第35講　基因工程及生物技術(shù)的安全性與倫理問題【課標要求】　1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.舉例說明基因工程在農(nóng)牧、食品及醫(yī)藥等行業(yè)的廣泛應(yīng)用改善了人類的生活品質(zhì)。4.舉例說明依據(jù)人類需要對原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行基因改造、生產(chǎn)目標蛋白的過程。5.舉例說出日常生活中的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及影響；中國禁止生殖性克隆人；舉例說明生物武器對人類的威脅與傷害。6.活動：DNA的粗提取與鑒定。7.活動：利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。8.活動：搜集文獻資料，就“轉(zhuǎn)基因食品是否安全”展開辯論。9.活動：搜集“轉(zhuǎn)基因食品是否安全”及關(guān)于設(shè)計試管嬰兒的資料。
考點一　重組DNA技術(shù)的基本工具與基本操作程序
一、重組DNA技術(shù)的基本工具1．基因工程的概念
2.基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)。
提醒：①限制酶是一類酶，而不是一種酶。限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵，而不能是氫鍵。②將一個基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時產(chǎn)生四個黏性末端或平末端。③限制酶的識別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個核苷酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成；后者是雙鏈序列。④判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是將黏性末端旋轉(zhuǎn)180°，同一種限制酶切割形成的黏性末端應(yīng)該是完全相同的結(jié)構(gòu)。⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。
提醒：與膜載體的區(qū)別：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細胞內(nèi)，并利用它在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細胞膜的通透性有關(guān)。
二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因。(2)篩選合適的目的基因。①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進行篩選。(3)目的基因的獲取方法：人工合成目的基因、利用PCR獲取和擴增目的基因、通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。(4)利用PCR獲取和擴增目的基因。①含義：一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。②原理：DNA半保留復(fù)制。③條件：DNA模板、4種脫氧核苷酸、引物、耐高溫的DNA聚合酶等。
④過程：PCR過程包括變性、復(fù)性和延伸三步。
⑤結(jié)果：DNA分子以指數(shù)形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環(huán)次數(shù))。⑥產(chǎn)物鑒定：采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR產(chǎn)物。
提醒：①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內(nèi)的DNA進行復(fù)制時，也需要引物，一般為RNA片段。③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
2．基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。(2)基因表達載體的組成及作用。
提醒：啟動子≠起始密碼子；終止子≠終止密碼子①啟動子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶識別、結(jié)合的部位。終止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使轉(zhuǎn)錄過程停止。②起始密碼子和終止密碼子均位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
3．將目的基因?qū)胧荏w細胞(只有該步驟未涉及堿基互補配對現(xiàn)象)
(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入，第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入非人工操作是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細胞。(3)農(nóng)桿菌特點。①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。(4)導(dǎo)入目的基因，可能存在于細胞質(zhì)中，也可能集合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。
4．目的基因的檢測與鑒定
1．基因工程的理論基礎(chǔ)
2．限制酶的特點與使用(1)限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點上進行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。(2)在獲取目的基因和切割載體時通常用同一種限制酶，以獲得相同的末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。(3)為了防止載體或目的基因的末端自己連接即所謂“環(huán)化”，可用不同的限制酶分別處理含目的基因的DNA和載體，使目的基因兩側(cè)及載體上各自具有兩個不同的末端。
3．標記基因的作用：可用于檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞
4．圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcRⅠ兩種限制酶。
5．與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
6.PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
7．啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
8.如何篩選出含有目的基因的受體細胞
(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
(2)被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種：含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌、含重組質(zhì)粒的大腸桿菌、含質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)篩選方法：將大腸桿菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的大腸桿菌和含質(zhì)粒的大腸桿菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。
考向1　圍繞基因工程的基本工具，考查科學思維1．(2022·揭陽普寧二中)2020年諾貝爾化學獎被授予“CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)”的發(fā)明者，以表彰他們在基因組編輯領(lǐng)域的貢獻。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能對基因進行定點編輯，其原理是由一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割(如下圖)?；卮鹣铝袉栴}：
(1)CRISPR復(fù)合體中的sgRNA的主要功能是_________________________________________________________________________________________________________，Cas9蛋白催化斷裂的化學鍵位于______________之間。若采用基因工程的方法獲得Cas9蛋白，構(gòu)建重組質(zhì)粒需要的酶是__________________________。(2)一般來說，在使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對不同基因進行編輯時，應(yīng)使用Cas9和________(填“相同”或“不同”)的sgRNA進行基因的相關(guān)編輯。(3)若將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因生物，與傳統(tǒng)的基因工程相比，其明顯優(yōu)點是______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)通過上述介紹，你認為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在_________________________________________________________________ (寫出2點)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。
解析：(1)據(jù)題意可知，CRISPR復(fù)合體中的sgRNA是一條單鏈向?qū)NA，主要功能是與靶向基因(目的基因)上特定堿基序列互補，從而定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合，并在特定位點切割DNA，該過程斷裂的是位于磷酸和脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵。(2)不同基因的堿基序列不同，根據(jù)堿基互補配對原則，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對不同基因進行編輯時，應(yīng)使用Cas9和不同的sgRNA進行基因的相關(guān)編輯。(3)CRISPR/Cas9基因編輯是對目標DNA位點的靶向編輯技術(shù)，特異性強，運用CRISPR/Ca9基因編輯技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因生物的明顯優(yōu)點是：避免了因目的基因隨機插入宿主細胞DNA引起的生物安全性問題。
答案：(1)與靶向基因(目的基因)上特定堿基序列互補，從而定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合，并在特定位點切割DNA　磷酸和脫氧核糖　限制酶和DNA連接酶(2)不同(3)避免了因目的基因隨機插入宿主細胞DNA引起的生物安全性問題(4)基因治療、基因水平進行動植物的育種、研究基因的功能
考向2　結(jié)合PCR技術(shù)及其應(yīng)用，考查科學思維2．(2022·遼寧東北育才學校)重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR擴增，從而獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。下圖是利用重疊延伸PCR技術(shù)擴增某目的基因的過程。下列分析不正確的是(　　)
A．第一階段過程中的產(chǎn)物是依賴引物1、引物2和引物3、引物4擴增的結(jié)果B．引物2和引物3上均含有與模板鏈不能互補的堿基C．PCR過程中需要先加熱至90 ℃以上后再冷卻至72 ℃左右D．第三階段需要利用引物1和引物4獲得目的基因
解析：由圖可知，第一階段過程中的產(chǎn)物是依賴引物1、引物2和引物3、引物4擴增的結(jié)果，A項正確；引物2和引物3分別與DNA的兩條鏈互補，若引物2和引物3完全與模板互補，則引物2和引物3會發(fā)生互補，導(dǎo)致引物失效，所以引物2和引物3上均含有與模板鏈不能互補的堿基，B項正確；變性過程是雙螺旋解開的過程，此過程中氫鍵斷裂需通過先加熱至90 ℃以上完成，然后再冷卻至50 ℃左右使引物與模板形成氫鍵結(jié)合在一起，為子鏈的延伸做準備，C項錯誤；第三階段是子鏈延伸的過程，根據(jù)引物延伸的方向與結(jié)合的模板鏈可知，第三階段需要利用引物1和引物4延伸子鏈獲得目的基因，D項正確。
3．(2022·浙江卷改編)截至2022年10月，我國在抗擊新冠疫情方面取得了顯著的成效，但全球疫情形勢仍然非常嚴峻，尤其是病毒出現(xiàn)了新變異株——德爾塔、奧密克戎，更是威脅著全人類的生命健康。(1)新冠病毒核酸定性檢測原理是：以新冠病毒的單鏈RNA為模板，利用________酶合成DNA，經(jīng)PCR擴增，然后在擴增產(chǎn)物中加入特異的________，如果檢測到特異的雜交分子則核酸檢測為陽性。(2)接種疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制備技術(shù)要點是：將腺病毒的復(fù)制基因敲除；以新冠病毒的________基因為模板合成的DNA插入腺病毒基因組，構(gòu)建重組腺病毒。重組腺病毒在人體細胞內(nèi)表達產(chǎn)生新冠病毒抗原，從而引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。在此過程中，腺病毒的作用是作為基因工程中目的基因的____________。將腺病毒復(fù)制基因敲除的目的是________________________________________________________________________________________________。
(3)單克隆抗體有望用于治療新冠肺炎。單克隆抗體的制備原理是：取免疫陽性小鼠的________細胞與骨髓瘤細胞混合培養(yǎng)，使其融合，最后篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞。與植物組織培養(yǎng)相比，雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)需要特殊的成分，如胰島素和____________________。
解析：(1)RNA做模板合成DNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR擴增，然后在擴增產(chǎn)物中加入特異的核酸探針，檢測新冠病毒核酸。如果檢測到特異的雜交分子則核酸檢測為陽性。(2)腺病毒疫苗的制備技術(shù)要點是：將腺病毒的復(fù)制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因為模板合成的DNA插入腺病毒基因組，構(gòu)建重組腺病毒。重組腺病毒在人體細胞內(nèi)表達產(chǎn)生新冠病毒抗原，從而引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。在此過程中，腺病毒的作用是作為基因工程中目的基因的載體。將腺病毒復(fù)制基因敲除的目的是使腺病毒失去復(fù)制能力。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄　核酸探針(2)抗原　載體　使腺病毒失去復(fù)制能力(3)脾　動物血清
考向3　結(jié)合基因工程的操作程序及其應(yīng)用，考查科學探究4．(2022·浙江溫州)土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物的培育過程中，為了便于受體細胞的篩選，常將土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒進行改造，并加入卡那霉素抗性基因(KanR)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ′)，如圖所示。β-半乳糖苷酶能催化特殊物質(zhì)X-gal發(fā)生顯色反應(yīng)而使固體培養(yǎng)基上含該基因的菌落呈藍色，否則呈白色。
回答下列問題：(1)用BseYⅠ切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，在DNA連接酶的作用下__________(填“能”或“否”)形成重組質(zhì)粒，理由是_______________________________________________________________________________________________。(2)為便于篩選，需將農(nóng)桿菌接種在含______________、X-gal的LB培養(yǎng)基，以去除未轉(zhuǎn)化的細胞，再選擇______色菌落，即為所需菌落。這一過程中，切割含目的基因的DNA片段，應(yīng)選擇限制性內(nèi)切核酸酶________，用于導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌本身________(填“含”或“不含”)lacZ′基因。(3)為提高重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌的效率，除考慮導(dǎo)入方法、篩選條件、防止污染外，還需考慮的主要因素有___________________________________________________________________________________________________________ (答出2點即可)。
解析：(1)用同一種限制酶Bse YⅠ切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，兩者含有互補的黏性末端，因此在DNA連接酶的作用下能形成重組質(zhì)粒。(2)為便于篩選，需將農(nóng)桿菌接種在含卡那霉素、X-gal的LB培養(yǎng)基。由圖可知，這一過程中，切割含目的基因的DNA片段，應(yīng)選擇限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ，因為該限制酶破壞了Ti質(zhì)粒上的lacZ′基因，因此選擇白色菌落，即為所需菌落。用于導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌本身不含lacZ′基因。
答案：(1)能　具有互補的黏性末端(2)卡那霉素　白色　BglⅡ　不含(3)農(nóng)桿菌的感受態(tài)、數(shù)量(密度)；質(zhì)粒的大小、質(zhì)量、濃度、純度；無機鹽濃度
考點二　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定(1)原理。
(3)注意事項。①取材原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。②過濾含DNA的研磨液時不能用濾紙代替紗布，否則會因DNA被吸附到濾紙上而損失大量DNA。
提醒：鑒定DNA時，一支試管為對照組，另一支試管為實驗組。兩支試管中都先加物質(zhì)的量濃度為2 ml/L的NaCl溶液；在實驗組試管中加DNA絲狀物，對照組不加；加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。結(jié)果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現(xiàn)藍色，對照組無色。如果實驗組藍色較淺，說明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)實驗原理。①擴增原理：PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。②電泳原理：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物鑒定：一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
(2)方法步驟。①PCR實驗操作步驟。
瓊脂糖凝膠制備：根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液(一般質(zhì)量分數(shù)為0.8%～1.2%)凝膠板制備：將溫熱的瓊脂糖溶液倒入模具，插入梳子形成加樣孔，凝膠溶液完全凝固后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)點樣：加電泳緩沖液，然后用微量移液管將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液的混合液加入加樣孔，一孔加標準參照物電泳：接通電源，設(shè)定好電壓，一般為1～5 V/cm，進行電泳觀察：在紫外燈下觀察和照相
提醒：①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。②在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。③觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。④電泳時，DNA分子的相對分子質(zhì)量越大，受到的阻力越大，遷移速率越慢，DNA分子的相對分子質(zhì)量越小，受到的阻力越小，遷移速率越快。⑤在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
1．比較DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同
2.歸納DNA粗提取中的注意事項(1)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細胞作為實驗材料。(2)加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，沿著一個方向攪拌，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致不能形成絮狀沉淀。(3)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。(4)提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入研磨液能防止DNA酶降解DNA；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數(shù)為95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。
考向1　結(jié)合DNA的粗提取和鑒定，考查科學探究1．(2022·廣東大灣區(qū)聯(lián)合模擬)在DNA指紋技術(shù)研究中認為，DNA中的高度重復(fù)序列具有高度可變性，但其高度重復(fù)序列中有一小段序列在所有個體中都一樣，稱為“核心序列”。下圖是某刑事案例中女受害者、受害者體內(nèi)精液和三位懷疑對象的DNA指紋圖譜，請根據(jù)以上內(nèi)容和指紋圖譜回答下列問題：
(1)指紋圖譜就是把“核心序列”串聯(lián)起來作為探針，與不同個體的DNA進行__________________就會出現(xiàn)各自特有DNA指紋圖譜。應(yīng)用DNA指紋技術(shù)，首先需要用____________將待測的樣品DNA切成片段，然后用電泳的方法將這些片段按大小分開。(2)提取動物細胞的DNA時需先破碎細胞，常用的方法是________________。為了純化提取的DNA，可利用DNA在____________中溶解度的不同來去除雜質(zhì)。在沸水浴的條件下，DNA遇____________會變成藍色。(3)一滴血、精液或是一根頭發(fā)中的DNA雖然含量很少，但仍可以進行DNA指紋鑒定，因為在鑒定之前可通過______________獲得大量的相同DNA。從上圖可以判斷出懷疑對象中____________最可能是罪犯。
解析：(1)探針是把“核心序列”串聯(lián)起來形成的DNA單鏈，若待測個體的DNA單鏈能與探針形成雜交條帶，則說明受害者體內(nèi)有待測個體的DNA，該方法稱為DNA分子雜交；限制酶能破壞磷酸二酯鍵，使DNA斷裂成小的片段。(2)動物細胞沒有細胞壁，常用吸水漲破法破碎細胞；DNA在不同濃度的NaC1溶液中溶解度不同，可以利用此原理來去除雜質(zhì)；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色。(3)從受害者體內(nèi)分離的精液樣品與對象1的吻合度最高，因此對象1最可能是罪犯。
答案：(1)DNA分子雜交　限制酶(2)吸水漲破法　NaC1溶液　二苯胺(3)PCR技術(shù)　1
考向2　圍繞DNA片段的擴增及電泳鑒定，考查社會責任2．(2022·福建龍巖一中)VNN1基因(1 542bp)與炎癥相關(guān)性疾病有關(guān)，GFP基因(4 735bp)控制綠色熒光蛋白的合成，該蛋白可在相應(yīng)波長的紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。某研究小組進行鼠源GFP-VNN1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能研究，回答下列問題：(1)為構(gòu)建重組質(zhì)粒，研究小組從數(shù)據(jù)庫查找到VNN1的DNA序列，并設(shè)計引物。上游引物：5′-AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC-3′(下劃線為HindⅢ酶切位點)，下游引物：5′-GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA-3′(下劃線為Bam HⅠ酶切位點)，之后進行PCR擴增，PCR的原理是______________________。擴增后的VNN1基因要與含GFP基因的載體連接，需用____________________(填具體酶)切割VNN1基因和含GFP基因的載體，再用____________處理，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
(2)GFP基因在重組質(zhì)粒中的作用是________________________________________________________________________________________________________________。用之前相同的限制酶對GFP-VNN1重組質(zhì)粒切割后，進行電泳鑒定時得到如圖1所示的部分條帶，結(jié)果表明________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)IL-6為體內(nèi)重要的炎癥因子，能與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活炎癥反應(yīng)。圖2為GFP-VNN1重組質(zhì)粒對細胞分泌IL-6的影響，由此說明________________；同時發(fā)現(xiàn)與正常組比較，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組IL-6的表達有輕微升高，造成這種現(xiàn)象的可能原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)首先需用HindⅢ酶和BamHⅠ酶切割VNN1基因和含GFP基因的載體，再用DNA連接酶處理，構(gòu)建重組質(zhì)粒。(2)用之前相同的限制酶對GFP-VNN1重組質(zhì)粒切割后，得到的條帶中含有大小為1542bp的條帶，即VNN1基因(1 542bp)，這說明VNN1基因已經(jīng)插入到含GFP基因的載體中。(3)從柱狀圖中看出VNN1組中IL-6的濃度增加，說明了VNN1基因表達產(chǎn)物能促進細胞分泌炎癥因子IL-6；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組IL-6的表達有輕微升高，可能原因是操作過程中對細胞的損傷(或用到的化學試劑對細胞具有一定的毒性作用)，可以激活相應(yīng)細胞分泌炎癥因子IL-6。
答案：(1)DNA雙鏈復(fù)制　HindⅢ酶和BamHⅠ酶　DNA連接酶(2)鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細胞篩選出來　VNN1基因已經(jīng)插入到含GFP基因的載體中(3)VNN1基因表達產(chǎn)物能促進細胞分泌炎癥因子IL-6操作過程中對細胞的損傷(或用到化學試劑對細胞具有一定的毒性作用)，可以激活相應(yīng)細胞分泌炎癥因子IL-6
考點三　基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程
1．基因工程的應(yīng)用(1)在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用。
從某些生物中分離出具有抗蟲功能的基因，將它導(dǎo)入作物中培育出具有抗蟲性的作物將來源于某些病毒、真菌等的抗病基因?qū)胫参镏校嘤鲛D(zhuǎn)基因抗病植物將降解或抵抗某種除草劑的基因?qū)胱魑?，可以培育出抗除草劑的作物品種
由于外源生長激素基因的表達可以使轉(zhuǎn)基因動物生長得更快，將這類基因?qū)雱游矬w內(nèi)，以提高動物的生長速率將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他營養(yǎng)成分不受影響
(2)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用。①對微生物或動植物的細胞進行基因改造，使它們能夠生產(chǎn)藥物。②讓哺乳動物批量生產(chǎn)藥物。乳腺生物反應(yīng)器：讓外源基因在哺乳動物的乳腺中特異性表達，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白。
提醒：乳腺生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因動物的乳汁生產(chǎn)藥用蛋白，而膀胱生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因動物的尿液生產(chǎn)藥用蛋白，乳腺生物反應(yīng)器需是處于生殖期的雌性動物才可生產(chǎn)藥用蛋白，而膀胱生物反應(yīng)器則是任何生長期的雌雄動物均可生產(chǎn)。③可能使建立移植器官工廠的設(shè)想成為現(xiàn)實。器官移植：用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體，例如抑制或除去抗原決定基因，結(jié)合克隆技術(shù)培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。④成果：生產(chǎn)的重組人干擾素、血小板生成素、促紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因子等基因工程藥物均已投放市場。
(3)在食品工業(yè)方面的應(yīng)用。生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。例如，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)大量生產(chǎn)凝乳酶。
2．蛋白質(zhì)工程——第二代基因工程，可生產(chǎn)自然界中不存在的蛋白質(zhì)(1)概念：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。
(2)操作手段和結(jié)果。
(3)基本思路。預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)(4)蛋白質(zhì)工程應(yīng)用。①臨床上：如研發(fā)出速效胰島素類似物產(chǎn)品。②醫(yī)藥工業(yè)方面：如改變干擾素分子上的一個半胱氨酸，以延長干擾素的保存時間等。
③其他工業(yè)方面：改進酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶。④農(nóng)業(yè)方面：改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加糧食產(chǎn)量；設(shè)計優(yōu)良微生物農(nóng)藥；等等。
1．蛋白質(zhì)工程與基因工程的異同
2.乳腺生物反應(yīng)器與工程菌的比較
考向1　結(jié)合基因工程的應(yīng)用，考查社會責任1．(2022·遼寧沈陽二中)2020年8月16日，由我國軍事醫(yī)學研究院陳薇院士團隊及康希諾生物聯(lián)合申報的腺病毒載體新冠疫苗被授予專利權(quán)，這是我國首個新冠疫苗專利。全面接種新冠疫苗，建立免疫屏障，可有效防止新冠病毒大規(guī)模傳染。請據(jù)題意并結(jié)合圖1、圖2回答下列問題：
(1)新冠病毒是一種RNA病毒，通過其表面的S蛋白與宿主細胞膜表面ACE2受體結(jié)合而完成感染。研制疫苗時，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(yīng))獲取S蛋白基因所需要的酶是______________________________________。據(jù)圖1分析，應(yīng)選擇的引物是________，其作用是在酶的催化下能從引物的________端開始連接脫氧核苷酸。(2)PCR的產(chǎn)物一般通過________________來鑒定，結(jié)果如圖2所示。1號泳道為標準(Marker)，2號泳道為陽性對照(提純的S蛋白基因片段)，3號泳道為實驗組。標準(Marker)的實質(zhì)為不同__________的DNA片段混合物，3號泳道若有雜帶出現(xiàn)原因一般可能是___________________________________________________________________________________________________________________________________(至少答出2點)。
(3)腺病毒是一種DNA病毒，該病毒基因組中表達出的E1區(qū)蛋白與腺病毒的復(fù)制有關(guān)而且對宿主細胞的毒性很強。為了提高疫苗的________，避免人體因重組腺病毒增殖而感染，科研中將____________構(gòu)建的復(fù)制缺陷型腺病毒作為運載S蛋白基因的載體制備新冠疫苗。
解析：(1)通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(yīng))獲取S蛋白基因，該技術(shù)需要先用逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA形成DNA、再利用PCR技術(shù)擴增目的基因，PCR技術(shù)中需要TaqDNA聚合酶。DNA中羥基端為3′端，游離磷酸端為5′端，且DNA復(fù)制時新合成的子鏈和模板鏈反向螺旋形成新的DNA，又因為DNA子鏈從5′端向3′端延伸，則據(jù)圖1分析，選擇的引物是Ⅱ、Ⅲ，引物可以使TaqDNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。(2)鑒定通過PCR技術(shù)形成的DNA常用瓊脂糖凝膠電泳法。標準(Marker)的實質(zhì)為不同已知長度的DNA片段混合物，若實驗的模板受到污染、引物
的特異性不強、退火溫度偏低，則3號泳道會出現(xiàn)雜帶。(3)由于該病毒基因組中表達出的E1區(qū)蛋白與腺病毒的復(fù)制有關(guān)而且對宿主細胞的毒性很強，因此為了提高疫苗的安全性，避免人體因重組腺病毒增殖而感染，可將腺病毒的DNA去除E1基因，構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒作為運載S蛋白基因的載體制備新冠疫苗。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶　Ⅱ、Ⅲ　3′(2)瓊脂糖凝膠電泳　已知長度　模板受到污染；引物的特異性不強；退火溫度偏低(3)安全性　去除E1基因
考向2　結(jié)合蛋白質(zhì)工程，考查科學思維2．(2022·湖南卷)水蛭是我國的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}：(1)蛋白質(zhì)工程流程如圖所示，物質(zhì)a是________________________，物質(zhì)b是________。在生產(chǎn)過程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有_____________________________________________________________________________、_______________________________________________________________________和利用PCR技術(shù)擴增。PCR技術(shù)遵循的基本原理是____________。(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性，結(jié)果如圖所示。推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的________(填“種類”或“含量”)有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是________________________________________________________________________________。
(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設(shè)計思路_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)據(jù)分析可知，物質(zhì)a是氨基酸序列多肽鏈，物質(zhì)b是mRNA。在生產(chǎn)過程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是密碼子的簡并性，即一種氨基酸可能有幾個密碼子。(2)基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取目的基因、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成和利用PCR技術(shù)擴增。(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，據(jù)圖可知，水解產(chǎn)物中的肽含量隨著酶解時間的延長均上升，且差別不大；而水解產(chǎn)物中抗凝血活性有差異，經(jīng)酶甲處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后相對穩(wěn)定，經(jīng)酶乙處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產(chǎn)物的抗凝血活性最終高于經(jīng)酶乙處理后的酶解產(chǎn)物的抗凝血活性，差異明顯，據(jù)此推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解時間和酶的種類不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞。
答案：(1)氨基酸序列多肽鏈　mRNA　密碼子的簡并性(2)從基因文庫中獲取目的基因　通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成　DNA雙鏈復(fù)制(3)種類　提取的水蛭蛋白的酶解時間和處理的酶的種類不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞(4)取3支試管，分別加入等量的蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統(tǒng)計3支試管中血液凝固時間
考點四　生物技術(shù)的安全性與倫理問題
1．轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性(1)轉(zhuǎn)基因成果。
(2)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的爭論。①爭論焦點：在轉(zhuǎn)基因食品的安全性等方面發(fā)生激烈的爭論。②正確態(tài)度：理性看待轉(zhuǎn)基因技術(shù)要做到建立在完備的相關(guān)科學知識基礎(chǔ)之上；看到人們的觀點受到許多復(fù)雜的政治、經(jīng)濟和文化等因素的影響；要靠確鑿的證據(jù)和嚴謹?shù)倪壿嬤M行思考和辯論。③我國方針：研究上要大膽，堅持自主創(chuàng)新；推廣上要慎重，做到確保安全；管理上要嚴格，堅持依法監(jiān)管。
2．關(guān)注生殖性克隆人(1)生殖性克隆和治療性克隆的比較。
(2)關(guān)于生殖性克隆人的爭論。
(3)我國不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗。(4)警惕用細胞研究和人類基因組編寫計劃等新技術(shù)研究生殖性克隆人。
3．禁止生物武器(1)生物武器種類。
(2)生物武器特點。①致病性強；傳染性強；人易感。②較隱蔽：不易被發(fā)現(xiàn)；易傳播(如氣溶膠)，發(fā)病有潛伏期，污染面積大、危害時間長。③易得到：制備容易，花費小。④傳染途徑多，治療困難。⑤受自然條件影響大。(3)散布途徑：直接或者通過食物、生活必需品和帶菌昆蟲等散布。(4)禁止生物武器。中國政府的態(tài)度：在任何情況下不發(fā)展、不生產(chǎn)、不儲存生物武器，并反對生物武器及其技術(shù)和設(shè)備的擴散。
1．轉(zhuǎn)基因生物的優(yōu)缺點(1)優(yōu)點：提高糧食產(chǎn)量；減少農(nóng)藥使用，從而減輕環(huán)境污染；節(jié)約生產(chǎn)成本，降低糧食售價；增加食物營養(yǎng)，提高附加價值；增加食物種類，提升食物品質(zhì)；促進生產(chǎn)效率，帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。(2)缺點：可能產(chǎn)生新病毒和新的過敏原；可能產(chǎn)生抗除草劑的雜草；可能使疾病的傳播跨越物種障礙；可能會損害農(nóng)作物的生物多樣性；可能干擾生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
2．試管嬰兒和設(shè)計試管嬰兒的比較
考向　結(jié)合生物技術(shù)的安全性和倫理問題，考查社會責任1．(2022·山東濟南期末改編)20世紀70年代以后，一大批生物技術(shù)成果問世，對人類的生產(chǎn)和生活，特別是在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了極大的作用，科學家甚至利用分子遺傳學等知識和技術(shù)把改造生命的幻想變成現(xiàn)實。但生物技術(shù)的發(fā)展在造福人類的同時也可能帶來潛在的危害。下列有關(guān)生物技術(shù)的安全性與倫理問題描述正確的是(　　)A．將目的基因?qū)肴~綠體基因組可以有效地防止基因污染B．經(jīng)濟、文化和倫理道德觀念的不同不會影響人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的看法C．生殖性克隆和治療性克隆的結(jié)果本質(zhì)是相同的，都會面臨倫理問題D．人體不會對轉(zhuǎn)基因技術(shù)制造的具有超強的傳染性和致病性的新型病原體產(chǎn)生免疫反應(yīng)
解析：因為葉綠體在細胞質(zhì)里，受精卵中的葉綠體來自卵細胞，精子里沒有，植物傳粉只傳精子，卵子不離開母本，所以將目的基因?qū)肴~綠體基因組可以有效地防止基因污染，A項正確；經(jīng)濟、文化和倫理道德觀念的不同會影響人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的看法，B項錯誤；生殖性克隆會面臨倫理問題，C項錯誤；轉(zhuǎn)基因技術(shù)制造的具有超強的傳染性和致病性的新型病原體也會引起人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，D項錯誤。
2．(2022·廣東連州)下列關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物與安全性的敘述，正確的是(　　)A．轉(zhuǎn)基因培育的植物，理論上目的基因只存在于特定的組織中B．轉(zhuǎn)基因技術(shù)與植物體細胞雜交技術(shù)均可打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育出雜種新物種C．種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉時，常間行種植普通棉花以供害蟲取食，其主要目的是保護物種多樣性D．轉(zhuǎn)基因花粉中若有毒蛋白或過敏蛋白，則它有通過食物鏈傳遞而引發(fā)人類食品安全問題的可能
解析：轉(zhuǎn)基因培育的植物，理論上目的基因存在于所有體細胞中，A項錯誤；轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的物種和原來的非轉(zhuǎn)基因生物屬于同一物種，B項錯誤；種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，常間行種植普通棉花是為了降低害蟲的抗性基因進化的頻率，C項錯誤。
高考真題體驗1.(2022·山東卷)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是(　　)A．過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
解析：低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A項正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B項錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C項正確；細胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解于酒精，可能有蛋白質(zhì)不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D項正確。
2．(2022·全國乙卷)新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用?；卮鹣铝袉栴}。(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA(核酸檢測)可以采取RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是____________________，再通過PCR技術(shù)擴增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測結(jié)果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設(shè)計PCR引物時必須依據(jù)新冠病毒RNA中的__________________來進行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是________。(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測(檢測體內(nèi)是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測結(jié)果為陰性而抗體檢測結(jié)果為陽性，說明_________________(答出1種情況即可)；若核酸檢測和抗體檢測結(jié)果均為陽性，說明__________________。
(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S?；蚬こ痰幕静僮髁鞒淌莀________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)新冠病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的過程屬于逆轉(zhuǎn)錄過程，逆轉(zhuǎn)錄過程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶(反轉(zhuǎn)錄酶)。(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設(shè)計PCR引物時必須依據(jù)新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來進行；PCR過程每次循環(huán)分為3步，分別為變性(90～95 ℃)、復(fù)性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中溫度最低的一步是復(fù)性。(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測，若核酸檢測結(jié)果為陰性而抗體檢測結(jié)果為
陽性，說明該個體曾經(jīng)感染過新冠病毒，機體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體，將病毒消滅，則核酸檢測為陰性，但由于抗體有一定的時效性，能在體內(nèi)存在一段時間，故抗體檢測為陽性；若核酸檢測和抗體檢測結(jié)果均為陽性，說明該個體體內(nèi)仍含有病毒的核酸，機體仍進行特異性免疫過程，能產(chǎn)生抗體，則說明該人已經(jīng)感染新冠病毒，為患者。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶(反轉(zhuǎn)錄酶)(2)特異性核苷酸序列　退火(復(fù)性)(3)曾感染新冠病毒，已康復(fù)　已感染新冠病毒，是患者(4)獲取S蛋白基因→構(gòu)建S蛋白基因與運載體的表達載體→導(dǎo)入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定(檢測受體能否產(chǎn)生S蛋白)
3．(2022·山東卷)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAGP和FLAGP△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是__________________________________________________________________________________________________________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR擴增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。修改擴增P基因時使用的帶有EcRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白表達成功后，將FLAGP、FLAGP△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測，檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAGP和FLAGP△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測，藥物A的作用是_______________________；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)根據(jù)以上結(jié)果推測，藥物A治療該病的機理是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)設(shè)計擴增P基因的引物，需要兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的5′端。(2)融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時出錯。由圖可看出，在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識別序列對應(yīng)的最后兩個堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個堿基構(gòu)成一個密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變，可通過在EcRⅠ識別序列前后增加堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)，這樣能保證P基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA上的讀碼框不改變，能夠正常翻譯。(3)①組僅添加UBC，處理后，用UBC抗體檢測，不出現(xiàn)雜交帶；②組添加UBC和FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶；③組添加UBC、藥物A和FLAG-P，雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是促進UBC與FLAG-P的結(jié)合。由②④組或③⑤組的差異在于②③組使用FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶；④⑤組使用FLAG-P△，不出現(xiàn)雜交帶，據(jù)此推測P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列。
答案：(1)兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補配對　5′端(2)在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識別序列對應(yīng)的最后兩個堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個堿基構(gòu)成一個密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變　在EcRⅠ識別序列前后增加堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)(3)促進UBC與FLAG-P的結(jié)合　P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列(4)藥物A促進UBC與FLAG-P的結(jié)合，從而促進蛋白P被蛋白酶識別并降解，達到治療的目的
4．(2022·廣東卷)“綠水逶迤去，青山相向開”，大力發(fā)展低碳經(jīng)濟已成為全社會的共識?；谀承┧缶奶厥獯x能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業(yè))為原料，通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，構(gòu)建一種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)。
回答下列問題：(1)研究者針對每個需要擴增的酶基因(如圖)設(shè)計一對________，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴增得到目標酶基因。
(2)研究者構(gòu)建了一種表達載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經(jīng)篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________________________，終止子的作用是____________________________________。(3)培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現(xiàn)了生長遲緩的現(xiàn)象，推測其原因可能是______________________________________________，此外丙酮的積累會傷害細胞，需要進一步優(yōu)化菌株和工藝才能擴大應(yīng)用規(guī)模。(4)這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，實現(xiàn)了________________，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)的優(yōu)勢在于______________________，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會效益。

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