以看出，質(zhì)粒上只含有一個(gè)SmaⅠ的切點(diǎn)，因此被該酶切割后，質(zhì)粒變?yōu)榫€性雙鏈DNA分子，因每條鏈上含有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，因此切割后含有兩個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。（2）由題目可知，SmaⅠ識(shí)別的DNA序列只有G和C，而G和C之間可以形成三個(gè)氫鍵，A和T之間可以形成二個(gè)氫鍵，所以SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性就越高。
（3）質(zhì)粒抗生素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，標(biāo)記基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位點(diǎn)，都可以被SmaⅠ破壞，故不能使用該酶剪切質(zhì)粒及含有目的基因的DNA。（4）只使用EcRⅠ，則質(zhì)粒和目的基因兩端的粘性末端相同，用連接酶連接時(shí)，會(huì)產(chǎn)生質(zhì)粒和目的基因自身連接物，而利用BamHⅠ和Hind Ⅲ剪切時(shí)，質(zhì)粒和目的基因兩端的粘性末端不同，用DNA連接酶連接時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生自身連接產(chǎn)物。
（5）質(zhì)粒和目的基因連接后獲得重組質(zhì)粒，該過(guò)程需要DNA連接酶作用，故混合后加入DNA連接酶。（6）質(zhì)粒上的抗生素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，用于鑒別和篩選含有重組質(zhì)粒（或目的基因）的受體細(xì)胞。（7）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體后，含有重組質(zhì)粒的個(gè)體才能吸收蔗糖，因此可利用蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體細(xì)胞，含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞才能存活，不含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞因不能獲得碳源而死亡，從而達(dá)到篩選目的。
答案：（1）0、2 （2）高（3）SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化（5）DNA連接（6）鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞（7）蔗糖為唯一含碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
考點(diǎn)三　DNA的粗提取與鑒定
1．實(shí)驗(yàn)原理(1)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，其中在物質(zhì)的量濃度為0.14 ml/L時(shí)最低。(2)DNA不溶于酒精，但是細(xì)胞中的一些有機(jī)物如蛋白質(zhì)可溶于酒精。(3)DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)與之反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。
3．注意事項(xiàng)(1)做該實(shí)驗(yàn)時(shí)，不能用豬血代替雞血，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核，不能提取DNA。(2)制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要注意向雞血中加檸檬酸鈉，防止血液凝固。(3)漲破細(xì)胞的方法：向血細(xì)胞中加入蒸餾水，血細(xì)胞溶液的濃度大于蒸餾水的濃度，從而使血細(xì)胞大量吸水而漲破。(4)兩次加入蒸餾水，第一次是為了使血細(xì)胞吸水漲破；第二次是為了降低氯化鈉的濃度，有利于DNA的析出。
(5)兩次析出DNA的方法：第一次是加入蒸餾水，降低氯化鈉溶液的濃度，促使DNA析出；第二次是加入冷卻的酒精，因?yàn)镈NA不溶于酒精溶液。(6)鑒定DNA時(shí)要用兩支試管，其中不加DNA的試管起對(duì)照作用，該試管溶液不變色，另一支加有DNA的試管溶液變藍(lán)色。
某生物興趣小組開(kāi)展DNA粗提取的相關(guān)探究活動(dòng)，具體步驟如下：材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g。剪碎后分成兩組，一組置于20℃、另一組置于－20℃條件下保存24 h。DNA粗提取：第一步：將上述材料分別放入研缽中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過(guò)濾，取濾液備用。第二步：先向6只小燒杯中分別注入10 mL濾液，再加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個(gè)方向攪拌，使絮狀物纏繞在玻璃棒上。
第三步：取6支試管，分別加入等量的2 ml/L NaCl溶液溶解上述絮狀物。DNA檢測(cè)：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑，混合均勻后，置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如下表。 (注：“＋”越多表示藍(lán)色越深)
分析上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，回答下列問(wèn)題：(1)該探究性實(shí)驗(yàn)的課題名稱是__________________________________。(2)第二步中“緩緩地”攪拌，這是為了減少___________。(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出結(jié)論并分析。①結(jié)論1：與20℃相比，相同實(shí)驗(yàn)材料在－20℃條件下保存，DNA的提取量較多。結(jié)論2：________________________________________________ ____________________。②針對(duì)結(jié)論1，請(qǐng)?zhí)岢龊侠淼慕忉專篲________________________ ____________________。
探究不同材料和不同保存溫度
等質(zhì)量的不同實(shí)驗(yàn)材料，在相同的保存溫度下，從蒜
黃提取的DNA量最多
低溫抑制了相關(guān)酶的活性，

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