1.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三 種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載 體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。3.按照實(shí)驗(yàn)操作步驟，進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行 虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。
考點(diǎn)一　重組DNA技術(shù)的基本工具
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
考點(diǎn)三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
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重組DNA技術(shù)的基本工具
1.基因工程的概念(1)手段：按照　　　　　，通過(guò)　　　等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的　　　　和　　　　。(3)水平：　　水平。由于在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工，因此又叫作　　　　技術(shù)。
梳理歸納 夯實(shí)必備知識(shí)
2.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性?xún)?nèi)切核酸酶(也稱(chēng)“限制酶”)
(1)源于選擇性必修3 P71“旁欄思考”：①原核生物中存在限制酶的意義是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來(lái)病原物的危害。
②限制酶來(lái)源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？
提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。
(2)源于選擇性必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶　　(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把單個(gè)的　　　　　連接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而　　　　　不需要模板。
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcRⅠ兩種限制酶。
考向一　限制酶和DNA連接酶1.(2022·長(zhǎng)春市高三期中)下表為常用的限制性?xún)?nèi)切核酸酶(限制酶)及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷以下說(shuō)法中，錯(cuò)誤的是
考向突破 強(qiáng)化關(guān)鍵能力
注：Y為C或T，R為A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一種限制酶一定只能識(shí)別一種核苷酸序列
2.第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質(zhì)粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，且可持續(xù)一段時(shí)間。限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切點(diǎn)分別是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯(cuò)誤的是A.構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可用BglⅡ和　Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒B.圖乙中只用EcRⅠ切割后的質(zhì)粒，含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)C.用EcRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，只產(chǎn)生1種連　接產(chǎn)物D.抗原基因在體內(nèi)表達(dá)時(shí)不需要解旋酶
考向二　基因工程載體的應(yīng)用3.質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說(shuō)法正確的是A.質(zhì)粒不僅存在于細(xì)菌中，也存在于某些病毒中B.細(xì)菌的基因只存在于質(zhì)粒上C.質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子D.質(zhì)粒是基因工程中的重要工具酶之一
4.下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法，正確的是A.在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B.所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C.質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子D.作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記　基因
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞　　或獲得預(yù)期　　　　等的基因。(2)篩選合適的目的基因①?gòu)南嚓P(guān)的已知　　　　　　　的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用　　　　　和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣伞　　　　＂诔Ｓ谩　√禺愋缘乜焖贁U(kuò)增目的基因
PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
(1)在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成　　　　　的原料，又可為DNA的合成提供　　。(2)引物既可以是DNA單鏈，也可以為　　　　　。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要　　，一般為RNA片段。(3)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加　　　。
(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
　　源于選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”：Bt抗蟲(chóng)蛋白基因產(chǎn)生的Bt抗蟲(chóng)蛋白只在某類(lèi)昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，腸道細(xì)胞也無(wú)特異性受體，因此，Bt抗蟲(chóng)蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用
在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代
RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)
翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)
翻譯的結(jié)束信號(hào)(不編碼氨基酸)
啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持__________的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是　　　　。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入，第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的　　　　上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的　　　　　　上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入　　　，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入　　　　。
(3)農(nóng)桿菌特點(diǎn)①能在自然條件下侵染　　　　　和　　　　，而對(duì)大多數(shù)___________沒(méi)有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有　　　，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。
4.目的基因的檢測(cè)與鑒定
考向一　目的基因的獲取5.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測(cè)基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述，錯(cuò)誤的是A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過(guò)程中，雙鏈DNA的解開(kāi)不需要解旋酶C.復(fù)性過(guò)程中，引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則D.延伸過(guò)程中，需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸
6.利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變可以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行合理性改造，其過(guò)程如下圖所示。下列分析不正確的是A.PCR1過(guò)程中的產(chǎn)物AB是依賴(lài)引物a和引　物b擴(kuò)增的結(jié)果B.引物c和引物b上均含有與模板鏈不能互　補(bǔ)的堿基C.①過(guò)程需要先加熱至90 ℃以上后再冷卻　至50 ℃左右D.②過(guò)程需要利用引物a和引物d獲得突變　產(chǎn)物AD
考向二　基因工程的基本操作程序7.(2022·云南高三聯(lián)考)戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(pORF2)位于病毒表面，構(gòu)成病毒的衣殼。我國(guó)科研人員利用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過(guò)程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述，正確的是A.過(guò)程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是　A、U、G、CB.重組基因表達(dá)載體上的啟動(dòng)子需來(lái)源于戊型肝炎病毒C.過(guò)程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中　DNA分子的生理狀態(tài)D.過(guò)程⑥大量制備pORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測(cè)與鑒定
8.某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過(guò)程，如下圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是_______；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱(chēng)為_(kāi)________。該方法中農(nóng)桿菌的作用是______________________________________________________。
基因插入到煙草細(xì)胞的染色體DNA上
(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是____________________________________________________________________。
基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率
(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長(zhǎng)繁殖，農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。為什么？__________________________________________。
含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞
(4)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作，篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后，用無(wú)菌牙簽挑取A上的單個(gè)菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長(zhǎng)狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請(qǐng)?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來(lái)。
DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定(1)基本原理①原理：利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在　　　　　　　方面的差異，提取DNA，去除其他成分。②DNA的性質(zhì)：DNA不溶于　　，但某些蛋白質(zhì)溶于　　；DNA能溶于2 ml·L－1的　　　　　。③DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇　　　試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。
基礎(chǔ)提煉 通讀實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要　　，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)①PCR原理：利用了　　　　　　原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷　　的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的　　　　　等有關(guān)。
(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟
(3)DNA的電泳鑒定
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行　　　　處理。(2)每吸取一種試劑后，移液器上的　　都必須更換。(3)電泳時(shí)，DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量越大，受到的阻力越　，遷移速率越　，DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量越小，受到的阻力越　，遷移速率越　。
考向一　DNA的粗提取與鑒定9.下列利用洋蔥進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是A.將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過(guò)濾，要棄去上清液B.采用體積分?jǐn)?shù)為95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分雜質(zhì)C.用塑料離心管是因?yàn)橛貌Ａщx心管容易破損D.將白色絲狀物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后振蕩，觀察顏色　變化
10.下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖。下列相關(guān)敘述不正確的是A.選用植物細(xì)胞提取DNA時(shí)需先　研磨破碎細(xì)胞B.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明　顯錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)　色變化不明顯C.圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精D.圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺試　劑出現(xiàn)藍(lán)色
考向二　DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定11.利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增，下列有關(guān)“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)敘述，錯(cuò)誤的是A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高　壓蒸汽滅菌處理B.PCR利用了DNA的熱變性原理C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的　槍頭都必須更換
12.下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是A.電泳是指帶電分子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程B.待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA在電　泳中的遷移速率C.進(jìn)行電泳時(shí)，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D.PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定
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1.(2019·江蘇，10)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B.DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C.預(yù)冷的酒精可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNAD.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱
2.(2020·北京，12)為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹(shù)中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹(shù)基因組中(如圖)。為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是A.①＋③ 　　　B.①＋②C.③＋② 　　　D.③＋④
3.(2021·山東，25)人類(lèi)γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過(guò)改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。
(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要____種酶。
(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光的原因是___________________________________________________。
F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)
(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，
據(jù)此結(jié)果可推測(cè)， BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于______________________________________________，理由是_________________________________________________________________________________
F1～ F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上
引物F4與F5在調(diào)控序
根據(jù)有無(wú)熒光情況判斷，
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上
一、易錯(cuò)辨析1.限制酶也可以識(shí)別和切割RNA(　　)2.DNA連接酶能將兩堿基通過(guò)氫鍵連接起來(lái)(　　)連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(　　)4.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要設(shè)計(jì)兩種引物(　　)5.DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精(　　)6.在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(guān)(　　)
二、填空默寫(xiě)1.(選擇性必修3 P67)基因工程：___________________________________________________________________________________________________。2.(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的　　　　　序列，并且使每一條鏈中特定部位的　　　　　斷開(kāi)。3.(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于　　　　　　　　　。4.(選擇性必修3 P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供　　　　　、　　　　、4種　　　　　和耐高溫的　　　　　。
按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦
予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品
5.(選擇性必修3 P80)基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須含有　　　　　　　等。6.(選擇性必修3 P81)轉(zhuǎn)化：_____________________________________________________________。
目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)
一、選擇題1.若要利用某目的基因(見(jiàn)圖甲)和P1噬菌體載體(見(jiàn)圖乙)構(gòu)建重組DNA(見(jiàn)圖丙)，限制性?xún)?nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是
A.用EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體B.用BglⅡ和EcRⅠ切割目的基因和P1噬　菌體載體C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬　菌體載體D.用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體
2.農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒是植物基因工程中常用的載體，下列相關(guān)敘述正確的是A.Ti質(zhì)粒是能夠自主復(fù)制的單鏈DNAB.Ti質(zhì)粒中磷酸基團(tuán)都與兩個(gè)脫氧核糖相連接C.重組Ti質(zhì)粒的受體細(xì)胞只能是植物愈傷組織細(xì)胞D.Ti質(zhì)粒上的基因可全部整合到受體細(xì)胞染色體上
3.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類(lèi)似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是A.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基　因的全部序列B.設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基　互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連C.復(fù)性溫度過(guò)高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物D.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為　15/16
4.(2022·北京高三一模)下圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列敘述錯(cuò)誤的是
A.應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶GB.所選用的受體菌不能含有AmpR和　TetR基因C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出　含重組質(zhì)粒的受體菌D.同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，電泳后可得到4個(gè)條帶
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因，TetR：四環(huán)素抗性基因
5.科學(xué)家將馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因Pin－Ⅱ?qū)霔顦?shù)細(xì)胞，培育成了抗蟲(chóng)楊樹(shù)。下圖表示含目的基因的DNA分子和農(nóng)桿菌質(zhì)粒，圖中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，NeR表示新霉素抗性基因，箭頭表示識(shí)別序列完全不同的4種限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述不正確的是A.目的基因插入到質(zhì)粒的T－DNA上，才　能整合到受體細(xì)胞染色體中B.為使目的基因與質(zhì)粒高效重組，最好選　用EcRⅠ和PstⅠC.成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)為不抗氨芐青霉素、抗新霉素D.可用PCR等技術(shù)或抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否表達(dá)
6.(2022·揚(yáng)州市高三期中)實(shí)時(shí)熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理是：在PCR復(fù)性過(guò)程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過(guò)程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是
A.做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B.RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA　后再進(jìn)行擴(kuò)增C.若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說(shuō)明被檢測(cè)者沒(méi)有感染病毒D.病毒的檢測(cè)還可以檢測(cè)病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原　理都是抗原—抗體雜交
7.一種雙鏈DNA分子被三種不同的限制酶切割，切割產(chǎn)物通過(guò)電泳分離，用大小已知的DNA片段的電泳結(jié)果作為分子量標(biāo)記(下圖左邊一列)。關(guān)于該雙鏈DNA，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)B.分子質(zhì)量大小為10 kbC.有一個(gè)NtⅠ和兩個(gè)EcRⅠ切點(diǎn)D.其N(xiāo)tⅠ切點(diǎn)與EcRⅠ切點(diǎn)的最短距離　為2 kb
8.科學(xué)家將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲(chóng)蛋白基因(抗蟲(chóng)基因)導(dǎo)入棉花的愈傷組織細(xì)胞，鑒定后，將含抗蟲(chóng)基因的受體細(xì)胞組織培養(yǎng)獲得棉花植株。經(jīng)棉鈴蟲(chóng)飼喂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)棉花植株并無(wú)抗蟲(chóng)性狀，科學(xué)家提取棉花葉片細(xì)胞中的有關(guān)成分進(jìn)行了如下操作，下列分析錯(cuò)誤的是A.提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，采用抗原—抗體雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，若能檢測(cè)到Bt抗　蟲(chóng)蛋白，則可能是抗蟲(chóng)基因表達(dá)效率低B.若經(jīng)A檢測(cè)確定細(xì)胞中無(wú)Bt抗蟲(chóng)蛋白，可采用核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中的　RNA，若測(cè)到Bt抗蟲(chóng)蛋白的mRNA，則可能是抗蟲(chóng)基因能轉(zhuǎn)錄，但不能正常翻譯C.若經(jīng)B檢測(cè)確定細(xì)胞中無(wú)Bt抗蟲(chóng)蛋白的mRNA，可采用核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)　胞中的DNA，若能檢測(cè)到抗蟲(chóng)基因，則可能是抗蟲(chóng)基因反向插入載體DNA分子中D.若經(jīng)C檢測(cè)確定細(xì)胞中無(wú)抗蟲(chóng)基因，則可能只是載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞
9.某線(xiàn)性DNA分子含有5 000個(gè)堿基對(duì)(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列敘述不正確的是
A.a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵相同B.a酶與b酶切出的黏性末端能相互連接C.僅用b酶切割，則得到2個(gè)DNA分子產(chǎn)物D.限制酶將一個(gè)DNA分子片段切成兩個(gè)片段需消耗兩個(gè)水分子
10.熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成(如圖)。Ct值(循環(huán)閾值)的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說(shuō)法不正確的是A.檢測(cè)新冠病毒時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA　轉(zhuǎn)化為cDNAB.PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)合)、延　伸3個(gè)階段C.Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高D.若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，檢測(cè)結(jié)果可能為陰性
11.某中學(xué)生物興趣小組進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定時(shí)，選取如下實(shí)驗(yàn)材料：新鮮花椰菜、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精、研磨液(含表面活性劑SDS、DNA酶抑制劑EDTA、適量的NaCl)、0.015 ml·L－1的NaCl溶液、二苯胺試劑、蒸餾水以及其他必要實(shí)驗(yàn)器材。下列有關(guān)選擇實(shí)驗(yàn)材料的理由，敘述不正確的是A.新鮮的花椰菜DNA含量豐富，易獲取B.SDS具有瓦解植物細(xì)胞膜的作用C.DNA溶于冷酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶D.EDTA可減少提取過(guò)程DNA的降解
12.缺乏維生素A容易導(dǎo)致夜盲癥或營(yíng)養(yǎng)不良，甚至能夠威脅到生命。而β-胡蘿卜素可以在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化成維生素A?？茖W(xué)家嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)富含β-胡蘿卜素的大米。八氫番茄紅素合酶(其基因用psy表示)和胡蘿卜素脫飽和酶(其基因用crtI表示)參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構(gòu)酶基因，它編碼的蛋白質(zhì)可使細(xì)胞在特殊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。根據(jù)以上信息分析，下列敘述錯(cuò)誤的是A.pmi基因作為標(biāo)記基因可以鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因B.psy基因和crtI基因的序列中可以含有用到的限制酶的識(shí)別序列C.可通過(guò)基因槍法將目的基因?qū)胨镜氖荏w細(xì)胞D.PCR技術(shù)不能檢測(cè)目的基因是否表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)
二、非選擇題13.如圖pIJ702是一種常用質(zhì)粒，其中tsr為硫鏈絲菌素(一種抗生素)抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而三種限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分別只有一處識(shí)別序列?；卮鹣铝袉?wèn)題：
注：“＋”表示生長(zhǎng)；“－”表示不生長(zhǎng)。
(1)限制酶可以識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的___________斷裂，切割形成的末端有_________________兩種。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，與質(zhì)粒pIJ702上長(zhǎng)度為0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段進(jìn)行置換，構(gòu)建重組質(zhì)粒pZHZ8。上述兩種質(zhì)粒經(jīng)限制酶BglⅡ酶切后所得片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。由此判斷目的基因的片段長(zhǎng)度為_(kāi)___kb，判定目的基因中含有一個(gè)BglⅡ切割位點(diǎn)的理由是___________________________________________________________________________________。
pIJ702上的原有BglⅡ切
割位點(diǎn)被目的基因置換得到的環(huán)狀pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一條線(xiàn)段
(3)導(dǎo)入目的基因時(shí)，首先用Ca2＋處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)(能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))細(xì)胞，再將重組質(zhì)粒pZHZ8溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下可以促進(jìn)鏈霉菌完成_____過(guò)程。
(4)不含質(zhì)粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況如表2所示。若要篩選導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌細(xì)胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應(yīng)在___μg/mL以上，挑選成功導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是____________________________________________________________________________________________________。若要檢測(cè)整合到染色體DNA上的目的基因是否發(fā)揮功能作用，第一步需檢測(cè)受體細(xì)胞的______(填“DNA”或“RNA”)。
pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點(diǎn)，通過(guò)觀察菌落的顏色進(jìn)行挑選
14.(2022·濟(jì)南聯(lián)考)下圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的實(shí)驗(yàn)流程。所用的pBR322質(zhì)粒含有限制酶PstⅠ、EcRⅠ和Hind Ⅲ的切點(diǎn)各一個(gè)，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)回答以下相關(guān)問(wèn)題：
(1)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有________的因子。過(guò)程①所用到的組織細(xì)胞是_______________，③過(guò)程的目的是_______________________，⑤過(guò)程常用_____處理大腸桿菌。
將平末端處理為黏性末端
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行切割，形成的DNA片段種類(lèi)有____種，這些種類(lèi)的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有____種和____種。

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