A．步驟①需要在S基因編碼區(qū)上游添加乳腺蛋白基因啟動子
B．步驟②需要在高Ca2+-高pH條件下將S基因表達載體導(dǎo)入受精卵
C．步驟④可選擇發(fā)育良好的囊胚，且代孕母體一般需要同期發(fā)情處理
D．與乳腺反應(yīng)器不同的是膀胱生物反應(yīng)器會受到轉(zhuǎn)基因動物的性別和年齡的限制
2、（2024屆江蘇省連云港市高三一模）基因工程中，為方便純化蛋白質(zhì)，構(gòu)建表達載體時可將目的基因序列與標(biāo)簽基因序列連接，表達含有標(biāo)簽的融合蛋白。下圖為某質(zhì)粒編碼鏈（轉(zhuǎn)錄時的非模板鏈）的部分序列。下列相關(guān)敘述錯誤的是（ ）
A．轉(zhuǎn)錄后的mRNA序列與圖中DNA序列一致，僅T替換為U
B．若目的蛋白中只保留組氨酸標(biāo)簽，選擇酶切位點時優(yōu)先考慮Nde I和Xh I（或Ava I）
C．若目的蛋白中保留了組氨酸標(biāo)簽，翻譯時標(biāo)簽下游的基因序列不編碼氨基酸
D．以組氨酸標(biāo)簽的基因序列為模板設(shè)計下游引物，擴增導(dǎo)入成功的目的基因時，獲得的序列可能比預(yù)期的序列短
3、（2024屆江蘇省南京市、鹽城市高三一模）稻米胚乳直鏈淀粉含量高會導(dǎo)致食用品質(zhì)差。研究發(fā)現(xiàn)，水稻蠟質(zhì)基因（Wx）編碼直鏈淀粉合成酶。若Wx基因中第226位堿基是正常的G，該位點所在的內(nèi)含子能被正常剪接，胚乳中直鏈淀粉含最高，基因型記做GG；若該位點突變成T，則不能被正常剪接，胚乳中直鏈淀粉的合成水平會降低，基因型記做TT。為檢測Wx基因該位點堿基是G或T，研究人員以待測水稻葉片總DNA為材料，以Wx基因片段設(shè)計引物如圖所示，對PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Acc Ⅰ酶切后電泳。已知引物1為5'－GCTTCACTTCTCTGCTTGTG－3'，兩引物之間無另外的Acc Ⅰ酶的識別位點。下列敘述正確的是（ ）
A．該實驗中需設(shè)計的引物2為5'－TTCAACTCTCGTTAAATCAT－3'
B．若酶切產(chǎn)物只能觀察到530bp的DNA條帶，則表明該水稻品種為TT型
C．GT雜合型水稻品種酶切電泳結(jié)果為3條條帶
D．組成上述兩種淀粉合成酶的氨基酸的種類不同，數(shù)目相同
4、（2024屆江蘇省南京市、鹽城市高三一模）基因工程在農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)等多方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，如圖表示利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白的兩條途徑。下列敘述錯誤的是（ ）
A．若某基因是從人的細(xì)胞內(nèi)提取 mRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的，則該基因中不含啟動子序列
B．?dāng)U增目的基因時，利用耐高溫的DNA連接酶從引物a、b的3'-端進行子鏈合成
C．導(dǎo)入人血清白蛋白基因的綿羊受體細(xì)胞是乳腺細(xì)胞
D．利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法可將含有目的基因的重組質(zhì)粒整合到植物受體細(xì)胞的染色體DNA上
5、（2024屆江蘇省南京市、鹽城市高三第一次模擬考試）黑水虻是重要的資源昆蟲，體內(nèi)H基因編碼的抗菌肽HI-3具有抗菌、抗癌和免疫調(diào)節(jié)作用。科研人員利用酵母菌生產(chǎn)抗菌肽HI-3，并避免基因污染。請回答下列問題：
(1)利用PCR技術(shù)擴增H基因，需根據(jù)H基因設(shè)計兩種引物，引物的作用有____。
A．為Taq酶提供結(jié)合位點B．決定擴增產(chǎn)物大小
C．決定反應(yīng)的特異性D．決定變性時間
(2)已知H基因編碼鏈的編碼區(qū)序列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTC-TAGA-3'，擴增H基因的編碼區(qū)段時，結(jié)合到編碼鏈上的引物序列是 （方向為5'→3'，寫出5'端8個堿基序列）。獲得H基因產(chǎn)物后需要進行凝膠電泳，將符合要求的條帶 以便提取純化并進行測序。
(3)由于抗菌肽HI-3會損傷酵母細(xì)胞，組成型表達（持續(xù)表達）H基因的酵母菌最大種群數(shù)量偏低，限制了最終產(chǎn)量。科研人員通過構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子來降低抗菌肽HI-3對酵母菌的傷害。在酵母菌基因組DNA中插入P和S基因，使質(zhì)粒上H基因的表達受紅光控制。紅光調(diào)控H基因表達的原理如圖1所示。

P和S基因表達應(yīng)為 （從“組成型表達”“紅光誘導(dǎo)型表達”選填）。紅光調(diào)控H基因表達的原理是S基因指導(dǎo)合成的S蛋白直接與啟動子Jub結(jié)合，P基因表達的P蛋白在 ，啟動H基因的表達過程。
(4)發(fā)酵后菌體和產(chǎn)物分離是發(fā)酵工藝的基本環(huán)節(jié)。定位于細(xì)胞表面的F蛋白可使酵母細(xì)胞彼此結(jié)合，進而沉淀在發(fā)酵罐底部?？蒲腥藛T引入藍光激活系統(tǒng)如圖2，在酵母菌基因組中插入了兩個均能合成E蛋白的基因（E1、E2），使F基因的表達受到藍光控制如圖3。

圖3中E2基因持續(xù)性表達少量的E蛋白時，酵母細(xì)胞具有接受藍光刺激的能力，E1基因的作用是 。
(5)制藥過程中需避免工程菌泄露到環(huán)境中引發(fā)基因污染。科研人員利用兩種阻遏蛋白基因（T和L）和調(diào)控元件，使酵母細(xì)胞在紅光和藍光同時照射時才激活致死基因N的表達，進而誘導(dǎo)工程菌死亡，如圖4。

若圖中①選用的啟動子為Jub，②處選用的啟動子為CYC，則③④處結(jié)合的阻遏蛋白分別為 。
(6)請結(jié)合上述分析，利用該工程菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽HI-3各階段需控制的光照條件是：I菌種培養(yǎng)階段 ；Ⅱ菌種發(fā)酵階段 ；II產(chǎn)物分離階段 ；IV安全處理階段紅光、藍光同時照射。
6、（2024屆江蘇省蘇錫常鎮(zhèn)四市高三下學(xué)期教學(xué)情況調(diào)研(一) ）熱帶玉米（WT）對光周期有較高的敏感性，開花需要短日照條件（SD），只能生活在熱帶。經(jīng)長期馴化，進化出適應(yīng)長日照條件（LD）的溫帶玉米。研究表明，熱帶玉米光周期敏感性與ZmCCT9基因有關(guān)，Cas9核酸酶敲除該基因過程中，獲得了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三種突變類型（圖1）。在長日照條件下種植，發(fā)現(xiàn)三種突變型開花時間明顯提前。請回答下列問題。
(1)圖1方框中的三個堿基為NGG（N可為任何堿基），若該序列缺失，Cas9核酸酶將無法完成切割，該序列作用是 。結(jié)合圖1分析，堿基序列中虛線代表 ，從表達結(jié)果看，敲除基因會導(dǎo)致 。該基因敲除導(dǎo)致的變異類型屬于 。
(2)為探究ZmCCT9基因的表達模式，研究人員測定玉米發(fā)育過程中不同部位ZmCCT9表達量（圖2），結(jié)果表明 。還測定在LD和SD下溫帶玉米和熱帶玉米的成熟葉片中ZmCCT9的晝夜表達量（圖3），結(jié)果顯示，在LD條件下， 。
(3)為探究馴化過程中玉米適應(yīng)長日照的分子機制，測序發(fā)現(xiàn)溫帶玉米和熱帶玉米的ZmCCT9基因編碼區(qū)無顯著變異位點，但前者在基因上游攜帶了一段特殊序列（TE元件）。
①據(jù)此推測，TE元件的功能是 。為證明TE元件的功能，需利用相關(guān)載體和元件構(gòu)建LUC基因（一種熒光素酶基因）表達載體，圖4長方框中構(gòu)建的相關(guān)元件的先后位置是 （用圖中字母排序）。
②可以預(yù)測，實驗組玉米細(xì)胞熒光比對照組玉米細(xì)胞熒光 （填寫“強”或“弱”）。
③根據(jù)以上材料，請完善溫帶玉米適應(yīng)長日照的調(diào)控機制。ZmCCT9啟動子（含TE）→ →適應(yīng)長日照環(huán)境
7、（2024屆江蘇省泰州市高三下學(xué)期調(diào)研測試（一模））近期，人類第一款基于CRISPR技術(shù)的Casgevy療法獲準(zhǔn)用于治療鐮狀細(xì)胞貧血等疾病。相關(guān)信息如下圖1和圖2所示。請回答下列問題：

(1)鐮狀細(xì)胞貧血是一種 遺傳病，患者β珠蛋白分子中纈氨酸代替了谷氨酸，致使去氧血紅蛋白溶解度降低并聚集形成纖維結(jié)構(gòu)，壓迫細(xì)胞膜致紅細(xì)胞彎曲成鐮刀狀。由此說明 控制生物體的性狀。
(2)γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點，BCL11A蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，可抑制胎兒血紅蛋白的合成。出生后，隨著個體的發(fā)育進行，BCL11A蛋白的 ，γ基因的表達逐漸被 。鐮狀細(xì)胞貧血患者一般在出生一年后出現(xiàn)癥狀，而嬰兒通常無癥狀，請嘗試解釋原因： 。
(3)據(jù)圖2判斷，Cas9是一種 酶，能催化 鍵水解，但需要依賴 識別基因組DNA上的靶點序列，才能使DNA分子在特定序列附近被切斷。
(4)Casgevy療法大致過程：從患者體內(nèi)提取合適的造血干細(xì)胞，通過電穿孔導(dǎo)入特異性靶向BCL11A增強子的CRISPRCas9基因編輯系統(tǒng)，獲得 細(xì)胞，恢復(fù)胎兒血紅蛋白的合成。與骨髓移植相比，Casgevy療法的突出優(yōu)點是 。
8、（2024屆江蘇省泰州市高三下學(xué)期調(diào)研測試（一模））膽固醇O酰基轉(zhuǎn)移酶1(SOAT1)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，可作為潛在的肝癌生物標(biāo)志物?？蒲腥藛T從肝癌細(xì)胞Huh7中獲取SOAT1基因，經(jīng)原核表達、蛋白質(zhì)純化后免疫小鼠制備單克隆抗體。請回答下列相關(guān)問題：
(1)從肝癌細(xì)胞Huh7中提取 ，通過 獲得SOAT1的cDNA。
(2)根據(jù)SOAT 1的編碼序列設(shè)計的兩個引物如下圖1。引物F加入的EcR Ⅰ酶切位點位于 端，引物R上添加的XhⅠ酶識別的回文序列的6個堿基是 。
(3)利用上述引物對SOAT1基因進行PCR擴增，該實驗設(shè)計的擴增程序中熱循環(huán)次數(shù)為30次，一般PCR反應(yīng)中設(shè)計的熱循環(huán)次數(shù)不超過40次，原因是 。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠 后，對PCR產(chǎn)物進行膠回收。
(4)將膠回收后的PCR產(chǎn)物和載體pET32a分別用EcRⅠ和XhⅠ雙酶切，加入DNA連接酶后在冰面上過夜。在冰面上操作的目的是 。在將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌前用CaCl2處理大腸桿菌，使其處于 的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。
(5)將測序正確的重組載體誘導(dǎo)表達并進行電泳，實驗部分結(jié)果見下圖2，SOAT 1重組蛋白的相對分子質(zhì)量為50 kD左右，下圖中基本符合要求的條帶包括 。
(6)用純化的SOAT1重組蛋白免疫小鼠，利用 技術(shù)獲得SOAT1單克隆抗體細(xì)胞株以制備單克隆抗體。
9、（2024屆江蘇省常州市前黃高級中學(xué)高三下學(xué)期一模適應(yīng)性考試）Ndrg2基因參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展，并可參與血管的形成。為研究Ndrg2基因的功能，可利用染色體位點特異性重組酶系統(tǒng)Cre-LxP構(gòu)建Ndrg2基因敲除小鼠（如下圖1、2所示），并對其進行鑒定和表型分析。請回答下列問題：

(1)圖1中LxP序列的方向取決于序號 對應(yīng)的區(qū)域。一個LxP序列的內(nèi)部被Cre重組酶切割后會增加 個游離的磷酸基團。
(2)當(dāng)兩個lxP序列位于同一個DNA分子上且方向相同時，Cre重組酶能將兩個切割位點之間的核苷酸序列切除并形成環(huán)狀而失活，剩余序列會連接起來。據(jù)此可知，Cre重組酶在此過程中的作用類似于 酶。當(dāng)兩個LxP序列方向相反時，Cre重組酶使兩個lxP間的序列顛倒，由此產(chǎn)生的變異本質(zhì)上屬于 。
(3)構(gòu)建Ndrg2基因敲除小鼠需要先構(gòu)建Flx小鼠（該小鼠的Ndrg2基因兩側(cè)需插入Lxp序列）。為構(gòu)建相應(yīng)的基因表達載體，據(jù)圖2分析，應(yīng)選擇限制酶 處理含有Ndrg2基因的DNA片段，而在處理質(zhì)粒時應(yīng)選用限制酶 。質(zhì)粒中啟動子的作用是 。
(4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠 。經(jīng)胚胎工程獲得雜合Flx小鼠（flx/+）,之后雌雄小鼠相互交配可獲得純合Flx小鼠。
(5)構(gòu)建Ndrg2基因敲除小鼠還需要構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（cre/+）（Cre基因上游添加有造血干細(xì)胞基因啟動子EDAG）。已知Ndrg2基因與Cre重組酶基因獨立遺傳，現(xiàn)將純合Flx小鼠（flx/flx）與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（cre/+）交配，將F1中的雙雜合小鼠雌雄交配，獲得造血干細(xì)胞中Ndrg2基因完全敲除的小鼠的概率為 。
(6)以下能說明造血干細(xì)胞中Ndrg2基因完全敲除小鼠構(gòu)建成功的有 。
①小鼠不同組織中提取的DNA可檢測到cre基因
②小鼠造血干細(xì)胞中Ndrg2基因的mRNA基本為零
③利用抗原抗體雜交技術(shù)在造血干細(xì)胞中檢測不到有Ndrg2蛋白
10、（江蘇省南通市如皋市2023-2024學(xué)年高三下學(xué)期一?？荚嚕┑僦x是荔枝的重要害蟲?？蒲腥藛T培育轉(zhuǎn)基因抗蟲荔枝的過程如下圖1所示。圖2是SalI、HindⅢ和BamHI三種限制酶的識別序列和切割位點。請回答下列問題：
(1)與RNA相比，質(zhì)粒特有的化學(xué)成分是 ；抗氨芐青霉素基因的作用是 。
(2)研究人員采用了如下圖巢式PCR技術(shù)獲取抗蟲基因，巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物（也稱外引物）擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部，也稱內(nèi)引物）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。
①PCR擴增時加入引物的原因是 ，在最后一個循環(huán)結(jié)束后通常還需要維持72℃5min的目的是 ，PCR產(chǎn)物常采用 來鑒定。
②相比于常規(guī)PCR，巢式PCR獲得錯誤目標(biāo)產(chǎn)物概率 ，這是因為 。
③為了使抗蟲基因定向插入質(zhì)粒中，第二次PCR擴增時需要在兩個引物5'端分別添加的序列是 ，不添加在引物3'端的原因是 。
(3)科研人員采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗蟲基因?qū)肜笾?xì)胞，由于農(nóng)桿菌中的 ，能攜帶目的基因進入受體細(xì)胞，并將目的基因整合到受體細(xì)胞 上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗蟲性狀，可采用鑒定方法是 。
11、（江蘇省泰州市2023-2024學(xué)年高三下學(xué)期一模調(diào)研）α-環(huán)糊精是食品、醫(yī)藥等常用原料。α-環(huán)糊精葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶（cgt）生產(chǎn)α、β和γ環(huán)糊精的混合物，分離純化十分不便。cgt在芽孢桿菌中的產(chǎn)量較低，誘變效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和89位酪氨酸是酶與底物作用的關(guān)鍵位點，江南大學(xué)一實驗室將它們分別替換為賴氨酸和精氨酸后，形成的重組cgt 催化特異性提高了27倍。請回答下列問題。
(1)蛋白質(zhì)工程的第一步通常是確定預(yù)期的 。重疊PCR是常用的DNA定點突變技術(shù)，其原理如圖所示。與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR不需要用到 酶。要完成兩處位點的突變，至少要設(shè)計 種引物。
(2)下圖是該酶編碼鏈的部分序列，請你設(shè)計替換372位天冬氨酸（密碼子：GAU、GAC）到賴氨酸（密碼子：AAA、AAG）的引物FP2和RP1中三個連續(xù)堿基，分別為 、 。
(3)用大腸桿菌大量生產(chǎn)重組cgt需要解決酶的分泌問題。重組cgt位于雙突變載體（簡稱Ｔ載體）上，研究人員將重組cgt基因與pET-20b（+）載體（簡稱p載體）上的pelB信號肽序列連接，構(gòu)成重組載體cgt-p，該過程如圖所示。應(yīng)選用 、 對T載體酶切處理，用 、 對p載體進行酶切處理，并用 酶構(gòu)建重組載體cgt-p，導(dǎo)入目的工程菌。培養(yǎng)基中除基本營養(yǎng)外，還需加入 完成篩選。
12、（2024屆江蘇省宿遷市高三 一模調(diào)研）葉用萵苣（如生菜）是大眾喜愛蔬菜，夏季高溫極易引起先期抽苔造成減產(chǎn)，泛素連接酶（LsE3）是研究人員在萵苣高溫抽苔植株中篩選得到的。LsE3基因受溫度調(diào)控，影響萵苣抽苔，但是LsE3基因作用機制尚不清楚。研究人員用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建萵苣LsE3基因的表達載體用于研究其分子機理。無縫克隆技術(shù)是構(gòu)建表達載體的一種技術(shù)如圖2。

(1)目的基因獲取，在 條件下，提取先期抽苔萵苣細(xì)胞中 ，經(jīng) 獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增LsE3基因。PCR擴增除了圖1標(biāo)出的物質(zhì)以外，還需加入 （至少寫兩種）。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中需要兩種引物F（左側(cè)）、R（右側(cè)）選用 （選項中為引物部分序列，方向為5'→3'）。
A．GATTAG------TGTTGGB．CCAACA------CTAATCC． TAGGTG------AGACCT D．AGGTCT------CACCTA
(2)表達載體構(gòu)建，近年來新一代無縫克隆技術(shù)發(fā)展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成為目前研究的熱點。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技術(shù)（如圖2）。 T4 DNA 聚合酶在反應(yīng)體系中沒有添加dNTP情況下具有 3'→5'外切酶活性；在反應(yīng)體系中添加dNTP情況下具有5'→3'聚合酶活性；在反應(yīng)體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時，外切酶活性和聚合酶活性同時發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應(yīng)，產(chǎn)生指定長度的單鏈黏性末端。請結(jié)合圖1和圖2回答下列問題：
①LIC技術(shù)構(gòu)建表達載體，圖1中利用PCR擴增LsE3基因，反應(yīng)液中加入T4 DNA聚合酶和 處理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質(zhì)粒獲得 末端，后加T4 DNA聚合酶和 處理質(zhì)粒。處理后將兩者混合、退火并導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)完成重組克隆。
②LIC技術(shù)依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術(shù)，后經(jīng)過多次改進，Qi等建立了RQ-SLIC技術(shù)，用EcRⅤ酶切割質(zhì)粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當(dāng)時間，將混合物加熱到72℃，目的是 ，緩慢降溫（退火）后移入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)形成完整重組質(zhì)粒，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)過程中用到 酶。
(3)導(dǎo)入受體細(xì)胞，取葉用萵苣幼芽經(jīng) （過程）形成愈傷組織備用，用 處理農(nóng)桿菌后導(dǎo)入重組質(zhì)粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入 植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出成功導(dǎo)入質(zhì)粒的植物細(xì)胞。
13、（2024屆江蘇省南京市、鹽城市高三一模）研究發(fā)現(xiàn)實體腫瘤內(nèi)部通常是缺氧環(huán)境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖體，使蛋白合成受阻，從而引起細(xì)胞死亡。TAT是一種短肽，可轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進入細(xì)胞，含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)低氧條件穩(wěn)定存在，但在常氧條件下會被蛋白酶降解?？蒲腥藛T以RTA作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性分子，利用TAT的作用將融合蛋白轉(zhuǎn)運進入腫瘤細(xì)胞，并利用ODD的作用減輕RTA對正常細(xì)胞的毒性，分別構(gòu)建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表達載體，并成功得到相關(guān)融合蛋白。
(1)可通過PCR技術(shù)獲取融合基因TAT-RTA，前提是根據(jù)TAT和RTA基因設(shè)計引物，引物的作用是 。已知RTA基因和欲得到的TAT-RTA融合基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示，TAT基因編碼鏈序列為5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3'，為順利構(gòu)建表達載體，需在引物1、2的 端分別加入 酶切位點；要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，則引物1的前12個堿基序列為 。
A、5'GGATCCATGAGC3'B．B、5'GGATCCATCTTC3'C．C、5'GGATCCTACTCG3'D．D、5'CTCGAGATGAGC3'
(2)載體的部分結(jié)構(gòu)如圖2所示，His標(biāo)簽由連續(xù)的6個組氨酸構(gòu)成，可用于對重組融合蛋白進行分離純化。將PCR得到的TAT-RTA融合基因和載體雙酶切后，再用 酶連接。但在研究時發(fā)現(xiàn)融合蛋白中沒有His標(biāo)簽蛋白，據(jù)圖分析原因很可能是 ；為使His標(biāo)簽正常表達，可在A堿基左右兩側(cè)各插入1個堿基，正常情況下最多可對應(yīng) 種密碼子。
14、（2024屆江蘇省南通市高三第一次調(diào)研測試）重疊延伸PCR定點突變過程分為兩步，如圖1。內(nèi)皮抑素能通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的生成限制腫瘤細(xì)胞的生長。研究人員利用重疊延伸PCR定點突變技術(shù)將內(nèi)皮抑素基因end改造為能進入癌細(xì)胞并有較強抑癌作用的突變基因end（m），并再與抗Her2（人表皮生長因子受體2）的納米抗體基因Dim形成融合基因Dim-end（m），導(dǎo)入大腸桿菌并表達，主要過程如圖2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，調(diào)節(jié)基因LacI的表達產(chǎn)物能和操縱基因LacO結(jié)合抑制基因的表達，IPTG能與Lac1的表達產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)目的基因的表達。請回答下列問題。
(1)圖1中PCR1和PCR2配制反應(yīng)體系時需加入不同的 。圖2中構(gòu)建重組質(zhì)粒時使用的限制酶是 。
(2)下列①~⑥是相關(guān)引物，其中突變1F為引物①，則突變1R、突變2F、突變2R分別為 、 、 。
①5'-GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC-3'
②5'-CCGGAATTCCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3'
③5'-GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC-3'
④5'-GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG-3'
⑤5'-ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG-3'
⑥5'-CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC-3'
(3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌由于調(diào)節(jié)基因LacI的表達產(chǎn)物能和操縱基因LacO結(jié)合，阻止 酶的移動，抑制Dim-end（m）的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)菌株擴大培養(yǎng)到一定數(shù)量后在培養(yǎng)基中加入 ，使Dim-end（m）持續(xù)表達。
(4)研究表明，乳腺癌常出現(xiàn)Her2基因的高表達（不同乳腺癌細(xì)胞的表達有差異），因此Her2被認(rèn)為是乳腺癌檢測和治療的重要靶點。研究人員用不同濃度Dim-end（m）融合蛋白處理乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺細(xì)胞HBL100作為實驗組，選取正常培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞作為對照組，一段時間后分別測定對照組和實驗組的細(xì)胞數(shù)并計算抑制率，結(jié)果如圖所示，抑制率的計算公式是 。Dim-end（m）融合蛋白對不同乳腺癌細(xì)胞的抑制率不同，其可能原因是 。
(5)納米抗體是傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū)片段，只有傳統(tǒng)抗體的1/10，但內(nèi)部存在更多的二硫鍵，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體的優(yōu)點是 。
15、（2024屆江蘇省連云港市高三一模）豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）是感染豬的一種常見病原體，科研人員利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)培育PRRSV抗性豬品種，原理如下圖所示。據(jù)圖回答下列問題：
(1)構(gòu)建表達載體時，科研人員需要根據(jù) 設(shè)計表達載體中的cDNA序列。
(2)將構(gòu)建完成的表達載體與豬胚胎成纖維細(xì)胞混合后，需要在培養(yǎng)基中加入 以篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。將篩選出的細(xì)胞移植入豬 細(xì)胞內(nèi)，得到重組細(xì)胞。重組細(xì)胞在體外培養(yǎng)至早期胚胎后，進行 ，獲得轉(zhuǎn)基因豬。
(3)獲得轉(zhuǎn)基因豬后，科研人員需要在多個水平上檢測轉(zhuǎn)基因是否成功。將下列表格填寫完整：
(4)在轉(zhuǎn)基因成功的豬體內(nèi)，cDNA轉(zhuǎn)錄出shRNA后，Dicer酶通過切割 鍵加工shRNA產(chǎn)生siRNA，siRNA通過 來抑制病毒增殖。限制酶種類
識別序列及切割位置
BamHⅠ
5＇-G↓GATCC-3＇
BclⅠ
5＇-T↓GATCA-3＇
Sau3Ⅰ
5＇-↓GATC-3＇
HindⅢ
5＇-A↓AGCTT-3＇
EcRⅠ
5＇-G↓AATTC-3＇
檢測水平
實驗方法
實驗操作
實驗結(jié)果
DNA水平
熒光定量PCR（qPCR）
將從轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)提取的DNA和等量標(biāo)準(zhǔn)樣品，用shRNA表達載體特異性引物進行qPCR，qPCR中加入了熒光染料，熒光強度與雙鏈DNA數(shù)量成正比，每個循環(huán)檢測熒光強度，其達到標(biāo)準(zhǔn)值所需的循環(huán)數(shù)稱為Ct值
標(biāo)準(zhǔn)樣品Ct值為18，提取DNA的Ct值為20，說明提取DNA中含有表達載體量是標(biāo)準(zhǔn)樣品的① 倍
RNA水平
核酸分子雜交
從轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)提?、? ，用放射性標(biāo)記的③ 片段作為探針與其進行雜交
轉(zhuǎn)基因組有雜交帶，非轉(zhuǎn)基因組沒有
個體水平
鑒定抗病毒性狀
用④ 感染轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬
相對于非轉(zhuǎn)基因組，轉(zhuǎn)基因組⑤

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