高考生物（山東專用）復(fù)習(xí)專題22基因工程教學(xué)課件-課件下載-教習(xí)網(wǎng)

考點(diǎn)1　重組DNA技術(shù)的基本工具一、限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
同尾酶:識(shí)別位點(diǎn)不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列,在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),使切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大。同尾酶切割后的連接如圖所示:?
小表達(dá)????限制酶不切割細(xì)菌本身DNA分子的原因可能是?? ??? ???。答案:細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自身的限制酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行了修飾(如DNA甲基化)
小表達(dá)????DNA連接酶與DNA聚合酶的作用有何不同:? ???。答案:DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,只能催化單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羥基上,形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶不需要模板,催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
易混易錯(cuò)????天然的質(zhì)粒一般不完全具備上述條件,往往需要進(jìn)行人工改造后才能用作基因工程載體。
考點(diǎn)2　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定一、DNA的粗提取與鑒定
二、DNA片段的擴(kuò)增——PCR擴(kuò)增
小表達(dá)????1.利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí),需用兩種不同引物的原因是? ???。2.PCR　　　????(填“可以”或“不可以”)擴(kuò)增mRNA,原因是?? ?。1.答案:每個(gè)DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈構(gòu)成,PCR擴(kuò)增時(shí)只能從各自模板鏈的3'端開(kāi)始,故需堿基序列不同的兩種引物2.答案:不可以　PCR是以DNA雙鏈為模板,不能直接用單鏈RNA進(jìn)行PCR,必須把 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA后才能進(jìn)行PCR
三、DNA片段的電泳鑒定1.原理(1)瓊脂糖凝膠電泳利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)(分子本身的大小和構(gòu)象),達(dá)到分離混合物的目的。(2)凝膠中的DNA分子通過(guò)染色,可以在波長(zhǎng)為300 nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。2.過(guò)程
3.注意事項(xiàng)(1)電泳時(shí),電泳緩沖液以沒(méi)過(guò)凝膠1 mm為宜。(2)PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌
處理。(3)實(shí)驗(yàn)用到的酶、引物、模板DNA、4種脫氧核苷酸的混合液、擴(kuò)增緩沖液等均需分裝成小份,并在-20 ℃儲(chǔ)存。使用前,將所需試劑從冰箱拿出后放在冰塊或PCR冷凍冰盒上緩慢融化。
小表達(dá)????DNA的電泳鑒定實(shí)驗(yàn)中,影響DNA分子遷移速率的主要因素是? ???。答案:分子本身的大小和構(gòu)象,DNA分子的遷移速率與其大小成反比
考點(diǎn)3　基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取
二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心
易混易錯(cuò)????啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子的區(qū)分
知識(shí)拓展(1)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指能被誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。常見(jiàn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有Lac乳糖操縱子。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。(2)根據(jù)基因表達(dá)載體上的標(biāo)記基因可篩選出已成功轉(zhuǎn)入基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞和未成功轉(zhuǎn)入基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞。(3)空載體和重組載體的分子大小有區(qū)別,可用限制酶酶切產(chǎn)物電泳的方法來(lái)鑒定[例如,2021遼寧,24(4)]。
小表達(dá)????構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),常使用兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒,該過(guò)程不使用同一種限制酶的原因是??? ? ????。
答案:防止目的基因自身環(huán)化和質(zhì)粒自身環(huán)化,保證目的基因與質(zhì)粒正確連接,因?yàn)橥? 種限制酶酶切產(chǎn)生的末端相同,會(huì)產(chǎn)生正連和反連的情況,增大篩選正確重組載體的工作量, 正連和反連圖示如下:
三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
小表達(dá)????農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中重組與導(dǎo)入的次數(shù)分別是幾次,請(qǐng)簡(jiǎn)述重組與導(dǎo)入的內(nèi)容:? ???。答案:重組和導(dǎo)入的次數(shù)都是兩次,第一次重組是將目的基因重組到Ti質(zhì)粒的T-DNA 上,第二次重組是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上;第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌,第二次導(dǎo)入是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞
四、目的基因的檢測(cè)與鑒定?
考點(diǎn)4　基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程一、基因工程的應(yīng)用?
小表達(dá)????利用乳腺生物反應(yīng)器,構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要將　　　　　　????等調(diào)控元件重組在一起,原因是?? ??????。答案:藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子　只有連接了乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子,才能保證相應(yīng)的目的基因在雌性動(dòng)物泌乳期時(shí)在乳腺細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)
二、蛋白質(zhì)工程1.概念
1.DNA的粗提取與鑒定
深挖教材(1)實(shí)驗(yàn)中涉及的主要試劑及作用(選擇性必修3 P74)(2022江蘇,24,12分)(2021山東,13, 2分)
(2)鑒定:在　　　????條件下,DNA遇　　　???? 呈現(xiàn)藍(lán)色(選擇性必修3 P74—75)(2023廣東,11,2分)(2022山東,13,2分)。(3)該實(shí)驗(yàn)是定性實(shí)驗(yàn)。
真題演練????(2023廣東,11,2分)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程是:裂解→分離 →沉淀→鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是?(　????)A.裂解:使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C.沉淀:可反復(fù)多次以提高DNA的純度D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色??
2.基因工程的基本操作程序深挖教材(1)利用PCR獲取目的基因:需要　　　　　　????作為原料,通過(guò)　　　????方式打開(kāi) DNA雙鏈,利用　　　　　　　　????催化合成DNA子鏈,同時(shí)要加入一對(duì)引物,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　 ?? (選擇性必修3 P77)(2022天津,15,10分)(2022江蘇,24,12分)(2022山東,25,12分)(2022遼寧,12,2分)。
耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸
(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建:基因表達(dá)載體由目的基因、復(fù)制原點(diǎn)、　　　　????、啟動(dòng) 子、　　 ?等組成。啟動(dòng)子位于基因的　　　,作用是　????　????　　　　　　　????。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　????　　　??????　　　?????　　　?????　　　?????　　　?????　(選擇性必修3 P80)(2023廣東,20,14分)(2023山東,25,10分)。
RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄
當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí),可以激活或抑制目的基因的表達(dá)
(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞:植物常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的　　　????中(選擇性必修3 P81)(2023海南,20,13分)(2023廣東,20,14分)。動(dòng)物常采用顯微注射技術(shù)將目的基因?qū)搿　　　????;將目的基因?qū)氪竽c桿菌時(shí)需先用　　????處理,使之處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(選擇性必修3 P82)。
(4)目的基因的檢測(cè)與鑒定:分子水平的檢測(cè),常采用　　????等技術(shù)檢測(cè)DNA和RNA,檢測(cè)是否表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)常采用　　　　　　　　　　?;最終還要進(jìn)行　　　???? 　　????水平的鑒定(選擇性必修3 P82)(2023山東,25,10分)(2023全國(guó)乙,38,15分)(2022 山東,25,12分)(2022天津,15,10分)(2022江蘇,24,12分)。
易混易錯(cuò)????標(biāo)記基因用來(lái)判斷目的基因的導(dǎo)入是否成功,目的基因表達(dá)與否用來(lái)判斷基因工程是否成功。
真題演練????(2022天津,15,10分)研究者擬構(gòu)建高效篩選系統(tǒng),將改進(jìn)的苯丙氨酸合成關(guān) 鍵酶基因P1導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌,以提高苯丙氨酸產(chǎn)量。?(1)如圖是該高效篩選系統(tǒng)載體的構(gòu)建過(guò)程。載體1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和
SacB兩個(gè)標(biāo)記基因, 為去除篩選效率較低的SacB,應(yīng)選擇引物　???和　　　 ????, 并在引物的　　　????(5'/3')端引入XhⅠ酶識(shí)別序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接后環(huán)化成載體2。(2)PCR擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因RpsL(鏈霉素敏感基因)時(shí),引物應(yīng)包含　　　????(EcR Ⅰ/Hind Ⅲ/Xh Ⅰ)酶識(shí)別序列,產(chǎn)物經(jīng)單酶切后連接到載體2構(gòu)建高效篩選載體4。(3)將改進(jìn)的P1基因整合到載體4構(gòu)建載體5。將載體5導(dǎo)入鏈霉素不敏感(由RpsL突變造成)、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株,應(yīng)采用含有　　　???? ?的平板進(jìn)行初步篩選。
(4)用一定的方法篩選出如下菌株:P1基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA,且載體5上其他DNA片段全部丟失。該菌的表型為　　　????。A.卡那霉素不敏感、鏈霉素敏感B.卡那霉素敏感、鏈霉素不敏感C.卡那霉素和鏈霉素都敏感D.卡那霉素和鏈霉素都不敏感(5)可采用　　???技術(shù)鑒定成功整合P1基因的菌株。之后以發(fā)酵法檢測(cè)苯丙氨酸產(chǎn)量。
答案????(1)1　4(以上兩空可調(diào)換)　5'????(2)Xh Ⅰ????(3)卡那霉素????(4)B????(5)PCR(聚合
酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),答案合理即可)
考法1????PCR技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用中的問(wèn)題分析1.引物(1)概念及選擇原則
(2)引物5'端修飾方法和作用
2.PCR和電泳(1)PCR①PCR參數(shù)設(shè)置
注意:擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度不同,延伸預(yù)設(shè)的時(shí)間也不同。
②PCR需要兩種引物,兩種引物分別與兩條模板鏈的3'端互補(bǔ),引物位于目的基因兩側(cè)。?
(2)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳時(shí)異常情況分析
例????(2023泰安學(xué)業(yè)仿真模擬,13)通過(guò)設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程,其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì),但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì),反應(yīng)體系中引物1和引物 2的5'端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述正確的是 (????????)
A.在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等B.第3輪PCR結(jié)束后,含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/2C.引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入載體
D.第2輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因
? 解析????PCR反應(yīng)體系通過(guò)高溫使DNA解旋(變性),不需要加入解旋酶,A錯(cuò)誤;第3輪PCR結(jié)束后,含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA有2個(gè),而總DNA分子有8個(gè),即占1/4,B 錯(cuò)誤;引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn),可以使目的基因定向插入限制酶切割后的載體,C正確;第2輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈不等長(zhǎng)的突變基因,其中 ②較短,D錯(cuò)誤。
考法2　CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9(核酸內(nèi)切酶)和人工設(shè)計(jì)的gRNA(向?qū)NA)構(gòu)成。在 gRNA引導(dǎo)下,Cas9與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷。隨后細(xì)胞通過(guò)自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制,將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái),但通常會(huì)在斷裂處造成少量核苷酸的插入或缺失。當(dāng)DNA雙鏈斷裂后,如果細(xì)胞中有DNA修復(fù)模板(由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列組成),斷裂部分可依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行精確修復(fù),從而將目的基因插入指定位點(diǎn)(如圖1)。
　　通過(guò)在Cas9基因中引入突變,獲得了只有切割一條鏈活性的nCas9。將nCas9與胞嘧啶脫氨酶(或腺嘌呤脫氨酶)融合,利用單堿基編輯技術(shù),能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基編輯,最終可以實(shí)現(xiàn)C—G→T—A(如圖2)(或A—T→G—C)的轉(zhuǎn)換。　　該技術(shù)的目的是實(shí)現(xiàn)敲除、敲入、單堿基編輯、激活或抑制基因表達(dá)。
例????(2021海南,25節(jié)選)CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術(shù),Cas9基因表達(dá)的Cas 9蛋白像一把“分子剪刀”,在單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)下,切割DNA雙鏈以敲除目標(biāo)基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示。?
回答下列問(wèn)題。(1)過(guò)程①中,為構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒,需對(duì)含有特定sgRNA編碼序列的DNA進(jìn) 行酶切處理,然后將其插入經(jīng)相同酶切處理過(guò)的質(zhì)粒上,插入時(shí)所需要的酶是　　???? 　　????。(2)過(guò)程②中,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的方法是　　　　　????。(3)過(guò)程③~⑤中,sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體,該復(fù)合體中的sgRNA可識(shí)別并與目標(biāo) DNA序列特異性結(jié)合,二者結(jié)合所遵循的原則是　　　　　????。隨后,Cas9蛋白可切割　　　　　????序列。(4)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白?？蒲腥藛T將該蛋白酶基因插入CRISPR/
Cas9質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒,隨后將其導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞,通過(guò)基因編輯把該蛋白酶基因插入基因組DNA中,構(gòu)建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡(jiǎn)述CRISPR/ Cas9重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi),將該蛋白酶基因插入基因組DNA的編輯過(guò)程:?? ??????。
? 解析????(1)將目的基因插入經(jīng)相同酶切處理過(guò)的質(zhì)粒上,插入時(shí)所需要的酶是DNA連接酶。(2)大腸桿菌是原核生物,屬于微生物,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是Ca2+ 處理法。(3)sgRNA分子與目標(biāo)DNA進(jìn)行特異性結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則;由圖知, Cas9可切割目標(biāo)DNA。(4)根據(jù)圖示可知:CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出 sgRNA和表達(dá)出Cas9蛋白,二者形成復(fù)合體,該復(fù)合體中的sgRNA可識(shí)別并與目標(biāo) DNA序列特異性結(jié)合,引導(dǎo)Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA序列,插入新的基因。
? 答案????(1)DNA連接酶????(2)Ca2+處理法????(3)堿基互補(bǔ)配對(duì)　目標(biāo)(目的)DNA(基因)????(4)表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA,兩者形成復(fù)合體;sgRNA識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列;引導(dǎo) Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA序列
考法3　基因工程中核酸序列閱讀、分析1.核酸序列閱讀、分析時(shí)核酸鏈的選擇
2.移碼突變構(gòu)建融合基因表達(dá)載體時(shí)易發(fā)生移碼突變,如圖P基因與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因:編碼鏈與mRNA中堿基排列順序一致(只是mRNA中不含T只含U),起始密碼子是AUG,
那么編碼鏈核酸序列的閱讀、分析就從ATG開(kāi)始,三聯(lián)體密碼子閱讀框架的改變會(huì)造成翻譯結(jié)果的改變。若發(fā)生移碼突變應(yīng)再插入一定數(shù)量堿基對(duì),保持原基因編碼的密碼子順序不變。
3.核酸序列閱讀、分析需要注意方向性
例????(2020北京,17節(jié)選)C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向為5'→3'。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質(zhì)粒連接,克隆C1酶基因時(shí)在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。該基因內(nèi)部沒(méi)有這兩種酶切位點(diǎn)。圖中酶切位點(diǎn)1和2所對(duì)應(yīng)的酶分別是　　　　　　　　　　　????。?
? 解析????由“C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?'→3'”,知轉(zhuǎn)錄從DNA鏈的3'端開(kāi)始,mRNA自身的延伸方向?yàn)?'→3',即沿B鏈從3'→5'方向轉(zhuǎn) 錄,即B鏈3'端為基因上游,結(jié)合質(zhì)粒上啟動(dòng)子的方向分析,B鏈3'端應(yīng)該用BamHⅠ進(jìn)行切割,而其5'端應(yīng)該用SmaⅠ進(jìn)行切割。
? 答案????BamHⅠ、SmaⅠ
考法4　不同基因工程載體的構(gòu)建　　一般基因表達(dá)載體由啟動(dòng)子和終止子、目的基因、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)等組成, 但是在實(shí)際應(yīng)用中,根據(jù)不同的需求,可以構(gòu)建不同的基因工程載體。
例????(2023浙江6月選考,19,2分)某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),將綠色熒光蛋白基因 (GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只,交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型,設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物電泳結(jié) 果如圖乙所示。?
?下列敘述正確的是?(　????)A.Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá)B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型,4號(hào)條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR,能更好地區(qū)分雜合子和純合子

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