第53講微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用
1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物是發(fā)酵工程的基礎(chǔ)。2.闡明在發(fā)酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的基礎(chǔ)。3.闡明無菌技術(shù)是在操作過程中，保持無菌物品和無菌區(qū)域不被微生物污染的技術(shù)。4.舉例說明通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方可有目的的培養(yǎng)某種微生物。5.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進(jìn)行微生物分離和純化的常用方法。6.概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法是測定微生物數(shù)量的常用方法。
考點一　微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)　
考點二　 微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)
主要考點 必備知識
1.微生物的定義：肉眼難以看清，需要借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。
3.微生物菌落 分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。
由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物就是一個單菌落； 一個單菌落就是一個種群
在實驗室培養(yǎng)微生物的要求？
提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件
確保其它微生物無法混入
（1）培養(yǎng)基的概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。
基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽
無機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有機(jī)碳源：牛肉膏、蛋白胨等
無機(jī)氮源：NH4＋、NO3-
有機(jī)氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素等
(2)培養(yǎng)基的作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。
乳酸桿菌:需要在培養(yǎng)基中添加維生素
霉菌：需將培養(yǎng)基pH調(diào)至酸性
細(xì)菌：需將培養(yǎng)基pH調(diào)至中性或弱堿性
厭氧生物：提供無氧條件
特殊需求：在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的需求，培養(yǎng)基的成分舉例如下：
（1）培養(yǎng)基的概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。
補充說明（1）含有C、H、O、N的有機(jī)物可作為異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源；（2）自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于碳源；（3）自養(yǎng)型微生物所需的碳源來自無機(jī)碳源，異養(yǎng)型微生物所需的碳源來自有機(jī)碳源，因此可以根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型；（4）無機(jī)氮源不但能給自養(yǎng)型微生物提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學(xué)能）（5）無機(jī)鹽除了可以調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，有些無機(jī)鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細(xì)菌）
培養(yǎng)基的配制原則(1)目的要明確：不同的微生物需求不同，根據(jù)培養(yǎng)目的進(jìn)行配制。(2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。(3)pH要適宜：為維持pH的相對恒定，可在培養(yǎng)基中加入緩沖劑，常用K2HPO4－KH2PO4。
液體培養(yǎng)基：擴(kuò)大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)
固體培養(yǎng)基：純化（分離）、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種
有無 凝固劑瓊脂
實驗室常用的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基
瓊脂（agar）是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)固態(tài)。
天然培養(yǎng)基：利用天然的動、植物或微生物包括其提取物制成的培養(yǎng)基。其營養(yǎng)成分復(fù)雜而豐富，難以確切了解培養(yǎng)基的化學(xué)成分。合成培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的營養(yǎng)需求，將各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成的培養(yǎng)基。半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學(xué)物質(zhì)、一部分天然物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。（舉例：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）
注意：人工合成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分明確（第2個）；含化學(xué)成分不 明確的天然物質(zhì)（其他2個）
拓展：培養(yǎng)基的類型之其他劃分方式
鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的代謝特點在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品，進(jìn)而產(chǎn)生特定的顏色或其他變化。
①加入青霉素的培養(yǎng)基：分離酵母菌、霉菌等真菌
②不加氮源的無氮培養(yǎng)基：分離固氮菌
①加入伊紅美藍(lán)的培養(yǎng)基：鑒別大腸桿菌
②加入剛果紅的培養(yǎng)基：鑒別纖維素分解菌
選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。
關(guān)鍵：在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。
常用方法：主要包括消毒和滅菌。
目的：獲得純凈的微生物培養(yǎng)物
(1)消毒是指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。 可殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62-65℃煮30min或 80℃-90℃下處理30s-1min。 可殺死絕大多數(shù)微生物，不破壞食物的營養(yǎng)成分。
③化學(xué)藥物消毒法：用75%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等④紫外線消毒法：對接種室、接種箱或超凈工作臺用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。
概念：用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢：某些細(xì)菌生長到一定階段，在細(xì)胞內(nèi)形成的休眠體
孢子：某些生物的繁殖體
芽孢和孢子具有高度的耐熱性，可抗化學(xué)藥物和抗輻射
①做好消毒和滅菌工作后，要注意避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。②為了避免周圍環(huán)境中微生物的污染，接下來的許多操作都應(yīng)在超凈工作臺上并在酒精燈火焰附近進(jìn)行。
注意：選擇無菌技術(shù)的原則：一要考慮無菌技術(shù)的效果，滅菌的效果比消毒要好；二要考慮操作對象的承受能力，活體生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用滅菌。
較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）
100 ℃煮沸5～6 min
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源
紫外線照射30 min
接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等
直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒
耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等
物品放入干熱滅菌箱,160～170 ℃加熱2～3h
培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產(chǎn)和實驗室常用
高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100 kPa,溫度121 ℃,15～30 min
接種室、接種箱，超凈工作臺
將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體
由單一個體繁殖所獲得的微生物群體
配制培養(yǎng)基→滅菌→接種→分離→培養(yǎng)
采用劃線或涂布的接種方法實現(xiàn)目標(biāo)微生物的分離與純化
①分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見菌落。
②采用平板劃線法或稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上。之后經(jīng)培養(yǎng)得到的的單菌落一般是由單個為微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。
通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基（平板）表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到由單個微生物繁殖而形成的單菌落。
(1)酵母菌純培養(yǎng)的操作步驟
制備培養(yǎng)基(配制培養(yǎng)基、滅菌、倒平板)↓接種和分離酵母菌↓培養(yǎng)酵母菌(將接種后的平板和一個未接種的平板倒置、培養(yǎng))
稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖、15～20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。
加葡萄糖/蔗糖(20g)
加水定容(1000mL)
將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15～30min。將5～8套培養(yǎng)皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃滅菌2h。
放入高壓蒸汽滅菌鍋中(100kPa、121℃)
②將瓶口迅速通過火焰。
③用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10 ~ 20mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。
④等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過來放置。
防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基
待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。
在接種前隨機(jī)取若干個滅菌后的未接種的平板，先行培養(yǎng)了一段時間，這樣做的目的是？
檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格
注意：平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。
通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。
1、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。
2、在火焰旁冷卻接種環(huán)，并拔出裝有酵母菌的棉塞
3、將試管口通過火焰
.4、將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液
5、將試管通過火焰，并塞上棉塞
6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基
7、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連
8、將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（1）接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次。（2）劃線首尾不能相接。（3）每次劃線前接種環(huán)進(jìn)行滅菌。（4）劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。（5）不能劃破培養(yǎng)基，一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。
思考1 為什么要將平板倒置（背誦）？
思考2 為什么要同時放入未接種的平板？
既可以防止培養(yǎng)基表面的水分揮發(fā)；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。
作對照，該培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染。
完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右(培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48 h。
制備培養(yǎng)基(配制培養(yǎng)基、滅菌、倒平板)↓接種和分離酵母菌↓培養(yǎng)酵母菌(將接種后的平板和一個　　　的平板倒置、培養(yǎng))
考向 培養(yǎng)基與無菌技術(shù)
1.消毒和滅菌是兩個不同的概念，滅菌是指徹底殺滅微生物使其永遠(yuǎn)喪失生長繁殖的能力。消毒僅指殺死一部分對人體有害的病原菌而對被消毒的物體基本無害。下列哪些事物適用于消毒處理(　　)①皮膚?、陲嬘盟、叟Ｄ獭、茏⑸淦鳍菖囵B(yǎng)皿?、藿臃N環(huán)?、吲囵B(yǎng)基　⑧果汁⑨醬油?、馐中g(shù)刀A．①②③⑧⑨ B．④⑤⑥⑦C．①②③④⑤⑥ D．以上全部
解析：消毒指用比較溫和的方法殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，適用于那些不耐高溫的液體，如③牛奶、⑧果汁、⑨醬油，這樣可以使其中的營養(yǎng)成分不被破壞；對要求不是很嚴(yán)格的①皮膚、②飲用水也用消毒的方法處理；而對于嚴(yán)格要求的④注射器、⑤培養(yǎng)皿、⑥接種環(huán)、⑦培養(yǎng)基、⑩手術(shù)刀等必須進(jìn)行滅菌處理。所以，①②③⑧⑨應(yīng)該用消毒的方法處理，A正確，BCD錯誤。故選A。
對點訓(xùn)練1．自然界里有多種微生物，將其進(jìn)行合理的篩選、培養(yǎng)和應(yīng)用，能給醫(yī)藥和化工等生產(chǎn)領(lǐng)域帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益?；卮鹣铝袉栴}：(1)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時，多采取_____________法，而對接種環(huán)或涂布器滅菌時則用________法，若要將微生物采用平板劃線法進(jìn)行分離操作，在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)進(jìn)行了5次劃線，則需要對接種環(huán)灼燒________次。平板劃線在做第二次及其后的劃線操作時，要從上次劃線的________開始劃線，最后一次劃的線不能與第一次劃的線________。
(2)將接種后的固體培養(yǎng)基和一個未接種的固體培養(yǎng)基放入恒溫箱中______培養(yǎng)，以減少培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)。其中，培養(yǎng)未接種的固體培養(yǎng)基是為了______________________________。長期保存菌種時，應(yīng)將培養(yǎng)的菌液與甘油充分混勻后，放在－20 ℃的冷凍箱中保存。
作為對照組，排除培養(yǎng)基被雜菌污染
(3)甲、乙兩組同學(xué)用稀釋涂布平板法測定某種微生物的數(shù)量，在同一稀釋倍數(shù)下每隔一段時間記錄數(shù)據(jù)(統(tǒng)計時間內(nèi)微生物總數(shù)小于環(huán)境容納量)，得到如表結(jié)果：
據(jù)表可知，計數(shù)時最好取培養(yǎng)________小時記錄的菌落數(shù)作為實驗結(jié)果，一方面是由于培養(yǎng)時間較短，會遺漏菌落數(shù)目，另一方面是由于___________________________________________。
培養(yǎng)時間過長，兩個或多個菌落連成一個菌落
解析：(1)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時，多采取高壓蒸汽滅菌法，而對接種環(huán)或涂布器滅菌時則用灼燒滅菌法。接種環(huán)在每次接種前都要灼燒滅菌，最后一次接種完也要滅菌，所以在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)進(jìn)行了5次劃線，需要對接種環(huán)灼燒6次。平板劃線在做第二次及其后的劃線操作時，要從上次劃線的末端開始劃線，使菌體的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終獲得由單個菌體形成的單個菌落。最后一次劃的線不能與第一次劃的線相連。(2)將接種后的固體培養(yǎng)基和一個未接種的固體培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，以減少培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)。培養(yǎng)未接種的固體培養(yǎng)基是為了作為對照組，排除培養(yǎng)基被雜菌污染。長期保存菌種時，應(yīng)將培養(yǎng)的菌液與甘油充分混勻后，放在－20 ℃的冷凍箱保存。(3)根據(jù)表中數(shù)據(jù)可知，甲組和乙組中的菌落數(shù)都在72小時達(dá)到最大，由此推知最好取72小時記錄的菌落數(shù)作為實驗結(jié)果，原因：①培養(yǎng)時間不足會遺落菌落數(shù)目；②培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致兩個或多個菌落連成一個菌落，使計數(shù)不準(zhǔn)確。
考向二　微生物的純培養(yǎng)
2.如圖為實驗室培養(yǎng)和純化大腸桿菌的部分操作步驟，下列說法正確的是(　　)
A．步驟②中打開含菌種的試管后需將試管口通過酒精燈火焰滅菌B．步驟④中接種環(huán)共需5次灼燒處理C．將接種后的圖④平板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時無須倒置D．①②③步驟操作時都不需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行
解析:打開含菌種的試管需通過火焰滅菌，取出菌種后需再次通過火焰，塞上棉塞才可以，A正確；每次接種前后都要灼燒接種環(huán)，因此完成步驟④中的5次劃線操作共需灼燒接種環(huán)6次，B錯誤；劃線接種結(jié)束后，將平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這樣可以防止表面的水分過快揮發(fā)和防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，C錯誤；①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止被雜菌污染，D錯誤。
對點訓(xùn)練2．微生物培養(yǎng)時常利用無菌技術(shù)避免雜菌的污染，相關(guān)敘述錯誤的是(　　)A．配制好的培養(yǎng)基應(yīng)放入干熱滅菌箱中進(jìn)行干熱滅菌B．實驗中避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸C．接種前后的接種環(huán)都要在酒精燈火焰上進(jìn)行灼燒D．實驗結(jié)束后對實驗室噴灑石碳酸同時配合紫外線照射
解析：對培養(yǎng)基滅菌的方法是高壓蒸汽滅菌法，A錯誤；為避免雜菌污染，實驗中應(yīng)避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸，B正確；為了防止雜菌污染，每次接種前后，接種環(huán)都要進(jìn)行灼燒滅菌，C正確；紫外線能破壞DNA結(jié)構(gòu)，密閉空間內(nèi)的空氣常采用紫外線照射消毒，噴灑石碳酸同時配合紫外線照射可提高對密閉空間的消毒效果，D正確。故選A。
1.培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機(jī)鹽，有時還需要加入一些特殊的物質(zhì)(　　)2.消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細(xì)胞的傷害(　　)3.無菌操作的對象只要是沒有生物活性的材料(如培養(yǎng)基、接種環(huán)等)都可采用高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌(　　)4.配制培養(yǎng)基時應(yīng)先滅菌再調(diào)pH(　　)5.平板劃線法中每一次劃線后要將接種環(huán)灼燒(　　)6.倒平板時，應(yīng)將打開的皿蓋放到一邊，以免培養(yǎng)基濺到皿蓋上(　　)
1.(選擇性必修3 P10)培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括　　　　　　　　　　　等。2.(選擇性必修3 P10)獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是　　　　　　，無菌技術(shù)除了用來　　　　　　　　　　　　　　　　　　　外，還能___　　　　　　　　　　　　　　。3.選擇性必修3 P10“旁欄思考”：培養(yǎng)基中加入氮源的原因是_____________________________________________　　　　　。4.選擇性必修3 P10“相關(guān)信息”：生物消毒法是指利用生物或其_____除去環(huán)境中的部分微生物的方法。
水、無機(jī)鹽、碳源、氮源
防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染
有效避免操作者自身被微生物感染
培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的
5.(選擇性必修3 P12)菌落是指____________________________________　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。采用_____　　法和　　　　　　法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。
分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)
部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體
6.(選擇性必修3 P12)平板冷凝后，要將平板倒置的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以減少培養(yǎng)基中的水分過快地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染
7.選擇性必修3 P13“結(jié)果分析”：如果在未接種的培養(yǎng)基表面有菌落，說明　　　　　　　　。
8.(選擇性必修3 P13)操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了________________　　　　　　　　　?。幻看蝿澗€前灼燒接種環(huán)是為了_________________________________________________________________________________________________，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能__________________________________________________________。9.(選擇性必修3 P13)在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進(jìn)行劃線的原因是　　　　　　　　　　　　　　　。
束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端
接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者
以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種
10.(選擇性必修3 P13)在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要
少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落
微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)
1.區(qū)分選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基
對土樣充分稀釋后，將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上，即稀釋涂布平板法。
1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌？
稀釋涂布平板法:是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。
注意：稀釋度足夠高時，能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。包括系列稀釋（梯度稀釋）和涂布平板兩個步驟
稀釋涂布平板法及其操作過程
①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。
④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。
⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。
注意：移液管要經(jīng)過滅菌，并且操作應(yīng)在酒精燈火焰附近完成。
注意：1.10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已稀釋10倍，再計算時，不要忽略；2.由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因為有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來生長繁殖，所以還需要進(jìn)一步驗證；3.過程中所有操作都應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；4.將涂布器從酒精中取出時，要讓多于的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。
稀釋涂布平板法除可以分離微生物外，也常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。
不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。 細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d； 放線菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)5～7d； 霉菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。 每隔24 h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。
(1)間接計數(shù)法——稀釋涂布平板法
計數(shù)原則 ①一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板計數(shù)； ②在同一稀釋度下，應(yīng)至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值。 ③適當(dāng)?shù)南♂尪?、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。分析實驗結(jié)果時，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。
當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不用活菌數(shù)來表示。
每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M
C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；
V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)
某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的細(xì)菌數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）。（ ） A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)
原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)直接計數(shù)法——顯微鏡直接計數(shù)
快速、直觀，能觀察微生物的形態(tài)特征。
不能區(qū)分死菌和活菌，統(tǒng)計結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和
土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶。利用尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。
4.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)的實驗操作(1)分離原理
設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。
設(shè)置對照的方法： ①空白對照：不給對照組任何處理因素； ②條件對照：給對照組施以部分實驗因素，但不是所要研究的處理因素； ③自身對照：對照組和實驗組都在同一研究對象上進(jìn)行； ④相互對照：不單設(shè)對照組，而是幾個實驗組相互對照。
對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。
實驗的具體操作：（一）土壤取樣（二）配制土壤溶液和制備培養(yǎng)基（三）系列稀釋（四）涂布平板（五）微生物的培養(yǎng)、觀察及菌落計數(shù)（六）鑒定
①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。細(xì)菌適宜在該環(huán)境中生長。（細(xì)菌適宜在該環(huán)境中生長）②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。（細(xì)菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。）
應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。
配制土壤溶液和制備培養(yǎng)基
①選擇培養(yǎng)基 以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。
在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行。 分離不同的微生物采用不同的稀釋度。
為保證獲得菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計數(shù)，可將細(xì)菌稀釋倍數(shù)為1×103～1×107的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)。
選用1×104、1×105、1×106 、1×107倍稀釋倍數(shù)進(jìn)行涂布平板
實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度培養(yǎng)物等。 如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30~300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。
微生物的培養(yǎng)、觀察及菌落計數(shù)
在本實驗中，我們可以每隔24 h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。
待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。
倒置于30~37℃下培養(yǎng)1~2d
菌落的特征包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面。
酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌，
伊紅一美藍(lán)培養(yǎng)基：鑒定大腸桿茵 原理：代謝產(chǎn)物與伊紅—美藍(lán)結(jié)合→菌落呈深黑色。
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→酚紅變紅→脲酶陽性
通過連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散。
將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)，以得到單菌落
稀釋度合適，整個平板上都可找到單菌落
分離純化菌種，獲得單菌落
①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計數(shù)
①都能分離純化菌種；②都是在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行的
考向　微生物的選擇培養(yǎng)
1.下列關(guān)于微生物培養(yǎng)和分離的說法中，正確的是(　　)A．先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，立即出現(xiàn)有透明圈的菌落B．篩選纖維素分解菌的實驗流程中不可省略選擇培養(yǎng)這一步C．菌落的大小、顏色、有無莢膜、隆起程度等特征都可作為菌種肉眼鑒定的依據(jù)D．在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑可初步鑒定尿素分解菌
解析:先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，此種方法需用氯化鈉洗去浮色，再觀察出現(xiàn)有透明圈的菌落，A錯誤；選擇培養(yǎng)可省略，但培養(yǎng)分離的纖維素分解菌少，B錯誤；菌落的大小、顏色、隆起程度等特征都可作為菌種鑒定的依據(jù)，但是有無莢膜通過肉眼無法觀察，C錯誤；在只含有尿素作為氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑可初步鑒定尿素分解菌，D正確。故選D。
[對點訓(xùn)練]1．進(jìn)行垃圾分類收集可以減少垃圾處理時間，降低處理成本?？蒲行〗M欲分離及培養(yǎng)若干種微生物用于對濕垃圾(包括剩菜剩飯、骨頭、菜根菜葉、果皮等食品類廢物)的處理。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)A．在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和操作者的雙手進(jìn)行滅菌B．培養(yǎng)過程需要向培養(yǎng)基通入無菌空氣并進(jìn)行攪拌，目的是使菌體充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧，促進(jìn)細(xì)菌繁殖C．科研小組若從生活垃圾中分離分解尿素的微生物，可在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果有尿素分解菌存在，則培養(yǎng)基中該菌落的周圍會出現(xiàn)黑色D．該實驗培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，無需進(jìn)行未接種培養(yǎng)基的培養(yǎng)
解析:　在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行滅菌處理，對操作者的雙手進(jìn)行消毒處理，A錯誤；培養(yǎng)過程需要向培養(yǎng)基通入無菌空氣并進(jìn)行攪拌，目的是使菌體充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧，促進(jìn)細(xì)菌生長繁殖，B正確；科研小組若從生活垃圾中分離分解尿素的微生物，可在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素，C錯誤；進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的同時需進(jìn)行未接種培養(yǎng)基的培養(yǎng)，其對照作用，D錯誤。故選B。
考向　微生物的分離和計數(shù)
2.某興趣小組從校園土壤取樣，進(jìn)行“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)”實驗。小明從稀釋度為106培養(yǎng)基中篩選出約120個菌落，而其他同學(xué)只篩選出約40個菌落。下列敘述錯誤的是(　　)A．小明出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因是和其他同學(xué)取樣的土壤不同B．要證明培養(yǎng)基是否受到污染，可將小明配制的培養(yǎng)基不接種進(jìn)行培養(yǎng)C．當(dāng)稀釋倍數(shù)太小時，可能由于菌落重疊導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏小D．其他同學(xué)土樣的細(xì)菌懸液中分解尿素的細(xì)菌數(shù)量約為4×108個
解析:小明篩選出的菌落數(shù)明顯比其他同學(xué)多，出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因是和其他同學(xué)取樣的土壤不同，也有可能是培養(yǎng)基混入其他氮源或培養(yǎng)基被污染，A正確；要證明培養(yǎng)基是否受到污染，可將小明配制的培養(yǎng)基不加土樣進(jìn)行培養(yǎng)，即進(jìn)行空白對照，B正確；當(dāng)稀釋倍數(shù)太小時，兩個或兩個以上細(xì)菌連在一起時，培養(yǎng)基上看到的是一個菌落，可能會出現(xiàn)菌落重疊而導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏小，C正確；其他同學(xué)選出約40個菌落，所以土樣的細(xì)菌懸液中分解尿素的細(xì)菌數(shù)量約為40×106＝4×107個，D錯誤。故選D。
[對點訓(xùn)練]2．某同學(xué)將1 mL土壤樣液稀釋100倍，在3個平板上用稀釋涂布平板法分別接入0.1 mL稀釋液，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為56、57和58。下列敘述錯誤的是(　　)A．可得出土壤樣液中活菌數(shù)大約為5.7×107個/LB．此方法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比實際的活菌數(shù)目低C．一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)D．顯微鏡直接計數(shù)法統(tǒng)計的都是稀釋液中活菌數(shù)
解析:將1 mL樣品稀釋100倍，在3個平板上分別接入0.1 mL稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為56、57和58，據(jù)此可得出每升樣品中的活菌數(shù)為(56＋57＋58)÷3÷0.1×1000×100＝5.7×107個，A正確；當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一處菌落，所以統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比實際的活菌數(shù)目低，B正確；一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)，C正確；顯微鏡直接計數(shù)法統(tǒng)計的都是稀釋液中所有個體的數(shù)目，包括死菌，D錯誤。
1.選擇培養(yǎng)基可以鑒定某種微生物的種類(　　)2.尿素在脲酶的催化作用下分解成無機(jī)物(　　)3.對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)只能采用稀釋涂布平板法，而不能用平板劃線法(　　)4.篩選能分解尿素的細(xì)菌所利用的培養(yǎng)基中，尿素是唯一的氮源(　　)5.分解尿素的細(xì)菌在分解尿素時，可以將尿素轉(zhuǎn)化為氨，使得培養(yǎng)基的酸堿度降低(　　)
6.配制培養(yǎng)不同微生物的培養(yǎng)基時都要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性(　　)7.統(tǒng)計菌落數(shù)目時為保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)目最多的平板進(jìn)行統(tǒng)計(　　)
1.(選擇性必修3 P16)選擇培養(yǎng)基是指______________________________　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微
生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基
2.（選擇性必修3 P18）血細(xì)胞計數(shù)板常用于相對　　的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等的計數(shù)；細(xì)菌計數(shù)板常用于相對　　的細(xì)菌等的計數(shù)。
3.(源于選擇性必修3 P18“正文”)統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)的要求是　　。4.(選擇性必修3 P18)當(dāng)__________________________________________　　　　，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目少。
統(tǒng)計3個菌落數(shù)在30～300之間的平板，計算菌落數(shù)的平均值
兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是
5.(選擇性必修3 P19)檢測培養(yǎng)物中是否有雜菌污染的方法是_________　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。判斷選擇培養(yǎng)基是否起到篩選作用的方法是_____________________________________________ 。
菌后的未接種的培養(yǎng)基，觀察是否有菌落產(chǎn)生
配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，觀察選擇培養(yǎng)
基上的菌落數(shù)是否遠(yuǎn)少于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目
6.選擇性必修3 P19“探究·實踐”：本活動初步篩選了能分解尿素的細(xì)菌，請進(jìn)一步借助于生物化學(xué)的方法來鑒定所分離的菌種：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。
分解尿素的細(xì)菌合成的脲酶可以將尿素分解成氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該細(xì)菌能夠分解尿素
7.(選擇性必修3 P20“拓展應(yīng)用2”)在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________。
由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的
環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對較高，從這種土樣中獲得目的微生物的概率要高于普通環(huán)境
1．(2020·浙江7月)下列關(guān)于微生物培養(yǎng)及利用的敘述，錯誤的是(　　)A．利用尿素固體培養(yǎng)基可迅速殺死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)微生物的種類調(diào)整培養(yǎng)基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉發(fā)酵得到糯米酒D．適宜濃度的酒精可使醋化醋桿菌活化
解析:利用尿素固體培養(yǎng)基，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生長繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非殺死，A錯誤；不同的微生物所需的pH不同，所以配置培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)微生物的種類調(diào)整培養(yǎng)基的pH，B正確；酵母菌不能直接利用淀粉，應(yīng)用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌發(fā)酵得到糯米酒，C正確；醋化醋桿菌在有氧條件下利用酒精產(chǎn)生醋酸，D正確。故選A。
2．(2020·江蘇卷)為純化菌種，在鑒別培養(yǎng)基上劃線接種纖維素降解細(xì)菌，培養(yǎng)結(jié)果如下圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．倒平板后需間歇晃動，以保證表面平整B．圖中Ⅰ、Ⅱ區(qū)的細(xì)菌數(shù)量均太多，應(yīng)從Ⅲ區(qū)挑取單菌落C．該實驗結(jié)果因單菌落太多，不能達(dá)到菌種純化的目的D．菌落周圍的纖維素被降解后，可被剛果紅染成紅色
解析:倒平板后無需晃動，A錯誤；Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)沒有出現(xiàn)單菌落，說明細(xì)菌數(shù)量太多，故應(yīng)從Ⅲ區(qū)挑取單菌落，B正確；出現(xiàn)單菌落即達(dá)到了菌種純化的目的，C錯誤；剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)，D錯誤。故選B。
3．葡萄酒生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的釀酒殘渣(皮渣)。目前這些皮渣主要用作飼料或肥料，同時研究者也采取多種措施拓展其利用價值?；卮鹣铝袉栴}：(1)皮渣中含有較多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前將原料干燥、粉碎的目的分別是_______________________________________，萃取效率主要取決于萃取劑的____________。萃取過程需要在適宜溫度下進(jìn)行，溫度過高會導(dǎo)致花色苷________。研究發(fā)現(xiàn)，萃取時輔以纖維素酶、果膠酶處理可提高花色苷的提取率，原因是_______________________________________________________。
利于萃取劑溶解花色苷、使原料與萃取劑充分接觸　
纖維素酶、果膠酶可破壞細(xì)胞壁，有利于提高花色苷的提取率
(2)為了解皮渣中微生物的數(shù)量，取10 g皮渣加入90 mL無菌水，混勻、靜置后取上清液，用稀釋涂布平板法將0.1 mL稀釋液接種于培養(yǎng)基上。104倍稀釋對應(yīng)的三個平板中菌落數(shù)量分別為78、91和95，則每克皮渣中微生物數(shù)量為________個。(3)皮渣堆積會積累醋酸菌，可從中篩選優(yōu)良菌株。制備醋酸菌初篩平板時，需要將培養(yǎng)基的pH調(diào)至__________性，滅菌后須在未凝固的培養(yǎng)基中加入無菌碳酸鈣粉末、充分混勻后倒平板，加入碳酸鈣的目的是_______________________________________________。培養(yǎng)篩選得到的醋酸菌時，在缺少糖源的液體培養(yǎng)基中可加入乙醇作為________。
使培養(yǎng)基不透明，從而使醋酸菌菌落周圍出現(xiàn)透明圈
(4)皮渣堆積過程中也會積累某些兼性厭氧型乳酸菌。初篩醋酸菌時，乳酸菌有可能混入其中，且兩者菌落形態(tài)相似。請設(shè)計一個簡單實驗，區(qū)分篩選平板上的醋酸菌和乳酸菌。(簡要寫出實驗步驟和預(yù)期結(jié)果)。
實驗步驟：將平板置于無氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和透明圈大小預(yù)期結(jié)果：若菌落繼續(xù)生長，且透明圈增大，則為兼性厭氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能繼續(xù)生長，透明圈不再擴(kuò)大，則為醋酸菌菌落
解析:(1)天然食用色素花色苷可用萃取法提取，萃取劑與水應(yīng)不混溶，萃取前將原料干燥，有利于萃取劑溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料與萃取劑充分接觸；萃取效率主要取決于萃取劑的性質(zhì)和使用量。萃取過程需要在適宜溫度下進(jìn)行，溫度過高會導(dǎo)致花色苷分解。萃取時輔以纖維素酶、果膠酶處理，可破壞細(xì)胞壁，有利于提高花色苷的提取率。(2)為了解皮渣中微生物的數(shù)量，取10 g皮渣加入90 mL無菌水，混勻、靜置后取上清液，用稀釋涂布平板法將0.1 mL稀釋液接種于培養(yǎng)基上。104倍稀釋對應(yīng)的三個平板中菌落數(shù)量分別為78、91和95，則三個平板中平均菌落數(shù)為(78＋91＋95)÷3＝88，每克皮渣中微生物數(shù)量為88÷0.1×104＝8.8×106個。

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