課標(biāo)內(nèi)容　(1)闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。(2)闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。(3)DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。(4)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。
基因工程的基本操作程序
重組DNA技術(shù)的基本工具
DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
考點(diǎn)一　重組DNA技術(shù)的基本工具
2.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)
①將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾?！　　?
①DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，而DNA聚合酶是把單個(gè)的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。　　　
1.實(shí)踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通“質(zhì)粒載體”的條件外，還應(yīng)具有的條件是___________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。
對(duì)靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率；對(duì)細(xì)胞無(wú)害
2.限制性內(nèi)切核酸酶EcRⅠ只能識(shí)別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcRⅠ的切點(diǎn)，請(qǐng)畫(huà)出目的基因兩側(cè)被限制酶EcRⅠ切割后所形成的黏性末端。
3.軟米基因會(huì)導(dǎo)致水稻稻米合成直鏈淀粉含量降低呈現(xiàn)軟米特征，人們大多喜歡軟米的口感，為獲得高產(chǎn)軟米粳型水稻，軟米基因Wxmq與蠟質(zhì)基因Wx互為等位基因，序列長(zhǎng)度相同均為557堿基對(duì)(bp)，但基因內(nèi)部出現(xiàn)了限制酶NlaⅢ識(shí)別位點(diǎn)，用限制酶NlaⅢ處理不同植株的DNA片段，獲得電泳圖如下，分析可知含有純合軟米基因的植株為哪幾個(gè)？(填植株編號(hào))
提示　1、4、5、9、10。
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇Sma Ⅰ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇Sma Ⅰ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcR Ⅰ兩種限制酶。
2.標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因可用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞：
1.(2023·江蘇鹽城調(diào)研)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
考向　圍繞基因工程的基本工具，考查科學(xué)思維
A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)
解析　切割目的基因時(shí)，用BamH Ⅰ切割會(huì)破壞目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體，會(huì)出現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，或目的基因和質(zhì)粒的反向連接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切，能確保目的基因和質(zhì)粒的正向連接，并且質(zhì)粒上保留新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，A、C正確；在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因，至少需保留其中的一個(gè)，B正確；用Pst Ⅰ切割后，質(zhì)粒上氨芐青霉素抗性基因被破壞了，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，D錯(cuò)誤。
2.(2021·全國(guó)乙卷，38)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
回答下列問(wèn)題：(1)常用的DNA連接酶有E.cli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA連接酶連接。上圖中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
EcR Ⅰ、Pst Ⅰ
EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是_____________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能__________；質(zhì)粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是____________________________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指________________________________________________________________________________________________________。
用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞
RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列
解析　(1)由題圖可以看出，EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.cli DNA連接酶可用于連接黏性末端，T4 DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。(2)DNA連接酶催化DNA鏈的5′端與另一DNA鏈的3′端生成磷酸二酯鍵。(3)復(fù)制原點(diǎn)是在基因組上復(fù)制起始的一段序列，可以保證質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。質(zhì)粒上有限制酶切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)可被限制酶切開(kāi)并使外源目的基因插入其中。若質(zhì)粒DNA分子上有某種抗生素抗性基因，則可以用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取
(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
耐高溫的DNA聚合酶
①在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3′端，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。③復(fù)性溫度過(guò)高，則引物難以與模板鏈結(jié)合，溫度過(guò)低則易使兩條母鏈配對(duì)結(jié)合，均無(wú)法獲得PCR產(chǎn)物。④真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋?！　　?br/>2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心
　受體細(xì)胞中是否含有目的基因
提醒　啟動(dòng)子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區(qū)別
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞只有該步驟沒(méi)涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
(1)農(nóng)桿菌特點(diǎn)①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T--DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T--DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T--DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T--DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。(3)導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過(guò)花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”?！　　?br/>4.目的基因的檢測(cè)與鑒定
1. 設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。
①第1組：____________________________________________________________；②第2組：___________________________________________________________。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效
引物Ⅰ自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效
2.如果將某種抗性基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，僅一條染色體含抗性基因，該基因的傳遞遵循孟德?tīng)柗蛛x定律。判斷依據(jù)是___________________________________________________________。
僅一條染色體含有抗性基因，另一條沒(méi)有其等位基因
3.利用大腸桿菌可生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面各種細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可用大腸桿菌嗎？提示　不可用。大腸桿菌為原核生物，沒(méi)有真核生物所具有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等結(jié)構(gòu)，無(wú)法對(duì)核糖體合成的肽鏈進(jìn)行加工。
1.(2022·南通四模)遞減PCR是常規(guī)PCR技術(shù)的發(fā)展，下圖表示遞減PCR各階段溫度及時(shí)間控制。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A.PCR反應(yīng)體系中應(yīng)加入TaqDNA聚合酶、模板DNA、4種脫氧核苷酸、引物、緩沖液等物質(zhì)B.第1階段的目的是使模板DNA充分解旋，減少DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響C.第2階段中復(fù)性溫度較高可減少引物與模板鏈的非特異性結(jié)合，為第3階段提供更多正確的模板D.第4階段72 ℃下維持10 min，主要目的是使子鏈與互補(bǔ)模板鏈結(jié)合形成雙螺旋
解析　PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，PCR反應(yīng)體系中應(yīng)加入Taq DNA聚合酶(催化DNA子鏈的形成)、模板DNA、4種脫氧核苷酸(原料)、引物、緩沖液等物質(zhì)，A正確；分析題圖可知，第1階段是在96 ℃條件下處理4 min，該階段的目的是使模板DNA在高溫下充分解旋，得到單鏈DNA，以減少DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響，B正確；第2階段中復(fù)性溫度較高可減少引物與模板鏈的非特異性結(jié)合，為第3階段提供更多正確的模板，C正確；72 ℃下維持10 min，主要目的是使與模板互補(bǔ)的DNA鏈延伸，以形成新的脫氧核苷酸鏈，D錯(cuò)誤。
2.(2022·全國(guó)乙卷，38)新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測(cè)和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用?；卮鹣铝袉?wèn)題：
(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測(cè)新冠病毒RNA(核酸檢測(cè))可以采取RT—PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過(guò)程需要的酶是______________，再通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。(2)為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的____________________來(lái)進(jìn)行。PCR過(guò)程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是______________。
(3)某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)(檢測(cè)體內(nèi)是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明________________________(答出1種情況即可)；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明_____________________________。(4)常見(jiàn)的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過(guò)基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S?；蚬こ痰幕静僮髁鞒淌莀___________________________________________________________________。
曾感染新冠病毒，已康復(fù)
已感染新冠病毒，是患者
獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→導(dǎo)入受體細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定
解析　(1)以病毒RNA為模板合成cDNA是逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，這一過(guò)程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。獲得cDNA后可通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。(2)為確保PCR擴(kuò)增獲得的是特異性序列，從而確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來(lái)進(jìn)行。PCR過(guò)程每次循環(huán)分為3步，即變性(超過(guò)90 ℃)→復(fù)性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中溫度最低的一步是復(fù)性。(3)某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明他體內(nèi)沒(méi)有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已經(jīng)康復(fù)；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明他體內(nèi)已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定。
跳出題?！?如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞
(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌。
(3)篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無(wú)菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
考點(diǎn)三　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定
①加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。②本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核(無(wú)DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作為材料?！　　?br/>2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟
(3)電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為_(kāi)_______的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。
①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。②在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。③電泳時(shí)，DNA的相對(duì)分子量越大，遷移速率越慢；DNA的相對(duì)分子量越小，遷移速率越快?！　　?br/>1.(2023·江蘇啟東中學(xué)檢測(cè))如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A.圖1中的溶液a是NaCl溶液B.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶C.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯D.圖2中試管1的作用是證明2ml·L－1的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色
解析　圖1所示操作為析出DNA，溶液a是研磨液過(guò)濾靜置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A錯(cuò)誤；加入預(yù)冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精，B錯(cuò)誤；圖2所示操作中的錯(cuò)誤是試管中的液面高于水浴的液面，導(dǎo)致試管受熱不均勻，C正確；圖2中試管1的作用是作為對(duì)照，排除NaCl溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，D錯(cuò)誤。
2.(2023·河北衡水調(diào)研)下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是(　　)A.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程B.待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA在電泳中的遷移速率C.進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D.PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定解析　DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳，即帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程，A正確，C錯(cuò)誤。
1.(2019·江蘇卷，10)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是(　　)A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B.DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C.預(yù)冷的乙醇可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNAD.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱
解析　哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無(wú)細(xì)胞核和細(xì)胞器，不能提取到DNA；雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核和各種細(xì)胞器，用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量差異很大，A錯(cuò)誤；為防止DNA斷裂，在DNA析出過(guò)程中攪拌操作要輕柔且沿著一個(gè)方向，B正確；DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精溶液，預(yù)冷的酒精溶液可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此，用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱，D正確。
2.(2021·江蘇卷，23改編)某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒，請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問(wèn)題：
(1)目的基因的擴(kuò)增①提取真菌細(xì)胞________________________，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)一步獲得基因m片段。②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M，設(shè)計(jì)引物P2時(shí)，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致__________________________________________。
基因m轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA
蛋白M上不含tag標(biāo)簽
(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建①將Sma Ⅰ切開(kāi)的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)________________________，形成A－m結(jié)合體。將A－m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及_____________酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A—m仍能被Sma Ⅰ切開(kāi)，則Sma Ⅰ的酶切位點(diǎn)可能在_______________________________。
基因m的連接處、基因m的內(nèi)部
(3)融合蛋白的表達(dá)①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入質(zhì)粒A－m，然后涂布于無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機(jī)理是______________________________________________________________________________________________________________________________________。②若通過(guò)抗原—抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，說(shuō)明_____________________________________，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。
受體菌在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因可以長(zhǎng)成菌落
融合基因表達(dá)(或融合基因正確解碼)
解析　(1)①以逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細(xì)胞中提取基因m轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA。②從構(gòu)建好的重組質(zhì)粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動(dòng)到終止密碼子多肽鏈就斷開(kāi)，則不會(huì)對(duì)tag序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行翻譯，蛋白M上就不含tag標(biāo)簽。(2)①?gòu)膱D上看，載體A只有一個(gè)Sma Ⅰ的酶切位點(diǎn)，故被Sma Ⅰ切開(kāi)后，載體由環(huán)狀變?yōu)殒湢頓NA，將Sma Ⅰ切開(kāi)的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補(bǔ)配對(duì)。將A－m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的
DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。②重組質(zhì)粒中，載體A被Sma Ⅰ切開(kāi)的位置已經(jīng)與基因m相連，原來(lái)的酶切位點(diǎn)已不存在，若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A—m仍能被Sma Ⅰ切開(kāi)，則Sma Ⅰ的酶切位點(diǎn)可能在基因m的連接處、基因m內(nèi)部。(3)①篩選目的菌株的機(jī)理是：導(dǎo)入了質(zhì)粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。②若通過(guò)抗原—抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，位于tag標(biāo)簽上游的基因m應(yīng)該正常表達(dá)，說(shuō)明融合基因表達(dá)(或融合基因正確解碼)。
3.(2020·江蘇卷，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcR Ⅰ酶切為例)：
請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：(1)步驟Ⅰ用的EcR Ⅰ是一種__________________________酶，它通過(guò)識(shí)別特定的_____________切割特定位點(diǎn)。(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成______________；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化_______________________________。
限制性內(nèi)切核酸(或限制)　
以DNA為模板的DNA鏈的延伸　
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是__________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。
(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是________。A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
解析　(1)根據(jù)題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段，所用的EcR Ⅰ是一種限制酶，其能識(shí)別特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。(2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環(huán)狀，其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基和5′—磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升高溫度到95 ℃是為了打開(kāi)氫鍵使雙鏈解旋，獲得DNA單鏈，TaqDNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA子鏈，因?yàn)镈NA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴(kuò)增未知序列，選擇的與模板鏈相結(jié)合的引物應(yīng)為5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcR Ⅰ切割后產(chǎn)生的黏性末端，因此其5′端序列應(yīng)為－AATT，3′端序列應(yīng)為－TTAA，B正確。
4.(2019·江蘇卷，33)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為_(kāi)_______的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在___________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。
(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長(zhǎng)情況如表(“＋”代表生長(zhǎng)，“－”代表不生長(zhǎng))。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是__________________、__________________。
(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段，原因是____________________。
解析　(1)EcR V酶切位點(diǎn)在酶所識(shí)別序列的中心軸線處，產(chǎn)生的是平末端。(2)DNA連接酶對(duì)平末端的連接效率較低，因此通常要將平末端改造成黏性末端后再進(jìn)行連接。由于目的基因片段的兩端各自帶一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，處理后的載體質(zhì)粒兩端需要各添加一個(gè)堿基為胸腺嘧啶的脫氧核苷酸；要將處理后的質(zhì)粒與目的基因連接起來(lái)，需要用DNA連接酶。(3)由于四環(huán)素抗性基因中含有EcR V酶識(shí)別的序列及切割位點(diǎn)，所以形成的重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因已經(jīng)被破壞，而氨芐青霉素抗性基因正常。根據(jù)表中結(jié)果可知，A類菌落抗氨芐青霉素和四環(huán)素，說(shuō)明A菌落中導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒；B類菌落抗氨芐青霉素而不抗四環(huán)素，說(shuō)明B類菌落中導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒；C類菌落既不抗氨芐青霉素，也不抗四環(huán)素，說(shuō)明C類菌落中沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。
(4)由于處理后的P2質(zhì)粒的兩個(gè)末端都含一個(gè)胸腺嘧啶的脫氧核苷酸，而目的基因片段的兩端各自帶一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸，所以目的基因在和P2質(zhì)粒連接時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)兩種情況：正向連接和反向連接。分析圖2可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對(duì)引物，則無(wú)論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果選擇乙和丙這對(duì)引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和P2質(zhì)粒反向連接，則引物乙會(huì)出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時(shí)若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
5.(2018·江蘇卷，32改編)為生產(chǎn)具有特定性能的α－淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α－淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì))，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程如圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α－淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的_________________。(2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的___________端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是___________________________________________。(3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中_______的設(shè)定與引物有關(guān)，_______的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填序號(hào))①變性溫度?、趶?fù)性溫度?、垩由鞙囟取、茏冃詴r(shí)間　⑤復(fù)性時(shí)間?、扪由鞎r(shí)間
使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連
(4)如圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：
圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有________種。(5)獲得工程菌表達(dá)的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如表所示：
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α－淀粉酶活性最高的條件為_(kāi)_____________________________________。
pH為8.5，緩沖液為50 mmL/L Tris－HCl
解析　(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α－淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA。(2)構(gòu)建重組DNA分子時(shí)，需用限制性內(nèi)切核酸酶處理目的基因和載體，故需要在引物的5′端添加限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)添加不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣可以使DNA片段按照一定方向插入表達(dá)載體，防止目的基因或載體自身的黏性末端之間相互連接以及目的基因與載體反向連接。(3)利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)使引物無(wú)法與模板的堿基配對(duì)，所以復(fù)性溫度的設(shè)定與引物有關(guān)；延伸時(shí)間的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(4)密碼子由mRNA上相鄰的3個(gè)堿基組成，所以該片段的24個(gè)堿基包含8個(gè)密碼子。該片段后面的第一個(gè)堿基為U，所以后面的密碼子最多可能有4×4＝16(種)，根據(jù)題干信息及題中給出的mRNA序列可知，虛線框后第一個(gè)密碼子不可能是終止密碼子，所以實(shí)際最多有13種密碼子。(5)由表格數(shù)據(jù)可知，該α－淀粉酶活性最高的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mml/L Tris－HCl。
考點(diǎn)一　重組DNA技術(shù)的基本工具1.(2023·山東日照期中)四種限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示，下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A.上圖中EcR Ⅰ、Pst Ⅰ兩種酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA連接酶連接B.圖中Sma Ⅰ、EcR V兩種酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA連接酶連接C.DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段連接的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵D.限制酶能識(shí)別特定的核苷酸序列，具有專一性，不同的限制酶切割不能產(chǎn)生相同的黏性末端
解析　不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D錯(cuò)誤。
2.(2023·北京海淀區(qū)模擬)科研人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗病毒蛋白基因C導(dǎo)入番木瓜，培育出轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜，Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A.農(nóng)桿菌的T－DNA與番木瓜基因發(fā)生重組B.構(gòu)建重組質(zhì)粒需要限制酶和DNA聚合酶C.含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌具有四環(huán)素抗性D.轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
解析　構(gòu)建重組質(zhì)粒需要限制酶和DNA連接酶，B錯(cuò)誤；抗病毒蛋白基因C的插入位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，插入抗病毒蛋白基因C后，重組Ti質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因被破壞，含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌不具有四環(huán)素抗性，C錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D錯(cuò)誤。
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序3.(2023·北京民族大學(xué)附中期末)下圖是利用基因工程培育抗蟲(chóng)植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是(　　)
A.⑤只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異B.③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲(chóng)基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀D.②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與
解析?、轂檗D(zhuǎn)基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就說(shuō)明轉(zhuǎn)入的目的基因成功表達(dá)了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A正確；③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到植物細(xì)胞的染色體上，B錯(cuò)誤；受體細(xì)胞的染色體上可能含抗蟲(chóng)基因，但不代表該基因就一定成功表達(dá)，因此不能確定⑤是否表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀，C錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶參與，D錯(cuò)誤。
4.(2023·山東濟(jì)寧聯(lián)考)圖甲、乙中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A.若通過(guò)PCR獲取該目的基因，應(yīng)該選用引物甲和引物丙B.圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建表達(dá)載體，應(yīng)選用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切C.若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，需選用Ca2＋轉(zhuǎn)化法D.在受體細(xì)胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時(shí)表達(dá)
解析　通過(guò)PCR獲取目的基因時(shí)，兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，并沿相反的方向合成子鏈，故選用引物甲和引物丙，A正確；由甲圖可知，選用BamHⅠ會(huì)破壞兩種抗性基因，結(jié)合乙圖可確定應(yīng)選擇BclⅠ和HindⅢ剪切，B正確；將目的基因?qū)氪竽c桿菌常采用Ca2＋轉(zhuǎn)化法，C正確；構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)目的基因插入氨芐青霉素抗性基因中，故氨芐青霉素抗性基因被破壞不能表達(dá)，D錯(cuò)誤。
5.(多選)(2022·鹽城三模)某實(shí)驗(yàn)小組進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)A.取材時(shí)可選用雞血、洋蔥、菜花等富含DNA的材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)B.破碎植物細(xì)胞時(shí)，加入洗滌劑以加速細(xì)胞壁瓦解C.DNA的釋放和溶解是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度有利于DNA釋放D.鑒定時(shí)，需將DNA溶解在2 ml/LNaCl溶液中，再加入二苯胺試劑進(jìn)行沸水浴
解析　雞血、洋蔥、菜花等材料富含DNA，可以用來(lái)進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，A正確；破碎植物細(xì)胞時(shí)，加入洗滌劑以加速細(xì)胞膜瓦解，B錯(cuò)誤；DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精，有利于DNA的釋放，調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度有利于DNA的溶解，C錯(cuò)誤；用二苯胺試劑鑒定提取的DNA時(shí)，沸水浴加熱冷卻后會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。
6.(多選)(2023·南師附中期初)載體是基因工程中攜帶外源DNA片段(目的基因)進(jìn)入受體細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見(jiàn)的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。下圖是利用細(xì)菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A.重組載體A、重組載體B分別是基因克隆載體和基因表達(dá)載體B.載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因C.必須把目的基因插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間D.培養(yǎng)細(xì)菌A和細(xì)菌B的培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)成分和功能上沒(méi)有明顯差異
解析　重組載體A導(dǎo)入受體菌后隨著受體菌的繁殖而擴(kuò)增，因此是基因克隆載體，而重組載體B導(dǎo)入受體菌后，表達(dá)產(chǎn)生胰島素，因此是基因表達(dá)載體，A正確；作為運(yùn)載體必須要具備的條件有：含有限制酶的切割位點(diǎn)(便于目的基因的插入)、復(fù)制原點(diǎn)(便于目的基因的擴(kuò)增)及標(biāo)記基因(便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞)等，因此載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因，B正確；培養(yǎng)細(xì)菌A的目的是擴(kuò)增目的基因，不需要獲得表達(dá)產(chǎn)物，因此目的基因不一定要插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間，C錯(cuò)誤；培養(yǎng)細(xì)菌A的目的是擴(kuò)增目的基因，培養(yǎng)細(xì)菌B的目的是獲得胰島素，因此培養(yǎng)兩者的培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)成分和功能上有明顯差異，D錯(cuò)誤。
7.(多選)(2022·南通第一次質(zhì)檢)某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，蓄意逃避監(jiān)管，實(shí)施了人類胚胎基因編輯活動(dòng)。該技術(shù)的原理是通過(guò)設(shè)計(jì)向?qū)NA中的識(shí)別序列，引導(dǎo)內(nèi)切核酸酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割(如圖)。下列有關(guān)敘述正確的是(　 　)
A.向?qū)NA可在RNA聚合酶催化下，以核糖核苷酸為原料合成B.向?qū)NA中的識(shí)別序列可與目標(biāo)DNA單鏈特定區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)C.Cas9蛋白的作用是破壞DNA特定位點(diǎn)脫氧核苷酸之間的氫鍵D.該技術(shù)由于存在脫靶等風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)帶來(lái)一系列安全性及倫理問(wèn)題
解析　向?qū)NA可通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成，該過(guò)程需要RNA聚合酶催化，A正確；由圖可知，向?qū)NA中的識(shí)別序列可與目標(biāo)DNA單鏈特定區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，B正確；Cas9蛋白是一種內(nèi)切核酸酶，作用部位是DNA分子中特定的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，C錯(cuò)誤；該技術(shù)由于存在脫靶等風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)帶來(lái)一系列安全性及倫理問(wèn)題，D正確。
8.(多選)(2022·江蘇百校大聯(lián)考)RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)稱為RT－PCR，過(guò)程如圖所示。下列相關(guān)敘述正確的是(　 　)
A.過(guò)程①需要RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、核糖核苷酸等條件B.真核細(xì)胞的mRNA經(jīng)過(guò)程①②獲得的DNA無(wú)內(nèi)含子片段C.過(guò)程③PCR擴(kuò)增時(shí)引物中的CG含量會(huì)影響復(fù)性溫度D.RT－PCR技術(shù)可應(yīng)用于新冠病毒(RNA病毒)的核酸檢測(cè)
解析　過(guò)程①是由RNA形成單鏈DNA的過(guò)程，表示逆轉(zhuǎn)錄，需要RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、脫氧核苷酸等條件，A錯(cuò)誤；真核細(xì)胞中DNA的外顯子部分轉(zhuǎn)錄的RNA拼接形成mRNA，因此真核細(xì)胞的mRNA經(jīng)過(guò)程①②逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程獲得的DNA無(wú)內(nèi)含子片段，B正確；CG含量越高，氫鍵越多，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，因此過(guò)程③PCR擴(kuò)增時(shí)引物中的CG含量會(huì)影響復(fù)性溫度，C正確；新冠病毒遺傳物質(zhì)是RNA，RT－PCR技術(shù)可應(yīng)用于新冠病毒的核酸檢測(cè)，D正確。
9.(多選)(2022·蘇州期末)人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補(bǔ)作用。干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程。①～④表示相關(guān)的操作，EcRⅠ、BamHⅠ為限制酶，它們的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如下表所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A.過(guò)程①所需的兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列有利于后續(xù)操作B.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因必須位于啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制C.過(guò)程③利用的是T－DNA的特性將目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中D.過(guò)程④需控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細(xì)胞發(fā)生再分化解析　結(jié)合題干信息分析題圖可知，PCR的產(chǎn)物用EcR Ⅰ和BamH Ⅰ來(lái)酶切，因此在兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列有利于后續(xù)操作，A正確；啟動(dòng)子負(fù)責(zé)與RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)表達(dá)，終止子負(fù)責(zé)終止表達(dá)，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因必須位于啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行表達(dá)，B錯(cuò)誤；根瘤農(nóng)桿菌是原核生物，無(wú)染色體，C錯(cuò)誤；整個(gè)過(guò)程最終需要利用愈傷組織細(xì)胞生成干擾素，因此過(guò)程④應(yīng)控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細(xì)胞發(fā)生再分化，D正確。
10.(2022·泰州三模)研究人員利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法培育出轉(zhuǎn)抗寒基因PgLCBF1的月季石榴，主要過(guò)程示意圖如下。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
(1)質(zhì)粒pB1121的復(fù)制原點(diǎn)中A－T比例高，有利于________。過(guò)程①用限制酶XbaⅠ分別切割質(zhì)粒和抗寒基因，原因是__________________________________________________________________________________________________。(2)過(guò)程②篩選時(shí)，應(yīng)將菌液用______________法接種培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基除水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源和生長(zhǎng)因子外，還應(yīng)加入的物質(zhì)有______________。實(shí)驗(yàn)中過(guò)程③擴(kuò)大培養(yǎng)的主要目的是____________________________________________________________________________________________________。
形成相同的黏性末端，便于將目的基因插入到質(zhì)粒特定部位
轉(zhuǎn)基因大腸桿菌快速增殖，獲得更多的重組質(zhì)粒(或獲得更多的重組質(zhì)粒)
(3)轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌借助萌發(fā)的花粉管運(yùn)輸，將PgLCBF1導(dǎo)入________中，最終獲得轉(zhuǎn)基因種子，經(jīng)播種、篩選出抗寒月季石榴新品種。與農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化月季石榴葉肉細(xì)胞相比，花粉管通道轉(zhuǎn)化法具有的優(yōu)點(diǎn)有__________________________________________________________________________________。
操作簡(jiǎn)單、直接，不需要經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化成功后可直接獲得種子
(4)為探究上述農(nóng)桿菌菌液浸染的合適介質(zhì)和時(shí)期，研究人員進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)完成下表。
等量的上述不同介質(zhì)[植物組織培養(yǎng)液(MS)、質(zhì)量濃度為5%蔗糖溶液、MS＋5%蔗糖混合溶液]
用等量不同的農(nóng)桿菌浸染液涂抹傳粉后的月季石榴花柱頭
解析　(1)由于A與T配對(duì)時(shí)形成兩個(gè)氫鍵，而C與G配對(duì)時(shí)形成三個(gè)氫鍵，所以質(zhì)粒pB1121的復(fù)制原點(diǎn)中A－T比例高，有利于解旋，將雙鏈打開(kāi)，進(jìn)行DNA復(fù)制。由于用相同的限制酶切割可獲得黏性末端相同的質(zhì)粒和目的基因，便于將目的基因插入到質(zhì)粒特定部位。(2)過(guò)程②形成的菌落分布均勻，說(shuō)明是用稀釋涂布平板法接種的。由于質(zhì)粒上的標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾乜剐曰?，因此使用的培養(yǎng)基除水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源和生長(zhǎng)因子外，還應(yīng)加入瓊脂和新霉素，以便篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落。實(shí)驗(yàn)中過(guò)程③擴(kuò)大培養(yǎng)的主要目的是獲得更多的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，以獲得更多的重組質(zhì)粒。
(3)轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌借助萌發(fā)的花粉管運(yùn)輸，將PgLCBF1導(dǎo)入受精卵中，最終獲得轉(zhuǎn)基因種子，經(jīng)播種、篩選出抗寒月季石榴新品種。與農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化月季石榴葉肉細(xì)胞相比，花粉管通道轉(zhuǎn)化法具有的優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單、直接，不需要經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化成功后可直接獲得種子。(4)本實(shí)驗(yàn)是探究農(nóng)桿菌菌液浸染的合適介質(zhì)和時(shí)期，因此配置農(nóng)桿菌浸染液時(shí)，需將5 mL轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌菌液，分別與上述不同介質(zhì)(MS培養(yǎng)液、質(zhì)量濃度為5%蔗糖溶液、MS＋5%蔗糖混合溶液)混勻；蘸取收集好的花粉，輕輕點(diǎn)涂在花柱的柱頭上，屬于人工授粉的過(guò)程；分別在授粉時(shí)和授粉后24 h，選擇柱頭未開(kāi)裂的花，用等量不同的農(nóng)桿菌侵染液涂抹傳粉后的月季石榴花柱頭，并作標(biāo)記，每個(gè)處理浸染10朵花，一段時(shí)間后收獲種子并進(jìn)行種植，統(tǒng)計(jì)坐果率、種子出芽率和轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率。
11.(2023·云南名校聯(lián)盟)干擾素是動(dòng)物體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，在新冠病毒的治療過(guò)程中起到了重要作用。此外，干擾素還用于治療乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌癥。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是從人體血液中的白細(xì)胞中提取，產(chǎn)量很低。用基因工程方法讓酵母菌生產(chǎn)人的干擾素，可以使產(chǎn)量大幅度提高?；卮鹣铝袉?wèn)題：
(1)基因工程的核心步驟是_____________________，該步驟需要用限制酶PstⅠ切割質(zhì)粒和干擾素基因，已知Pst Ⅰ識(shí)別的核苷酸序列以及切割位點(diǎn)為CTGCA↓G，則PstⅠ切割干擾素基因和質(zhì)粒產(chǎn)生的黏性末端為_(kāi)__________，可以用________________________________(填“E.cliDNA連接酶”“T4DNA連接酶”或“E.cli DNA連接酶或T4DNA連接酶”)將切割后的黏性末端縫合在一起。
E.cli DNA連接酶或T4 DNA連接酶

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