1.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。3.按照實(shí)驗(yàn)操作步驟，進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。
考點(diǎn)一　重組DNA技術(shù)的基本工具
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
考點(diǎn)三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
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重組DNA技術(shù)的基本工具
歸納 夯實(shí)必備知識(shí)
2.基因工程的誕生和發(fā)展(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間 。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和 的證明。(3)中心法則的確立。(4) 的破譯。(5)基因轉(zhuǎn)移載體和 的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶
(6) 體外重組的實(shí)現(xiàn)。(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。(8)DNA測(cè)序和合成技術(shù)的發(fā)明。(9) 技術(shù)的發(fā)明。(10) 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。
3.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)
(1)源于選擇性必修3 P71“旁欄思考”：①原核生物中存在限制酶的意義是什么？提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來(lái)病原物的危害。②限制酶來(lái)源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？提示　原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。
(2)源于選擇性必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶 (填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA連接酶連接的是 ，而DNA聚合酶是把單個(gè)的 連接到已有的DNA片段上。② 起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而 不需要模板。
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcRⅠ兩種限制酶。
構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需要選擇合適的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和載體。已知限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是 ，限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是 ，根據(jù)圖示分析回答下列問(wèn)題：
拓展 提升科學(xué)思維
(1)請(qǐng)用圖示法寫出限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ和限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的過(guò)程。
提示　限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ：
(2)切割圖示中的目的基因和質(zhì)粒應(yīng)選用哪類限制酶？請(qǐng)說(shuō)明理由。
提示　用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅰ的識(shí)別序列包含限制酶Ⅱ的識(shí)別序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位點(diǎn)，故使用限制酶Ⅱ時(shí)，可在目的基因兩端同時(shí)作切割，從而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，會(huì)同時(shí)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)“標(biāo)記基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。
1.下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是
突破 強(qiáng)化關(guān)鍵能力
注：Y為C或T，R為A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一種限制酶一定只能識(shí)別一種核苷酸序列
2.質(zhì)粒是基因工程中最常用的目的基因運(yùn)載工具。下列有關(guān)敘述正確的是A.質(zhì)粒是只存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中能自主復(fù)制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子B.在所有的質(zhì)粒上都能找到一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)C.攜帶目的基因的重組質(zhì)粒只有整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上才會(huì)隨 后者的復(fù)制而復(fù)制D.質(zhì)粒上的抗性基因常作為標(biāo)記基因供重組DNA的鑒定和選擇
與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞 或獲得預(yù)期 等的基因。(2)篩選合適的目的基因①?gòu)南嚓P(guān)的已知 的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用 和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。
(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕颉＂赑CR 和擴(kuò)增目的基因a.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù) 的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種 與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行 的技術(shù)。b.PCR反應(yīng)的條件：一定的 、DNA模板、2種 、4種______ 、 DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控 的儀器。
d.PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用 來(lái)鑒定。③通過(guò)構(gòu)建 來(lái)獲取目的基因。
(1)源于選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”：Bt抗蟲(chóng)蛋白基因產(chǎn)生的Bt抗蟲(chóng)蛋白只在某類昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈 ，腸道細(xì)胞也無(wú)特異性受體。因此，Bt抗蟲(chóng)蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害。(2)源于選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”：真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的 。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因 ，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用
在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代
提醒　啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
辨析　(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
4.目的基因的檢測(cè)與鑒定
PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。在該過(guò)程中，引物非常關(guān)鍵，回答下列有關(guān)引物的問(wèn)題：(1)什么是引物？提示　引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。(2)PCR技術(shù)為什么需要引物？提示　DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。
(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)需要兩種引物，原因是什么？提示　目的基因的兩條反向平行的鏈都作為模板，其堿基序列不同。(4)在PCR擴(kuò)增目的基因之前，需先設(shè)計(jì)引物，對(duì)設(shè)計(jì)的兩種引物之間的堿基序列的要求是什么？提示　兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)。(5)為檢測(cè)胚乳細(xì)胞中Wx基因是否表達(dá)，科研人員提取胚乳中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程獲得總cDNA，通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示　引物是依據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)。
(6)若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個(gè)引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個(gè)引物數(shù)？提示　經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)需要消耗引物數(shù)為(2n＋1－2)個(gè)，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個(gè)。
3.(2023·湖北宜昌高三模擬)大引物PCR定點(diǎn)突變常用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，過(guò)程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A.PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分 子上才能表達(dá)出相應(yīng)的性狀，需具備啟動(dòng)子、終 止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯B.單核苷酸的定點(diǎn)誘變所屬變異類型為基因突變C.第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產(chǎn)物DNA的兩條鏈D.利用該技術(shù)將某功能蛋白的結(jié)構(gòu)改變屬于蛋白質(zhì)工程
4.下圖表示培育轉(zhuǎn)基因抗植物病毒番茄的過(guò)程示意圖。下列敘述正確的是
A.過(guò)程A需要限制酶和DNA聚合酶的參與B.過(guò)程B需要用CaCl2處理，以提高番茄細(xì)胞細(xì)胞壁的通透性C.抗植物病毒基因一旦整合到番茄細(xì)胞的染色體上，就能正常表達(dá)D.轉(zhuǎn)基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通過(guò)抗病毒接種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定
(1)PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
(2)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定(1)基本原理
注意　加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)①PCR原理：利用了 原理。②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷 的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的 等有關(guān)。
(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟
(3)DNA的電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為_(kāi)_____的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。
1.在“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)中，防止DNA被污染的操作有哪些？提示　(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。(2)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。(3)在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。
2.如何來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果？提示　觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。
5.(2023·江蘇蘇州高三期末)下列以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是A.洋蔥研磨液需要用濾紙過(guò)濾，以保證提取的DNA量B.濾液中加入冷酒精后，用玻璃棒攪拌會(huì)使DNA的提取量增加C.向含DNA的濾液中加入2 ml/L的NaCl溶液有利于去除雜質(zhì)D.用二苯胺試劑鑒定DNA時(shí)，需沸水浴加熱冷卻后再觀察顏色變化
洋蔥研磨液要用紗布過(guò)濾，A錯(cuò)誤；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白質(zhì)在冷酒精中的溶解度較高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提純DNA，但提取量不變，B錯(cuò)誤；向含DNA的濾液中加入預(yù)冷的酒精溶液有利于去除雜質(zhì)，加入2 ml/L的NaCl溶液是溶解粗提取的DNA，C錯(cuò)誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，用二苯胺試劑鑒定DNA時(shí)，需沸水浴加熱，冷卻后再觀察顏色變化，D正確。
6.下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖。下列相關(guān)敘述不正確的是A.選用植物細(xì)胞提取DNA時(shí)需先 研磨破碎細(xì)胞B.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯 錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯C.圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精D.圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺試 劑出現(xiàn)藍(lán)色
圖2所示實(shí)驗(yàn)的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導(dǎo)致加熱不充分，試管2中藍(lán)色變化不明顯，B正確；圖2試管1起對(duì)照作用，目的是證明沸水浴下物質(zhì)的量濃度為2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，而DNA遇二苯胺試劑出現(xiàn)藍(lán)色，D錯(cuò)誤。
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1.(2021·湖北，16)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是A.增加模板DNA的量 B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度
增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯(cuò)誤；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延長(zhǎng)延伸的時(shí)間會(huì)影響變性、延伸過(guò)程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，B、C錯(cuò)誤。
2.(2019·江蘇，10)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B.DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C.預(yù)冷的酒精可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNAD.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱
哺乳動(dòng)物(如兔)成熟的紅細(xì)胞中無(wú)細(xì)胞核和眾多細(xì)胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料，A錯(cuò)誤；為防止DNA斷裂，在DNA析出過(guò)程中攪拌操作要輕柔且沿著一個(gè)方向，B正確；DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精溶液，預(yù)冷的酒精溶液可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色，因此，用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱，D正確。
3.(2020·北京，12)為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹(shù)中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹(shù)基因組中(如圖)。
A.①＋③ B.①＋②C.③＋② D.③＋④
為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是
引物①擴(kuò)增的片段含有啟動(dòng)子和HMA3基因，引物③擴(kuò)增的片段不含啟動(dòng)子，引物②擴(kuò)增的片段既含有啟動(dòng)子，又含有HMA3基因序列。圖示
中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹(shù)基因組中，若要檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因和高效啟動(dòng)子，需要檢測(cè)是否含有高效啟動(dòng)子序列和HMA3基因序列，應(yīng)選擇的引物組合是①＋②，B正確。
4.(2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異?？梢鸲喾N疾病。因此，研究纖毛形成的作用機(jī)制具有重要意義。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)纖毛結(jié)構(gòu)如圖Ⅰ所示，由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由______________組成?；w由中心體轉(zhuǎn)變而來(lái)，中心體在有絲分裂中的功能是_______________________。
(2)某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異，對(duì)基因X進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測(cè)序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí)，可通過(guò)交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來(lái)，溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是
__________。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在__________________________________催化下，在引物____端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序。
耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí)，可通過(guò)交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來(lái)，DNA在2.0 ml/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于這一濃度，DNA的溶解度均會(huì)下降，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加NaCl至2.0 ml/L的
目的是溶解DNA。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在TaqDNA聚合酶的催化下，在引物的3′端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序。
(3)為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X－GFP基因融合片段M導(dǎo)入如圖Ⅱ所示載體質(zhì)粒Y，構(gòu)建Y－M重組質(zhì)粒(在EcRV位點(diǎn)插入片段)。
X蛋白參與中心體的形成
PCR擴(kuò)增目的DNA片段時(shí)，在引物的3′端進(jìn)行DNA鏈的延伸，據(jù)圖可知，應(yīng)選擇圖Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的產(chǎn)物約為300＋800＝1 100(bp)。
為確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcR V的識(shí)別序列，下游含有EcR V＋BamH Ⅰ的識(shí)別序列，根據(jù)題干信息構(gòu)建Y－M重組質(zhì)粒(在EcRV位點(diǎn)插入片段)，Y－M的連接處測(cè)序后部分序列應(yīng)含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)，
根據(jù)各限制酶識(shí)別位點(diǎn)，應(yīng)選擇序列Q3。對(duì)照質(zhì)粒Y－GFP(僅表達(dá)GFP)與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y－M分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光，而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說(shuō)明蛋白質(zhì)X參與中心體的組成。
(4)為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測(cè)健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)_______形成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù))。從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的____倍。
研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測(cè)健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù))，說(shuō)明病人基因Z表達(dá)較弱，設(shè)健康人Z基因的cDNA數(shù)為x，病人Z基因的cDNA數(shù)為y，則有x×215＝y(tǒng)×220，從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的25＝32(倍)。
1.判斷關(guān)于基因工程的基本工具的敘述(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)(2)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列(　　)(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(　　)(4)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因(　　)
2.判斷關(guān)于基因工程的基本操作程序的敘述(1)根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，但都是能編碼蛋白質(zhì)的基因(　　)(2)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制(　　)(3)表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均啟動(dòng)于復(fù)制原點(diǎn)(　　)(4)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了使DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)(　　)
3.判斷關(guān)于DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定的敘述(1)進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)所需的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 ℃條件下儲(chǔ)存(　　)(2)在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(guān)(　　)(3)為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不必更換(　　)(4)DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，遇甲紫會(huì)呈現(xiàn)紅色(　　)
4.填空默寫(1)(選擇性必修3 P67)基因工程：_______________________________________________________________________________________________________。(2)(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的 序列，并且使每一條鏈中特定部位的 斷開(kāi)。(3)(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于________________ 。
按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品
(4)(選擇性必修3 P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供 、 、4種 和耐高溫的 。(5)(選擇性必修3 P80)基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須含有 等。(6)(選擇性必修3 P81)轉(zhuǎn)化：_______________________________________ 。
目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞
內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程
一、選擇題1.(2023·江蘇宿遷高三質(zhì)檢)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關(guān)的酶作用位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是
A.甲、乙、丙都屬于黏性末端B.甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能C.DNA連接酶的作用位點(diǎn)在圖乙中b處D.切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
2.T4 DNA連接酶可將任意2個(gè)具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應(yīng)過(guò)程需消耗ATP，其水解產(chǎn)生的腺苷一磷酸(AMP)通過(guò)共價(jià)鍵與酶相連，隨后AMP轉(zhuǎn)移至DNA片段，進(jìn)而完成連接反應(yīng)。下列敘述正確的是A.T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無(wú)專一性B.T4 DNA連接酶催化反應(yīng)后，其組成成分已改變C.ATP在該反應(yīng)過(guò)程中可能打開(kāi)兩個(gè)特殊的化學(xué)鍵D.T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
3.(2023·安徽亳州高三檢測(cè))基因工程利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA。限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點(diǎn)分別如圖所示。下列分析錯(cuò)誤的是
A.構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用BglⅡ和 Sau3AⅠ切割目的基因所在片段 和P1噬菌體載體B.構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體C.圖乙中的P1噬菌體載體只用EcRⅠ切割后，含有兩個(gè)游離的磷酸基團(tuán)D.用EcRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只 能產(chǎn)生一種重組DNA
4.下列有關(guān)獲取目的基因的敘述，錯(cuò)誤的是A.目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因B.篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步C.來(lái)自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的目的基因D.序列比對(duì)工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)
5.(2023·河北石家莊高三模擬)如圖是快速RT－PCR過(guò)程示意圖，①和②為逆轉(zhuǎn)錄酶催化的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，③是PCR過(guò)程。據(jù)圖分析，下列敘述錯(cuò)誤的是
A.逆轉(zhuǎn)錄酶具有DNA聚合酶的能力B.③PCR過(guò)程只需要引物bC.RT－PCR可檢測(cè)基因表達(dá)水平D.RT－PCR可檢測(cè)新冠病毒等RNA病毒
6.(2022·山東，13)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
7.(2023·江蘇泰州高三調(diào)研)引物的設(shè)計(jì)是影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性的關(guān)鍵因素，下列相關(guān)敘述正確的是A.引物的堿基數(shù)量越少則退火溫度越低、目標(biāo)DNA獲得率越高B.根據(jù)需要可在引物的5′端添加限制酶識(shí)別序列、點(diǎn)突變序列等C.兩種引物的退火溫度差異較大，可減少引物與模板的非特異性結(jié)合D.引物的GC含量越高，結(jié)合特異性越強(qiáng)，越利于目標(biāo)DNA的擴(kuò)增
8.DNA瓊脂糖凝膠電泳是指利用在溶液中帶負(fù)電荷的DNA分子在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)的原理，分離、純化或分析PCR擴(kuò)增后的待檢DNA片段的生物化學(xué)技術(shù)。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.DNA片段相對(duì)分子質(zhì)量越大，遷移就越慢B.凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結(jié)合，用于分離后DNA片段的檢測(cè)C.擬回收的DNA區(qū)帶融化后可先用DNA抽取劑抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽 提DNA片段，從而提高回收率D.新冠病毒核酸檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因可能是陽(yáng)性對(duì)照中模板核酸與樣品交叉 污染
9.(2023·江蘇揚(yáng)州高三質(zhì)檢)實(shí)時(shí)熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理：在PCR復(fù)性過(guò)程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過(guò)程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程如圖所示。
下列說(shuō)法不正確的是A.做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B.RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA 后再進(jìn)行擴(kuò)增C.若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說(shuō)明被檢測(cè)者沒(méi)有感染病毒D.病毒的檢測(cè)還可以檢測(cè)病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原 理都是抗原—抗體雜交
PCR擴(kuò)增必須以DNA為模板，RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，所以需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增，B正確；若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說(shuō)明被檢測(cè)者極有可能感染了病毒，C錯(cuò)誤。
10.(2023·江西南昌高三模擬)下圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列敘述錯(cuò)誤的是
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因；TetR：四環(huán)素抗性基因。A.應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶GB.所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的是含重組質(zhì)粒的受體菌D.同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，電泳后可得到4個(gè)條帶
為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化，又保留質(zhì)粒上的標(biāo)記基因，切割時(shí)應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A正確；
所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對(duì)含有目的基因的受體菌進(jìn)行選擇，B正確；用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的有導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌和導(dǎo)入原質(zhì)粒的受體菌，C錯(cuò)誤；
據(jù)題圖分析可知，同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，因酶E有兩個(gè)作用位點(diǎn)，故將質(zhì)粒切割成了4個(gè)DNA片段，電泳后可得到4個(gè)條帶，D正確。
11.(2023·江蘇南京師大附中高三調(diào)研)載體是基因工程中攜帶外源DNA片段(目的基因)進(jìn)入受體細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見(jiàn)的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。如圖是利用細(xì)菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，
下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A.重組載體A、重組載體B分別是基 因克隆載體和基因表達(dá)載體B.載體A和載體B都必須含有限制酶 切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因C.必須把目的基因插入重組載體A的 啟動(dòng)子和終止子之間D.培養(yǎng)細(xì)菌A和細(xì)菌B的培養(yǎng)基在營(yíng) 養(yǎng)成分和功能上有明顯差異
培養(yǎng)細(xì)菌A的目的是擴(kuò)增目的基因，不需要獲得表達(dá)產(chǎn)物，因此目的基因不一定要插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間，C錯(cuò)誤；培養(yǎng)細(xì)菌A的目的是擴(kuò)增目的基因，培養(yǎng)細(xì)菌B的目的是獲得胰島素，因此培養(yǎng)兩者的培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)成分和功能上有明顯差異，D正確。
二、非選擇題12.如圖pIJ702是一種常用質(zhì)粒，其中tsr為硫鏈絲菌素(一種抗生素)抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而三種限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分別只有一處識(shí)別序列。回答下列問(wèn)題：
注：“＋”表示生長(zhǎng)；“－”表示不生長(zhǎng)。
(1)限制酶可以識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的___________斷裂，切割形成的末端有__________________兩種。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，與質(zhì)粒pIJ702上長(zhǎng)度為0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段進(jìn)行置換，構(gòu)建重組質(zhì)粒pZHZ8。上述兩種質(zhì)粒經(jīng)限制酶BglⅡ酶切后所得片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。由此判斷目的基因的片段長(zhǎng)度為_(kāi)_____kb，判定目的基因中含有一個(gè)BglⅡ切割位點(diǎn)的理由是_________________________________________________________________________________________。
pIJ702上的原有BglⅡ切割位點(diǎn)被目的基因置換得到的環(huán)狀pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一條線段
質(zhì)粒pIJ702的長(zhǎng)度為5.7 kb，而重組質(zhì)粒pZHZ8的長(zhǎng)度為6.7 kb，又已知構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因置換了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判斷目的基因的片段長(zhǎng)度為6.7－5.7＋0.4＝1.4(kb)。
(3)導(dǎo)入目的基因時(shí)，首先用Ca2＋處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)(能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))細(xì)胞，再將重組質(zhì)粒pZHZ8溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下可以促進(jìn)鏈霉菌完成______過(guò)程。
(4)不含質(zhì)粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況如表2所示。若要篩選導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌細(xì)胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應(yīng)在____μg/mL以上，挑
選成功導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是___________________________________________________________________________________________________。若要檢測(cè)整合到染色體DNA上的目的基因是否發(fā)揮功能作用，第一步需檢測(cè)受體細(xì)胞的_______(填“DNA”或“RNA”)。
根據(jù)導(dǎo)入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點(diǎn)，通過(guò)觀察菌落的顏色進(jìn)行挑選
從不含質(zhì)粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況表格可以看出，硫鏈絲菌素濃度低于5 μg/mL時(shí)，鏈霉菌能夠生長(zhǎng)，因此所需的硫鏈絲菌素最小濃度應(yīng)為5 μg/mL。檢測(cè)目的基因是否
發(fā)揮功能作用的第一步是目的基因是否能轉(zhuǎn)錄形成mRNA。
13.(2021·江蘇，23)某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒，請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問(wèn)題：
(1)目的基因的擴(kuò)增①提取真菌細(xì)胞______，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M，設(shè)計(jì)引物P2時(shí)，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致______________________。
③熱啟動(dòng)PCR可提高擴(kuò)增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開(kāi)始PCR擴(kuò)增。下列敘述正確的有_____。A.TaqDNA聚合酶最適催化溫度范圍為50～60 ℃B.與常規(guī)PCR相比，熱啟動(dòng)PCR可減少反應(yīng)起始時(shí)引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物C.兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸D.PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了TaqDNA聚合酶的特異性
(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建①將SmaⅠ切開(kāi)的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)_______________________，形成A－m結(jié)合體。將A－m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。
②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A－m仍能被SmaⅠ切開(kāi)，則SmaⅠ的酶切位點(diǎn)可能在_____________________________。
(3)融合蛋白的表達(dá)①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入質(zhì)粒A－m，然后涂布于無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機(jī)理是______________________________________________________________________________________。
受體菌在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因，可以長(zhǎng)成菌落
②若通過(guò)抗原－抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，說(shuō)明________________________________________，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。
合基因表達(dá)(或重組質(zhì)粒A－m構(gòu)建成功)
14.如圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的實(shí)驗(yàn)流程。所用的pBR322質(zhì)粒含有限制酶PstⅠ、EcRⅠ和Hind Ⅲ的切點(diǎn)各一個(gè)，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)回答以下相關(guān)問(wèn)題：
(1)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有_________的因子。過(guò)程①所用到的組織細(xì)胞是_______________，③過(guò)程的目的是_________________________，⑤過(guò)程常用_____處理大腸桿菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行切割，形成的DNA片段種類有____種，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有____種和____種。

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