基因工程的誕生和操作工具1.基因工程的誕生
2.基因工程的基本工具(1)限制性核酸內(nèi)切酶①作用:特異性識(shí)別雙鏈　　　　　分子內(nèi)一小段特殊的脫氧核苷酸序列,并且使其中特定部位的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。?②結(jié)果:形成　　　　末端和平末端。?(2)DNA連接酶①作用:將具有末端　　　　　　　　的2個(gè)DNA片段連接在一起,形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。?
②結(jié)果:形成重組DNA分子。
(3)載體①質(zhì)粒:獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞　　　　之外、能夠自主復(fù)制的雙鏈　　　　　　　　　　分子。?②質(zhì)粒是基因工程中常用的載體(最常用的是　　　　　　　的質(zhì)粒),其他載體還有　　　　　　　　、植物病毒和　　　　　　　　。?
考向一　基因工程的操作工具【典例1-1】 下圖中①和②代表的酶及二者作用部位分別是(　　)
A.DNA連接酶　限制性核酸內(nèi)切酶　氫鍵B.DNA水解酶　逆轉(zhuǎn)錄酶　氫鍵C.RNA水解酶　限制性核酸內(nèi)切酶　肽鍵D.限制性核酸內(nèi)切酶　DNA連接酶　磷酸二酯鍵
【典例1-2】 若要利用某目的基因(見(jiàn)圖甲)和P1噬菌體載體(見(jiàn)圖乙)構(gòu)建重組DNA(見(jiàn)圖丙),限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是 (　　)A.用EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體B.用BglⅡ和EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體D.用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體
易錯(cuò)提醒幾種易混淆酶的比較
考向二　基因工程中的載體需要的條件【典例1-3】 限制性核酸內(nèi)切酶MunⅠ和限制性核酸內(nèi)切酶EcRⅠ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示四種質(zhì)粒和目的基因,適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒(箭頭所指部位為限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn),質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因)是(　　)
A.①　　　B.②　　　C.③　　　D.④
基因工程的原理、基本操作步驟和應(yīng)用1.基因工程的原理(1)基本原理:讓人們感興趣的基因(即　　　　　　　　)在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效地表達(dá)。?(2)基因工程的基本要素:多種　　　　　　、　　　　　　　　、載體和宿主細(xì)胞等。?2.基因工程的基本操作步驟(1)獲得目的基因
(2)形成重組DNA分子(基因工程的核心)通常用　　　　　　　　　　　　　　　　　分別切割　　　　　　　　和　　　　DNA,然后用　　　　　　　　　將目的基因和載體DNA連接在一起,形成重組DNA分子。?(3)將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞①常用的受體細(xì)胞:　　　　　　　　、枯草桿菌、　　　　　　和動(dòng)植物細(xì)胞等。?
相同的限制性核酸內(nèi)切酶
(4)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞①篩選原因:并不是所有的細(xì)胞都接納了　　　　　　　　　　,因此,需篩選含　　　　　　　的受體細(xì)胞。?②篩選方法:用選擇培養(yǎng)基篩選,如質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因,可用含　　　　　　的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體細(xì)胞,篩選出含　　　　　　　　的受體細(xì)胞。?(5)目的基因的表達(dá)目的基因在　　　　　　　　中表達(dá),產(chǎn)生人們需要的功能物質(zhì)。?
考向一　基因工程的原理和技術(shù)【典例2-1】 科學(xué)家將外源目的基因與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組,并在大腸桿菌中成功表達(dá)。下圖表示構(gòu)建重組質(zhì)粒和篩選含目的基因的大腸桿菌的過(guò)程。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題。
(1)步驟①和②中常用的工具酶是　　　　和　　　　　　。?(2)經(jīng)過(guò)①和②步驟后,有些質(zhì)粒上的　　　　　　　　　　　　基因內(nèi)插入了外源目的基因,形成重組質(zhì)粒。?(3)步驟③是　　　　　　　　　　　　　　　　　的過(guò)程。為了促進(jìn)該過(guò)程,應(yīng)該用　　　　　　處理大腸桿菌。?(4)步驟④是將三角瓶?jī)?nèi)的大腸桿菌接種到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基A上培養(yǎng),目的是篩選　　　　　　　　　　　　　　　　　　。能在A(yíng)中生長(zhǎng)的大腸桿菌有　　　種。?(5)步驟⑤是用無(wú)菌牙簽挑取A上的單個(gè)菌落,分別接種到B(含氨芐青霉素和四環(huán)素)和C(含四環(huán)素)兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上。一段時(shí)間后,菌落的生長(zhǎng)狀況如上圖所示。含有目的基因的菌落位于　　　(填“B”或“C”)上,請(qǐng)?jiān)趫D中相應(yīng)位置上圈出來(lái)。?
答案:(1)限制性核酸內(nèi)切酶　DNA連接酶(2)氨芐青霉素抗性(3)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌　氯化鈣(4)含四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌　2(5)C 　如右圖所示
解析:(1)步驟①和②是將目的基因和質(zhì)粒用同種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割,得到相同的粘性末端,然后用DNA連接酶將二者連接起來(lái),形成重組質(zhì)粒。(2)質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因,根據(jù)步驟①和②構(gòu)建的重組質(zhì)粒的圖像可知,部分質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因中插入了目的基因。(3)據(jù)題圖可知,步驟③是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞大腸桿菌中;氯化鈣處理可增加大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性,增強(qiáng)其對(duì)重組質(zhì)粒的吸收能力。(4)由于質(zhì)粒上具有四環(huán)素抗性基因,且未被目的基因插入,因此,凡是導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌均對(duì)四環(huán)素具有抗性,可以存活,沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒的不能存活,于是可以篩選出含四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌;能夠在A(yíng)上生長(zhǎng)的大腸桿菌有2種,分別是導(dǎo)入空白質(zhì)粒的大腸桿菌和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌。
(5)目的基因的插入破壞了氨芐青霉素抗性基因,因此含有目的基因的大腸桿菌無(wú)法在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基B上存活,但能在C上存活,其所在位置即為B中未長(zhǎng)出而C中長(zhǎng)出菌落的位置。
易錯(cuò)提醒基因工程操作中的易錯(cuò)點(diǎn)(1)一般情況下,用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的片段,但有時(shí)可用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因,這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程,稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。(3)標(biāo)記基因的作用——篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,常見(jiàn)的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。
考向二　基因工程的應(yīng)用【典例2-2】 蘇云金桿菌(Bt)能產(chǎn)生具有殺蟲(chóng)能力的毒素蛋白。圖1是轉(zhuǎn)Bt毒素蛋白基因植物的重組DNA形成過(guò)程示意圖;圖2是毒素蛋白基因進(jìn)入植物細(xì)胞后發(fā)生的兩種生物大分子合成的過(guò)程,據(jù)圖回答下列問(wèn)題:
圖1 圖2
(1)將圖1中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后,反應(yīng)管中有　　　　種DNA片段。過(guò)程②需要用到　　　　　　　　　　酶。?(2)假設(shè)圖1中質(zhì)粒原來(lái)BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列變?yōu)榱肆硪环N限制酶BclⅠ識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列,現(xiàn)用BclⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒,則該圖1中①的DNA右側(cè)還能選擇BamHⅠ進(jìn)行切割,并能獲得所需重組質(zhì)粒嗎?并請(qǐng)說(shuō)明理由。　　　　　　　　　　　　　。?(3)若上述假設(shè)成立,并成功形成重組質(zhì)粒,則重組質(zhì)粒 (　　)A.既能被BamHⅠ也能被HindⅢ切開(kāi)B.能被BamHⅠ但不能被HindⅢ切開(kāi)C.既不能被BamHⅠ也不能被HindⅢ切開(kāi)D.能被HindⅢ但不能被BamHⅠ切開(kāi)
(4)圖2中α鏈?zhǔn)恰　　　　　　　?。不同組織細(xì)胞的相同DNA進(jìn)行過(guò)程③時(shí)啟用的起始點(diǎn)　　　　　　　　　　(填“都相同”“都不同”或“不完全相同”),其原因是　　　。?(5)要想檢測(cè)導(dǎo)入的Bt毒素蛋白基因是否表達(dá),在分子水平上可用　　　　　　　　　　　　法進(jìn)行檢測(cè),如果出現(xiàn)雜交帶,說(shuō)明目的基因已經(jīng)表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)品,轉(zhuǎn)基因植物培育成功。?
答案:(1)4　DNA連接　(2)能,切割后露出的粘性末端相同　(3)D　(4)mRNA　不完全相同　不同組織細(xì)胞中基因會(huì)進(jìn)行選擇性表達(dá)　(5)抗原—抗體雜交
解析:(1)由于圖1中①的DNA上有HindⅢ和BamHⅠ的3個(gè)識(shí)別位點(diǎn),所以用這兩種酶完全酶切后,形成4種DNA片段。(2)BclⅠ與BamHⅠ酶切割目的基因后形成的粘性末端一樣,故該圖①中的DNA右側(cè)還能選擇BamHⅠ進(jìn)行切割,并能獲得所需重組質(zhì)粒。(3)根據(jù)酶切位點(diǎn)和識(shí)別的堿基序列可知,重組質(zhì)粒只能被HindⅢ但不能被BamHⅠ切開(kāi)。(4)從圖2可知,α鏈?zhǔn)且訢NA的一條鏈作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄形成的信使RNA分子,不同組織細(xì)胞的相同DNA在轉(zhuǎn)錄時(shí),如果是相同基因一般轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)相同,不同的基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)不同。(5)檢測(cè)目的基因是否在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),分子水平上的檢測(cè)是向分泌物中加入抗體,通過(guò)抗原—抗體特異性結(jié)合形成雜交帶加以檢測(cè),如果能形成,說(shuō)明表達(dá)了,如果不能形成,說(shuō)明沒(méi)有表達(dá)。
知識(shí)歸納基因工程中的幾種檢測(cè)方法
(2016浙江4月選考,32節(jié)選)兔肝細(xì)胞中的基因E編碼代謝甲醛的酶,擬利用基因工程技術(shù)將基因E轉(zhuǎn)入矮牽牛中,以提高矮牽牛對(duì)甲醛的代謝能力,請(qǐng)回答下列問(wèn)題。(1)從兔肝細(xì)胞中提取mRNA,在　　　酶的作用下形成互補(bǔ)DNA,然后以此DNA為模板擴(kuò)增得到基因E。在相關(guān)酶的作用下,將基因E與Ti質(zhì)粒連接在一起,形成　　　　　　,再導(dǎo)入用氯化鈣處理的　　　　　　,侵染矮牽牛葉片。將被侵染的葉片除菌后進(jìn)行培養(yǎng),最終得到轉(zhuǎn)基因矮牽牛。其中培養(yǎng)過(guò)程正確的是　　　。?A.葉片在含合適濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上分化形成愈傷組織B.愈傷組織在含細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比較高的培養(yǎng)基上形成芽C.再生的芽在細(xì)胞分裂素含量高的培養(yǎng)基上生根D.愈傷組織在含合適濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上脫分化形成再生植株

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