第57講 基因工程的基本工具和基本操作程序
1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三 種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.按照實驗操作步驟，進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進(jìn)行虛擬PCR實驗。
考點一　重組DNA技術(shù)的基本工具
考點二　基因工程的基本操作程序
考點三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
主要考點 必備知識
重組DNA技術(shù)的基本工具
基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。 由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。
基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。
2.重組DNA技術(shù)的基本工具
將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞
2.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)——“分子手術(shù)刀”
限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。
主要是從原核生物中分離純化出來的。
①全稱和簡稱全稱——限制性內(nèi)切核酸酶 簡稱——限制酶
現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)核酸切酶。
資料卡：限制酶的命名：用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌( Escherichia cli)的R型菌株分離來的，就用字母EcR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcRI。
練習(xí)：粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）中分離的第一種限制酶即_______
④特點：能識別雙鏈 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
大腸桿菌的EcRⅠ限制酶只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。
⑤識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。
限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。
在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。
⑥切割結(jié)果當(dāng)限制酶在它識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端；當(dāng)限制酶在它識別序列的中軸線處切開時，產(chǎn)生的是平末端；
*思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。
Hind III和EcR I
下列操作中選用哪種限制酶切割來構(gòu)建重組質(zhì)粒？
用同種限制酶切割(EcRⅠ)
把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？
如何將不同種來源的DNA片段連接起來？
(2)DNA連接酶——“分子縫合針”
可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段
既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）
★思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
A A T T G
①作用：將兩個DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。 。
都能催化形成磷酸二酯鍵
需要DNA的一條鏈作模板
形成完整的重組DNA分子
只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
(3)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”
①作用：將外源基因送入受體細(xì)胞&在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。
②種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。它們的來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別。
大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖
③作為載體需具備的條件
a.有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。
b.能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。
c.常有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。
在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。
（1）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)該選擇的限制酶為_______。（2）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)該選擇的限制酶為_____。
1.已知限制性內(nèi)切酶XmaⅠ和SmaⅠ的識別序列分別為C↓CCGGG和CCC↓GGG。有關(guān)這兩種酶及應(yīng)用的敘述，錯誤的是(　　)A．這兩種酶作用的底物都是雙鏈DNAB．DNA中出現(xiàn)這兩種酶識別序列的概率不同C．XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD．使用這兩種酶時需注意控制反應(yīng)溫度、時間等
解析:限制酶的作用是能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，所以限制酶作用的底物是雙鏈DNA分子，A正確；由題干可知，這兩種限制酶識別的核苷酸序列相同，所以識別序列的機(jī)率相同，B錯誤；根據(jù)堿基互補配對原則，CCCGGG的互補鏈?zhǔn)荊GGCCC，并根據(jù)XmaⅠ的切割位點可知，切割后的黏性末端是—GGCC，C正確；溫度能影響酶的活性，所以使用酶時需要注意控制反應(yīng)溫度和時間等，D正確。故選B。
[對點訓(xùn)練]1．限制酶MunⅠ和限制酶EcRⅠ的識別序列及其切割位點分別如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如圖表示某一目的基因片段與質(zhì)粒拼接形成重組質(zhì)粒的過程，相關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．用限制酶EcRⅠ切割目的基因，同時用限制酶MunⅠ切割質(zhì)粒B．兩種限制酶切割后形成的黏性末端的堿基可以互補配對C．限制酶能使特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開D．將重組質(zhì)粒同時用2種限制酶切割會形成2種DNA片段
解析:由圖可知，目的基因兩側(cè)都是限制酶EcRⅠ的切割位點，因此應(yīng)選用限制酶EcRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，質(zhì)粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcRⅠ的切割位點，但EcRⅠ的切割位點位于標(biāo)記基因中，用其切割會破壞標(biāo)記基因，因此為保證重組質(zhì)粒表達(dá)載體的準(zhǔn)確構(gòu)建，應(yīng)選用限制酶MunⅠ切割質(zhì)粒，A正確；由題干信息給出的兩種酶的識別序列可知，兩種限制酶切割后形成的黏性末端的堿基可以互補配對，B正確；限制酶的作用是使特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，并具有專一性，C正確；將重組質(zhì)粒同時用2種限制酶切割，標(biāo)記基因和目的基因中的EcRⅠ酶切割位點能被斷開，則會形成3種DNA片段，D錯誤。故選D。
2.下列有關(guān)基因工程中載體的說法正確的是(　　)A．在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B．所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C．質(zhì)粒是一種獨立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子D．作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因
解析:在基因工程中，天然的質(zhì)粒不能直接作為載體，需要進(jìn)行人工改造，A錯誤；不是所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體，質(zhì)粒用作載體的基本要求是具有一至多個限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點和具有標(biāo)記基因，B錯誤；細(xì)菌為原核生物，沒有染色體，質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的環(huán)狀DNA分子，C錯誤；作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進(jìn)行鑒別和選擇的標(biāo)記基因，D正確。故選D。
[對點訓(xùn)練]2．下圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)基因工程中載體的說法，錯誤的是(　　)
A．基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建B．基因表達(dá)載體的構(gòu)建并不一定相同C．圖中啟動子位于目的基因的首端，是核糖體識別和結(jié)合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因
解析:基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，A正確；由于受體細(xì)胞有植物、動物、微生物之分，這樣目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會有所差別，不可能是千篇一律的，B正確；啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，C錯誤。
1.切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(　　)2.限制酶只能用于切割目的基因(　　)3.限制酶也可以識別和切割RNA(　　)4.DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來(　　) DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(　　)6.載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因(　　)
1.(選擇性必修3 P67)基因工程：_________________________________________________________________________________________________。2.(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的　　　　　序列，并且使每一條鏈中特定部位的　　　　　斷開。3.選擇性必修3 P71“旁欄思考”：①原核生物中存在限制酶的意義是什么_____________________________________________________________________________.②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？____________________________________________________________________________________
按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦
予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品
原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。
4.(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于　　　　　　　　。
5.選擇性必修3 P72：DNA連接酶和DNA聚合酶　　(“是”“不是”)一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把單個的　　　　　連接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而　　　　　不需要模板。
6.不同種生物的基因能拼接的理論基礎(chǔ)是：__________________________________________________________________________________________________________________________。7.外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)的理論基礎(chǔ)是：________________________________________________________________________________________________________。
①DNA的基本組成單位都
是四種脫氧核苷酸；②DNA分子都遵循堿基互補配對原則；③雙鏈
DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)
狀的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能單位；②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則；
③生物界共用一套遺傳密碼
8.必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶　　(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把單個的　　　　　連接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而　　　　　不需要模板。
基因工程的基本操作程序
棉花植株(有抗蟲特性)
有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。
使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。
載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。
才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。
1.目的基因的篩選與獲取
在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。
根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如遇生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。
用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑，廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史
蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)
掌握了Bt基因的序列信息
對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物--對Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解
Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因
目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因、人干擾素基因等。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
注意：要保持基因的完整性
將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。
基因組文庫：含有一種生物的全部基因。
部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫。
提取某種生物的全部DNA
許多D一定大小的DNA片段
某種生物特定發(fā)育時期的mRNA
與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存
PCR的概念：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
以母鏈為模板進(jìn)行堿基互補配對
知識回顧---DNA復(fù)制過程
A T C G A A T C G G T T
U A C C T T A G C C A A
解旋酶(體外用高溫代替）
使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
體內(nèi)復(fù)制的引物為RNA單鏈。
一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
體外復(fù)制的引物一般為DNA單鏈。
緩沖液（含Mg2+)：激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶
緩沖液:提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境
復(fù)制的原料實為dNTP水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加ATP。
復(fù)制的原料實為dNTP,dNTP是脫氧核苷三磷酸的縮寫，N是指A、T、G、C四種含氮堿基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它們是由兩個磷酸分子和一個脫氧核苷酸組成的，其結(jié)構(gòu)簡式如下：
目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3’端，如此重復(fù)循環(huán)多次。 第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物……。
呈指數(shù)形式擴(kuò)增（ n次擴(kuò)增循環(huán)后，DNA數(shù)量約為2n）
a.n代后，DNA分子有_____個 b.n代后，DNA鏈有_____條c.第____代出現(xiàn)完整的目的基因 d.n代后，含引物的DNA分子有_____個e.n代后，共消耗_____個引物 f.第n代復(fù)制，消耗了______個引物g.n代后，完整的目的基因有_____個
四種脫氧核苷酸（dNTPs）
DNA在高溫下變性解旋
游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建
①操作目的：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有復(fù)制原點）
啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
mRNA上三個相鄰的堿基
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來
翻譯的起始信號（編碼氨基酸）
翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）
含有目的基因的DNA片段
同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割
帶有黏性末端（或平末端）的切口
帶有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段
重組DNA分子（重組質(zhì)粒）
基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖
3.將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞
①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—花粉管通道法
用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。
“轉(zhuǎn)化”概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。
農(nóng)桿菌生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。
①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
: 水稻、小麥、玉米…
含目的基因的重組Ti質(zhì)粒
目的基因插入染色體DNA中
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入，第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。
①將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞中方法--基因槍法
②將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞——顯微注射法
利用顯微注射將目的基因注入動物受精卵中（因為受精卵容易表現(xiàn)出全能性），這個受精卵將發(fā)育成具有新性狀的動物。將目的基因?qū)雱游锸芫炎钣行У姆椒ā?br/>將目的基因注射到動物受精卵中
（1）受體細(xì)胞：常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。 優(yōu)點：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)。
（2）Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）的一般過程
使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)
將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中
Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性
這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞
③將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法
原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。
4. 目的基因的檢測與鑒定
3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
1.檢測受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因
(1)首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；
(2)將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；
(3) 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。
基因探針:簡稱探針，是一段帶有檢測標(biāo)記（同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑），且順序已知的，與目的基因互補核酸序列(DNA或RNA)。
用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。
飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）
病毒（菌）感染（抗病接種實驗）
提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較
1.依次為EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制酶識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達(dá)載體示意圖，下列有關(guān)敘述正確的是(　　)
A．DNA片段被BamHⅠ、Sau3AⅠ酶切后可形成不同的黏性末端B．不能使用限制酶EcRⅠ、BamHⅠ獲取目的基因C．抗生素抗性基因可用于鑒別目的基因是否表達(dá)D．使用限制酶EcRⅠ、Sau3AⅠ切割質(zhì)?？煞乐棺陨憝h(huán)化
解析:DNA分子被BamHⅠ、Sau3AⅠ酶切后得到的黏性末端是相同的，A錯誤；使用EcRⅠ和BamHⅠ獲得的目的基因可整合到表達(dá)載體的啟動子和終止子之間，可用二者獲得目的基因，B錯誤；只要表達(dá)載體導(dǎo)入了受體細(xì)胞，受體細(xì)胞就是有抗藥性，目的基因是否表達(dá)，也需要進(jìn)一步鑒定，C錯誤；使用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割質(zhì)粒，由于黏性末端不同，可防止質(zhì)粒自身環(huán)化，D正確，故選D。
[對點訓(xùn)練]1．用XhⅠ和SalⅠ兩種限制性內(nèi)切核酸酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述錯誤的是(　　)
A．圖中兩種酶識別的核苷酸序列不同B．圖中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNAC．泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
2.2020年3月16日，中國科學(xué)家陳薇院士團(tuán)隊研制的重組新冠疫苗通過臨床研究注冊審評，獲批進(jìn)入臨床試驗。重組新冠疫苗的制備流程如圖?；卮鹣铝袉栴}。
(1)步驟②需要____________作為原料。步驟③需要的工具酶主要是________。(2)被用作載體的Ad5應(yīng)具有的特點是________________________________ ________________________________________(答出1點即可)。
能自我復(fù)制(或有一個或多個切割位點、有標(biāo)記基因位點、對受體細(xì)胞無害)
(3)步驟④是______________________。(4)重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白作為________，刺激機(jī)體產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗的志愿者需要滿足的條件之一是_____(填“有”或“無”)SARS－CV－2感染史，理由是_________________________ ______________________________________________________。(5)為探究疫苗的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果，需進(jìn)一步試驗，請寫出試驗思路：_______________________________________________________ _________________________。
有SARS－CV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相應(yīng)抗體，會對試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾
給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時間后采集血樣并檢測相應(yīng)抗體的水平
解析:(1)步驟②為逆轉(zhuǎn)錄過程，合成的產(chǎn)物是cDNA，因此需要脫氧核苷酸作為原料。步驟③為利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得S蛋白基因的過程，該過程需要的酶是Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶)。(2)Ad5作為載體應(yīng)具有的特點是能自我復(fù)制、有多個限制酶切割位點、有標(biāo)記基因、在宿主細(xì)胞中可以存活并表達(dá)、對宿主細(xì)胞無害等。(3)步驟④為構(gòu)建目的基因表達(dá)載體的過程，即重組新冠疫苗的過程。(4)重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白可作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫過程，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗的志愿者需要滿足無SARS－CV－2感染史的條件，即未感染過新冠病毒的志愿者，因為感染過新冠病毒的人體內(nèi)含有相應(yīng)的記憶細(xì)胞，若注射疫苗，則會出現(xiàn)二次免疫的特征，即體內(nèi)的記憶細(xì)胞會迅速增殖分化，產(chǎn)生大量的漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成并分泌大量的抗體，從而導(dǎo)致無法檢測出該疫苗的真正效果。(5)實驗?zāi)康臑樘骄恳呙绲淖⑸鋭┝繉χ驹刚弋a(chǎn)生的免疫效果，根據(jù)實驗?zāi)康目芍?，該實驗的自變量為疫苗的注射劑量，因變量為抗體產(chǎn)生量，因此設(shè)計實驗如下：將同性別且年齡相當(dāng)?shù)闹驹刚唠S機(jī)分成若干組，然后給不同組別的志愿者注射不同劑量的疫苗，一段時間之后，檢測志愿者體內(nèi)的抗體產(chǎn)生量，作好記錄并進(jìn)行比較、分析，從而得出結(jié)論。
[對點訓(xùn)練]2．通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，再經(jīng)純化可制得乙型肝炎疫苗?；卮鹣铝袉栴}：(1)人體接種乙型肝炎疫苗后，該疫苗可作為________刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗先后需要接種多次，其目的是__________________ ________________。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，則可以推測出相應(yīng)目的基因的核苷酸序列，但推測出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是________________________________________________________________ _______。
使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞
決定氨基酸的密碼子具有簡并性(或決定一種氨基酸的密碼子往往不是只有一種)
[對點訓(xùn)練]2．通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，再經(jīng)純化可制得乙型肝炎疫苗?；卮鹣铝袉栴}：(3)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞之前需要構(gòu)建基因表達(dá)載體，這一過程中需要的工具酶主要有___________________。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因應(yīng)該位于____________之間。(4)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞時，使該基因在酵母菌細(xì)胞中得以穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是____________________________________ _______________________________。
確保編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上
解析:(1)乙型肝炎疫苗可作為抗原引起人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗需先后接種多次的目的是使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞，以發(fā)揮最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密碼子具有簡并性，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推測出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，需要用限制酶切割目的基因片段與載體，再用DNA連接酶把目的基因與載體連接起來。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，啟動子和終止子分別是基因表達(dá)中轉(zhuǎn)錄起始和終止的調(diào)控序列，目的基因需要插在啟動子和終止子之間。(4)真核細(xì)胞分裂時細(xì)胞質(zhì)DNA隨機(jī)分配，應(yīng)將目的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上，以確保目的基因在酵母菌細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。
1.目的基因就是指編碼蛋白質(zhì)的基因(　　)2.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時需要設(shè)計兩種引物(　　)3.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時不必知道基因的全部序列(　　)4.抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體DNA上也未必能正常表達(dá)(　　)5.應(yīng)用PCR技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表達(dá)(　　)
1.選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”：Bt抗蟲蛋白基因產(chǎn)生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，腸道細(xì)胞也無特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生危害。
2.(選擇性必修3 P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供　　　　　、　　　　、4種　　　　　和耐高溫的　　　　　。
3.(選擇性必修3 P80)基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須含有　　　　　　　等。4.(選擇性必修3 P81)轉(zhuǎn)化：__________________________________________________________。
目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)
構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是___________________________________________________________________________________________。一個基因表達(dá)載體的組成包括_____________________________ 等。圖中抗生素抗性基因的作用是_____ ， 。
胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用
目的基因、啟動子、終止子及標(biāo)記
便于重組DNA分子的篩選
7.擇性必修3 P77“相關(guān)信息”：Bt抗蟲蛋白基因產(chǎn)生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，腸道細(xì)胞也無特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生危害。
DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
1、DNA的粗提取與鑒定
（1）利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。（2）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。
原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是，選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
供選材料：新鮮洋蔥（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、、獼猴桃（58）；豬肝（38）、魚卵、雞血（78）、哺乳動物的成熟紅細(xì)胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌（1）（括號內(nèi)為染色體條數(shù)）
原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮;選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
思考：能否選用新鮮的豬血作為提取DNA的材料？
NaCl溶液溶解DNA并鑒定 取兩支20mL的試管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。
溶液藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關(guān)
加入2ml/L氯化鈉溶液
2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實驗原理①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。
待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）。
真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。
可根據(jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時間
預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。
根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
①將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。
③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。
②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。
凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來
將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。
接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
注意事項　(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。 (2)每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
1.如圖是“DNA粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，相關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．圖1中溶液a是0.14 ml·L－1的NaCl溶液B．圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶C．圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯D．圖2試管1的作用是證明2 ml·L－1NaCl溶液遇二苯胺不會出現(xiàn)藍(lán)色
解析：圖1中溶液a是2 ml·L－1的NaCl溶液，A錯誤；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶，B正確；圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤(試管2中未將DNA溶于2 ml·L－1的NaCl溶液中)，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯，C正確；圖2試管1的作用是證明2 ml·L－1 NaCl溶液遇二苯胺不會出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。故選A。
[對點訓(xùn)練]1．實驗中對DNA進(jìn)行鑒定時，做如下操作：
(1)根據(jù)上圖，完成表格空白處的實驗內(nèi)容。(2)對于B試管，完成1、2、3的操作后溶液顏色如何變化？_____________________。(3)在沸水浴中加熱的目的是_____________，同時說明DNA對高溫有較強(qiáng)的________。(4)A試管在實驗中的作用______。(5)B試管中溶液顏色的變化程度主要與________________________有關(guān)。
DNA在沸水浴的情況下與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色
加入試管中的DNA(絲狀物)的多少
解析：與A試管相比，B試管中含DNA絲狀物，其他條件均完全相同，A、B兩試管形成對照。本實驗強(qiáng)調(diào)反應(yīng)條件是沸水浴加熱5 min，這樣可加快顏色反應(yīng)的速度，待試管冷卻后，再比較兩支試管中溶液顏色的變化。
2.下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是(　　)A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌B．PCR利用了DNA的熱變性原理C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
解析:為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌，A正確；PCR利用了DNA的熱變性原理，B正確；緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20 ℃儲存，使用前，將所需試劑從冰箱取出，放在冰塊上緩慢融化，C錯誤；在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，以免其他成分的污染，D正確。
[對點訓(xùn)練]2．以下為形成cDNA過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。據(jù)圖分析，下列說法正確的是(　　)
A．催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高溫B．催化①過程的酶是RNA聚合酶C．④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合D．如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%，則一個雙鏈DNA中，A與U之和也占該DNA堿基含量的40%
解析:題圖中②⑤過程均為DNA的復(fù)制，這兩個過程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤過程進(jìn)行的溫度是70～75 ℃，因此催化該過程的DNA聚合酶要能耐高溫，但催化②過程的酶不需要耐高溫，A錯誤；①為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，B錯誤；④為復(fù)性過程，該過程兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，C正確；DNA分子中不含堿基U，D錯誤。
1.在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍(lán)色(　　)2.DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精(　　)3.進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 ℃儲存(　　)4.在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(guān)(　　)5.為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實驗過程中不必更換(　　)
(源于選擇性必修3 P74)下圖為“DNA粗提取與鑒定”實驗的相關(guān)操作，請根據(jù)圖示分析其操作的目的是什么？
①析出DNA，除去溶于酒精的雜質(zhì)；②使DNA溶解在2 ml·L－1NaCl溶液中。
1．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：(1)常用的DNA連接酶有E·cli DNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中__________酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是________________________________________________________________________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能______________；質(zhì)粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是________________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動子，啟動子是指________________________________。
[答案]　(1)EcRⅠ、PstⅠ　EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制　一至多個限制酶切位點　用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程
解析：(1)限制酶EcRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割形成的是平末端，E·cli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E·cli DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達(dá)的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)啟動子是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得需要的蛋白質(zhì)。
2．(2021·全國甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是______________(用數(shù)字序號表示)。(2)操作③中使用的酶是________________，PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、____________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是__________________________________________________________________________________________。(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與__________________特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指________________________________________________________________________。
[答案]　(1)④②③①(2)Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)　延伸　Taq酶從引物起始進(jìn)行互補鏈的合成(3)兩條單鏈DNA(4)一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)
解析：(1)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴(kuò)增DNA片段→①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。(2)在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，操作③中使用的酶是Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)，PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性的結(jié)果是Taq酶從引物起始進(jìn)行互補鏈的合成。(3)DNA復(fù)制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。(4)據(jù)分析可知，PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
3．(2021·河北卷)采礦污染和不當(dāng)使用化肥導(dǎo)致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復(fù)技術(shù)將土壤中的Cd富集到植物體內(nèi)，進(jìn)行后續(xù)處理(例如，收集植物組織器官異地妥善儲存)，可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復(fù)能力，研究者將酵母液泡Cd轉(zhuǎn)運蛋白(YCF1)基因?qū)胧茉囍参?，并檢測了相關(guān)指標(biāo)。回答下列問題：(1)為獲取YCF1基因，將酵母細(xì)胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，這個群體稱為________。(2)將DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需要的兩種酶是______________。構(gòu)建的重組基因表達(dá)載體中必須含有標(biāo)記基因，其作用是________________________________________________________________________。(3)進(jìn)行前期研究時，將含有YCF1基因的重組載體導(dǎo)入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是________________。研究者進(jìn)一步獲得了轉(zhuǎn)YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實驗材料的目的是________________________________________________。(4)將長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據(jù)圖1可知，與野生型比，轉(zhuǎn)基因植株對Cd具有更強(qiáng)的________(填“耐性”或“富集能力”)；據(jù)圖2可知，對轉(zhuǎn)基因植株的________進(jìn)行后續(xù)處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。
[答案]　(1)基因組文庫(2)限制酶和DNA連接酶　便于目的基因的篩選和鑒定(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　避免目的基因在自然界中的擴(kuò)散(4)耐性　莖葉(5)YCF1可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中，提高了細(xì)胞液的濃度，有利于植株吸水　楊樹具有發(fā)達(dá)的根系和高大的樹冠，更適應(yīng)污染礦區(qū)等不良環(huán)境，同時可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運輸、利用
(5)已知YCF1特異定位于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的液泡膜上。據(jù)此分析，轉(zhuǎn)基因楊樹比野生型能更好地適應(yīng)高Cd環(huán)境的原因是______________________。相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復(fù)植物的優(yōu)勢在于____________________________________(寫出兩點即可)。
解析：(1)為獲取YCF1基因，將酵母細(xì)胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，這個群體含有酵母菌的全部基因，稱為基因組文庫。(2)將DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，需要用限制酶切割供體DNA和質(zhì)粒，以產(chǎn)生相同的黏性末端，然后用DNA連接酶進(jìn)行連接。基因表達(dá)載體中的標(biāo)記基因可用于目的基因的篩選和鑒定。(3)農(nóng)桿菌容易侵染雙子葉植物，其質(zhì)粒中的T－DNA可轉(zhuǎn)移并插入到受體細(xì)胞DNA中，將含有YCF1基因的重組載體導(dǎo)入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法?？紤]轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性，采用不育株系作為實驗材料，可避免目的基因在自然界中的擴(kuò)散。(4)根據(jù)分析可知，與野生型比，轉(zhuǎn)基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，說明轉(zhuǎn)基因植株在Cd污染的土壤中生長較好，即對Cd具有更強(qiáng)的耐性；據(jù)圖2分析，轉(zhuǎn)基因植株的莖、葉中Cd含量高于野生型，因此對轉(zhuǎn)基因植株的莖、葉進(jìn)行后續(xù)處理，可使轉(zhuǎn)基因植株持續(xù)發(fā)揮富集Cd的作用，對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。(5)YCF1特異定位于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的液泡膜上，可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中，提高了細(xì)胞液的濃度，有利于植株吸水，所以轉(zhuǎn)基因楊樹比野生型能更好地適應(yīng)高Cd環(huán)境。相較于草本植物，楊樹具有發(fā)達(dá)的根系和高大的樹冠，更適應(yīng)污染礦區(qū)等不良環(huán)境，同時可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運輸、利用，作為Cd污染土壤修復(fù)植物更具有優(yōu)勢。
4．(2020·山東卷)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強(qiáng)?？蒲腥藛T將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻，實現(xiàn)了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需的酶是________，重組載體進(jìn)入水稻細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為________________。(2)根據(jù)啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了________，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變，原因是________________________________________________________________________。(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達(dá)的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經(jīng)________過程獲得總cDNA。通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是__________________________________________________________。(4)各品系Wx mRNA量的檢測結(jié)果如圖所示，據(jù)圖推測糯性最強(qiáng)的品系為__________，原因是______________________________________________________________。
[答案]　(1)限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶　轉(zhuǎn)化(2)RNA聚合酶與啟動子的識別和結(jié)合　不發(fā)生　編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子(3)逆轉(zhuǎn)錄(或：反轉(zhuǎn)錄)　引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的(或：引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強(qiáng)

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