【期中復(fù)習(xí)】2023-2024學(xué)年（人教版2019選擇性必修3）高二生物下冊(cè)專題復(fù)習(xí)第3章+基因工程專題訓(xùn)練（考前必刷）.zip-試卷下載-教習(xí)網(wǎng)

考點(diǎn)一：DNA的粗提取及鑒定
考點(diǎn)二：DNA重組技術(shù)
考點(diǎn)三：基因工程的基本操作程序
考點(diǎn)四：基因工程的應(yīng)用
考點(diǎn)五：蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用
考點(diǎn)一：DNA的粗提取及鑒定
1．關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法錯(cuò)誤的是（）
A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止 DNA 降解
B．DNA 既溶于 2ml/L NaCl 溶液也溶于蒸餾水
C．粗提取的DNA 中含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)
D．將粗提取的 DNA 溶于2ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑 DNA 被染成藍(lán)色
2．在利用洋蔥進(jìn)行“DNA的粗提取和鑒定”的實(shí)驗(yàn)中，相關(guān)操作正確的是（）
A．研磨洋蔥時(shí)，加入適量的研磨液瓦解細(xì)胞膜，充分釋放核DNA
B．利用定性濾紙進(jìn)行過濾，以去除雜質(zhì)，提高DNA的含量和純度
C．向DNA濾液中加入等體積、預(yù)冷的50%酒精，以獲得DNA粗提物
D．將白色絲狀物加入4mL二苯胺試劑中沸水浴，以利于發(fā)生顏色反應(yīng)
3．如圖為雞血細(xì)胞中DNA的粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)過程中的部分操作示意圖，請(qǐng)據(jù)圖分析，下列相關(guān)敘述中，正確的是（）
A．該實(shí)驗(yàn)的正確操作順序是③→①→②→④→⑤
B．用同樣方法從等體積豬血和雞血中提取的DNA量相近
C．⑤表示要鑒定步驟①中所得到的白色絲狀物主要成分為DNA，可使用二苯胺試劑來鑒定，沸水浴冷卻后，出現(xiàn)藍(lán)色的試管組別是對(duì)照組
D．步驟①的目的是初步分離DNA與蛋白質(zhì)，析出并獲得DNA；步驟④中在2ml/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度較大
4．某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關(guān)探究活動(dòng)。具體步驟如下：
材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g。剪碎后分成兩組，一組置于20 ℃、另一組置于－20 ℃條件下保存24 h。
（1）將DNA的粗提取物溶于2 ml/L的NaCl溶液中，加入試劑，在條件下進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下表：
注：“＋”越多表示藍(lán)色越深。
（2）該探究性實(shí)驗(yàn)課題的名稱可能是“探究不同材料和不同對(duì)DNA提取量的影響”。
（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
①結(jié)論1：與20 ℃相比，相同實(shí)驗(yàn)材料在－20 ℃條件下保存，DNA的提取量更 (填“多”或“少”)。
結(jié)論2：等質(zhì)量的不同實(shí)驗(yàn)材料，在相同的保存溫度下，從中提取的DNA量最多。
②針對(duì)結(jié)論1，請(qǐng)?zhí)岢龊侠淼慕忉專旱蜏匾种屏? 的活性，DNA降解速度減慢。
5．DNA粗提取和鑒定
【實(shí)驗(yàn)原理】
①DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在中的溶解度不同，在 ml/L下，DNA的溶解度最?。煌瑫r(shí)DNA不溶于，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解其中。
②DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性：
【實(shí)驗(yàn)材料】
動(dòng)物細(xì)胞選擇（填“羊成熟的紅細(xì)胞”或“雞血細(xì)胞”），原因是
【實(shí)驗(yàn)步驟】
①破碎細(xì)胞：雞血細(xì)胞液加入，同時(shí)用玻璃棒攪拌；切碎的洋蔥中加入。然后收集濾液。
②去除濾液中的雜質(zhì)：先在濾液中加入 ml/L的NaCl，過濾除去不溶的雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)NaCl溶液的濃度至 ml/L，析出DNA，過濾去除溶液中的雜質(zhì)，最后用 ml/L的NaCl溶解DNA。
③DNA的析出：將處理后的溶液過濾，加入的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為），靜置2~3min。
④DNA的鑒定：用 ml/L的NaCl溶解DNA；在條件下，DNA與反應(yīng)呈現(xiàn) 。
【注意事項(xiàng)】
①為防止血液凝固，需要向血液中加入。
②二苯胺試劑要，否則會(huì)影響鑒定的效果。
考點(diǎn)二：DNA重組技術(shù)
6．某細(xì)菌DNA分子上有4個(gè)Sau3A Ⅰ的酶切位點(diǎn)，經(jīng)Sau3AⅠ處理后會(huì)形成4個(gè)大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ處理，則只會(huì)形成2個(gè)大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamH Ⅰ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。下列敘述不正確的是（）
A．上述兩種限制酶切割后可形成相同的黏性末端
B．該DNA分子上有兩個(gè)BamHⅠ的酶切位點(diǎn)
C．黏性末端能通過T4DNA連接酶連接
D．若用兩種酶共同處理，會(huì)形成6個(gè)大小不同的DNA片段
7．已知限制酶BamHI和BglⅡ的識(shí)別位點(diǎn)分別是-G↓GATCC-、-A↓GATCT-。下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是（）
A．限制酶的識(shí)別序列可能由4個(gè)、6個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)目的核苷酸組成
B．上述兩種限制酶切割出的末端只能用E.cliDNA連接酶進(jìn)行“縫合”
C．上述兩種限制酶切割出的末端之間相互連接后可能不會(huì)再被兩種限制酶識(shí)別
D．若用兩種限制酶同時(shí)切割目的基因和質(zhì)粒，可提高重組質(zhì)粒構(gòu)建的成功率
8．“基因編輯嬰兒”露露和娜娜的誕生引發(fā)了巨大的爭(zhēng)議。基因編輯技術(shù)能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因中特定DNA片段的敲除、加入等。請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：
（1）露露和娜娜的誕生借助了試管嬰兒技術(shù)，包括體外受精、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等技術(shù)。精子需經(jīng)過處理才能與發(fā)育至期的卵子結(jié)合形成受精卵，當(dāng)受精卵最早發(fā)育至階段時(shí)，可移植到母體子宮中繼續(xù)發(fā)育。
（2）露露和娜娜的CCR5基因中被敲除了32個(gè)堿基對(duì)，使得T細(xì)胞不能正常表達(dá)某種膜蛋白，從而使HIV無法識(shí)別并攻擊T細(xì)胞。敲除CCR5基因中32個(gè)堿基對(duì)，類似于酶的作用，敲除后產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式即，并通過酶連接起來。
（3）基因編輯技術(shù)引起的變異屬于。
考點(diǎn)三：基因工程的基本操作程序
9．PCR擴(kuò)增儀的溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)設(shè)定不當(dāng)會(huì)影響到基因的擴(kuò)增結(jié)果。下圖是PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)的參數(shù)設(shè)定，圖中線上、線下分別為溫度和時(shí)間設(shè)定。下列敘述錯(cuò)誤的是（）
A．步驟2的溫度及時(shí)間設(shè)定主要依據(jù)目的基因的G、C含量
B．步驟3的溫度及時(shí)間設(shè)定主要依據(jù)引物的長(zhǎng)度及G、C含量
C．步驟4延伸時(shí)間的設(shè)定主要依據(jù)目的基因的堿基數(shù)目
D．步驟5除設(shè)定循環(huán)次數(shù)（25次）外，還應(yīng)將“GOTO”設(shè)定為步驟3
10．用A和B兩種限制酶同時(shí)和分別處理同一DNA片段，限制酶對(duì)應(yīng)切點(diǎn)一定能切開。兩種酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物電泳分離結(jié)果如圖1和圖2所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）
A．用A和B兩種限制酶同時(shí)處理圖中同一DNA片段得到6個(gè)游離的磷酸基團(tuán)
B．圖1中X代表的堿基對(duì)數(shù)為4500，Y是限制酶A的酶切位點(diǎn)
C．電泳凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子大小和構(gòu)象等有關(guān)
D．設(shè)計(jì)引物從圖1中完整DNA片段中擴(kuò)增出完整X，至少需要3次PCR
11．為探究M基因的功能，科研人員利用基因工程技術(shù)將M基因?qū)霐M南芥中，培育出轉(zhuǎn)M基因擬南芥植株，相關(guān)流程如圖所示，其中b過程利用了PCR技術(shù)。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）
A．a(chǎn)、b過程中所需要的酶分別是逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶
B．b過程中將溫度降至50℃左右的目的是將雙鏈DNA解聚為單鏈
C．e過程中，Ti質(zhì)粒的T-DNA可攜帶著M基因轉(zhuǎn)移到擬南芥細(xì)胞中
D．獲得的轉(zhuǎn)M基因擬南芥植株自交，子代可能會(huì)發(fā)生性狀分離
12．目的基因和載體如果用同一種限制酶處理，連接時(shí)會(huì)出現(xiàn)正反接的情況，為鑒定篩選出的表達(dá)載體中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR后，結(jié)合電泳技術(shù)鑒定，圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，其中目的基因?yàn)殚L(zhǎng)度300bp的片斷。下列有關(guān)說法不正確的是（）
A．PCR退火溫度不宜太低，避免引物錯(cuò)配和模板鏈形成雙鏈
B．電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小、帶電量和構(gòu)象有關(guān)
C．選取引物甲丙，擴(kuò)增出450bp長(zhǎng)度片斷時(shí)，可以說明目的基因正接
D．選取引物甲乙，擴(kuò)增出400bp長(zhǎng)度片斷時(shí)，可以說明目的基因反接
13．在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，傳統(tǒng)方法常受限于限制酶識(shí)別序列。科研人員研發(fā)了新的DNA重組方法: In-Fusin技術(shù)。該技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列（即同源序列），然后用In-Fusin酶處理，使同源序列形成黏性末端，最終形成的重組質(zhì)粒會(huì)在受體細(xì)胞內(nèi)形成完整的重組序列。主要操作過程如圖示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）
A．推測(cè)In-Fusin酶的作用是識(shí)別同源序列、形成黏性末端、連接磷酸二酯鍵
B．載體A端和B端的序列不同，可防止目的基因與質(zhì)粒反向連接及自身環(huán)化
C．形成重組質(zhì)粒時(shí)，如果溫度遠(yuǎn)高于50℃，黏性末端的堿基不容易互補(bǔ)配對(duì)
D．該技術(shù)無需識(shí)別特定切割位點(diǎn)，需識(shí)別目的基因與線性質(zhì)粒任意同源序列
14．HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。雞卵清蛋白是由輸卵管上皮細(xì)胞中卵清蛋白基因特異性表達(dá)后分泌至輸卵管內(nèi)，參與構(gòu)成雞蛋清的蛋白質(zhì)。下圖是利用基因工程技術(shù)制備HA蛋白雞輸卵管生物反應(yīng)器的過程。幾種可供選擇的限制酶識(shí)別序列如下，下列說法錯(cuò)誤的是（）
A．①為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶、4種游離的脫氧核苷酸等組分
B．目的基因與雞卵清蛋白基因啟動(dòng)子拼接前應(yīng)先在目的基因兩端分別引入HindⅢ和EcRI的識(shí)別序列
C．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，退火溫度偏低、引物特異性差均可導(dǎo)致產(chǎn)物中出現(xiàn)部分非目標(biāo)序列
D．基因表達(dá)載體導(dǎo)入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法
15．單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)可用于制備高親和力、高特異性的單抗，其技術(shù)流程如下：①康復(fù)者單個(gè)B淋巴細(xì)胞的分離和篩選；②利用RT-PCR獲取和擴(kuò)增抗體基因；③構(gòu)建基因表達(dá)載體；④將抗體基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞；⑤單抗的篩選和鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是（）
A．操作①選用單個(gè)B淋巴細(xì)胞以保證最終獲得純度較高的單抗
B．操作②使用的PCR反應(yīng)體系常添加Mg2+以激活DNA聚合酶
C．操作③常用兩種限制酶切割抗體基因和載體以防止其自身環(huán)化
D．操作④前可用Ca2+處理受體細(xì)胞促使其主動(dòng)吸收DNA分子
16．載體是基因工程中攜帶外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。下圖是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉基本流程示意圖，相關(guān)敘述正確的是（）
A．重組載體A、重組載體B分別是基因表達(dá)載體和基因克隆載體
B．基因克隆載體可使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在
C．必須把目的基因插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間
D．細(xì)菌B可能是大腸桿菌
17．東南景天中的HMA3基因能編碼Cd（鎘）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能將土壤中的Cd吸收進(jìn)體內(nèi)，現(xiàn)欲將東南景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹，以增強(qiáng)欒樹對(duì) Cd的富集能力，從而有效治理Cd污染，科研人員利用下圖結(jié)構(gòu)構(gòu)建重組DNA，圖1為HMA3基因所在DNA示意圖，圖2為質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，下列敘述正確的是（）
A．欲獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進(jìn)行PCR循環(huán)至少2輪獲得
B．用凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，引物1、引物2擴(kuò)增的產(chǎn)物可得3條條帶
C．構(gòu)建含HMA3和GFP基因的重組質(zhì)粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的識(shí)別序列
D．用含潮霉素的培養(yǎng)基篩選受體細(xì)胞，能生長(zhǎng)的為含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞
18．在植物基因工程中外源基因表達(dá)量不足是目前利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)植物疫苗時(shí)存在的問題之一。研究表明，啟動(dòng)子的串聯(lián)能增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，研究人員擬構(gòu)建含有兩個(gè)35s啟動(dòng)子（35s啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒的一種強(qiáng)啟動(dòng)子）串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因苜蓿。一個(gè)35s啟動(dòng)子包括1個(gè)A區(qū)和2個(gè)B區(qū)。圖甲表示35s啟動(dòng)子及其附近區(qū)域分布的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。圖乙表示待轉(zhuǎn)入第二個(gè)35s啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的構(gòu)成組件及其上的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。
（1）利用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增35s啟動(dòng)子，PCR技術(shù)的原理是，此技術(shù)設(shè)計(jì)引物很關(guān)鍵，引物是。利用此技術(shù)擴(kuò)增的35s啟動(dòng)子可以在PCR擴(kuò)增儀中自動(dòng)完成，完成以后，常采用來鑒定PCR的產(chǎn)物。
（2）根據(jù)限制酶識(shí)別位點(diǎn)，為了讓第二個(gè)35s啟動(dòng)子準(zhǔn)確串聯(lián)在待轉(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒上，應(yīng)選擇限制酶切割圖甲的DNA片段。
（3）為了篩選出正確串聯(lián)了兩個(gè)35s啟動(dòng)子的新重組質(zhì)粒菌落，研究人員用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，平板類型丙和丁加入的抗生素分別是、，得到①②③三類菌落，其生長(zhǎng)狀況如下表（+代表生長(zhǎng)，-表示不生長(zhǎng)）。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是（填“①”“②”或“③”）類。若新獲得的轉(zhuǎn)基因苜蓿中目的基因的表達(dá)量大幅增加，可以說明串聯(lián)兩個(gè)35s啟動(dòng)子能。
19．健康的生活方式、樂觀的心態(tài)和定期體檢是預(yù)防癌癥的主要手段。（CAR-T細(xì)胞療法是治療血液惡性腫瘤及淋巴瘤的研究熱點(diǎn)，我國(guó)首款新型腫瘤治療方法——CAR-T產(chǎn)品于2021年上市。左圖為CAR-T細(xì)胞療法的原理示意圖，該療法借助基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)，根據(jù)CAR蛋白（右圖）是多種腫瘤的嵌合抗原受體的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)。

回答下列問題：
（1）機(jī)體腫瘤的發(fā)生主要與免疫系統(tǒng)的功能降低有關(guān)。
（2）圖中過程①稱為，這是基因工程的核心步驟，需要用到的工具酶有。過程②最常用的方法是。CAR-T細(xì)胞輸入患者體內(nèi)后，其活化需要兩個(gè)信號(hào)的刺激，具體是。
（3）據(jù)圖可知，CAR-T細(xì)胞療法相對(duì)傳統(tǒng)的藥物化療和放療而言，具有（請(qǐng)寫出兩點(diǎn)）的突出優(yōu)點(diǎn)。
（4）CAR-T細(xì)胞在治療肺癌、肝癌、乳腺癌等實(shí)體瘤的總體效果上還不盡如人意，請(qǐng)根據(jù)右圖并結(jié)合特異性免疫的原理，提出一種CAR蛋白改造的簡(jiǎn)單思路，以提升CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的療效：。
20．基因工程技術(shù)在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，其中嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）技術(shù)是一種新興的免疫療法，用于治療某些癌癥。簡(jiǎn)要流程是：先從患者體內(nèi)分離出T細(xì)胞，利用基因工程技術(shù)將能識(shí)別腫瘤抗原的抗體基因與T細(xì)胞的受體基因拼接，再將拼接的基因?qū)隩細(xì)胞，體外擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。請(qǐng)回答下列問題：
（1）基因工程的核心步驟是，該過程需要的工具酶是。
（2）在目的基因的首端和尾端需分別加上啟動(dòng)子和終止子，啟動(dòng)子是識(shí)別和結(jié)合部位，終止子則起到的作用。為保證目的基因被順利切割，限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)加在PCR引物的（填“3”或“5”）端。
（3）在體外擴(kuò)增T細(xì)胞需要加入細(xì)胞培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液通常含有（至少填3種）等物質(zhì)。此外，氣體環(huán)境也是細(xì)胞培養(yǎng)的重要條件，所需氣體主要有。
（4）CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)能與腫瘤細(xì)胞密切接觸，并使其裂解死亡。該事實(shí)說明細(xì)胞膜具有的功能。
（5）簡(jiǎn)述CAR-T細(xì)胞免疫療法相比傳統(tǒng)化療在治療癌癥時(shí)的優(yōu)勢(shì)：。（至少答出兩點(diǎn)）
考點(diǎn)四：基因工程的應(yīng)用
21．玉米（2N=20）的傳統(tǒng)育種方式是雜交育種。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，單倍體育種、誘變育種、基因工程育種都是玉米育種的重要技術(shù)。下列敘述錯(cuò)誤的是（）
A．單倍體育種一般需要經(jīng)過脫分化和再分化過程
B．誘變育種形成的新性狀有可能穩(wěn)定遺傳
C．基因工程育種能定向改變玉米性狀
D．雜交育種較誘變育種操作簡(jiǎn)便，一定能快速得到所需新品種
22．利用基因工程技術(shù)使哺乳動(dòng)物成為乳腺生物反應(yīng)器，以生產(chǎn)所需要的藥品，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素。科學(xué)家培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成為乳腺生物反應(yīng)器時(shí)，下列說法錯(cuò)誤的是（）
A．利用顯微注射法將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胧荏w哺乳動(dòng)物體內(nèi)
B．需要將乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子與目的基因重組在一起
C．動(dòng)物必須是雌性才能滿足要求
D．動(dòng)物需要進(jìn)入泌乳期才能成為“批量生產(chǎn)藥物的工廠”
23．基因編輯是一種基因工程技術(shù)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的定點(diǎn)切割，其工作原理如下圖所示，向?qū)NA引導(dǎo)Cas9蛋白到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)并剪切DNA。研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，下列說法錯(cuò)誤的是（）
A．細(xì)菌體內(nèi)的Cas9能切割外源DNA保護(hù)自身，類似于限制酶
B．可通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除突變基因根治貓叫綜合征等遺傳病
C．Cas9對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行編輯時(shí)，應(yīng)使用不同的向?qū)NA
D．Cas9蛋白剪切DNA片段的精確性隨著向?qū)NA長(zhǎng)度的延長(zhǎng)而增加
24．Ⅲ型膠原蛋白，是人體皮膚、筋膜、肌腱中主要的膠原蛋白。 Ⅲ型膠原蛋白不僅是許多器官必不可少的結(jié)構(gòu)成分，還可通過與血小板結(jié)合而促進(jìn)血小板聚集，因此在凝血中起重要作用。家蠶絲腺生物反應(yīng)器是利用家蠶絲腺表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。家蠶已喪失飛翔逃逸能力，家蠶幼蟲絲腺具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)合成與分泌能力?？茖W(xué)家已成功利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)Ⅲ型膠原蛋白，回答以下問題：
（1）科學(xué)家將Ⅲ型膠原蛋白基因與等調(diào)控元件重組在一起，通過的方法導(dǎo)入家蠶的受精卵。
（2）從轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性角度分析，家蠶作為外源基因的受體，安全性較高，是因?yàn)? 。
（3）科學(xué)家曾用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)Ⅲ型膠原蛋白，流程如圖所示：
①選取的皮膚細(xì)胞為生命力旺盛的新生細(xì)胞，原因是。
②要將成功轉(zhuǎn)入Ⅲ型膠原蛋白基因的工程菌篩選出來，所用的方法是在培養(yǎng)基中添加。
（4）對(duì)比工程菌大腸桿菌，利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)Ⅲ型膠原蛋白的優(yōu)勢(shì)在于，因而使Ⅲ型膠原蛋白具有生物活性。
考點(diǎn)五：蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用
25．生物技術(shù)與工程學(xué)相結(jié)合，可研究、設(shè)計(jì)和加工生產(chǎn)各種生物工程產(chǎn)品。下列有關(guān)敘述正確的是（）
①由于外植體在植物組織培養(yǎng)過程中不感染病毒，用任何外植體都可制備脫毒苗
②由iPS細(xì)胞產(chǎn)生的特定細(xì)胞，可以在新藥的測(cè)試中發(fā)揮重要作用
③胚胎移植作為胚胎工程的前端技術(shù)環(huán)節(jié)，推動(dòng)了胚胎工程其他技術(shù)的研究和應(yīng)用
④PCR反應(yīng)過程可以在PCR擴(kuò)增儀中自動(dòng)完成，而后常用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物
⑤利用基因工程技術(shù)的乳腺生物反應(yīng)器，可以讓哺乳動(dòng)物批量生產(chǎn)相應(yīng)的藥物
⑥蛋白質(zhì)工程僅以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)逆中心法則進(jìn)行，就可以改造或制造新的蛋白質(zhì)
A．①③B．②④⑤C．②③④⑥D(zhuǎn)．①③④⑤⑥
26．科學(xué)家利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)枯草桿菌堿性蛋白酶BAPB92第188、239和262位氨基酸殘基進(jìn)行改造，構(gòu)建了突變體BAPB92（A188P）、BAPB92（Q239R）和BAPB92（A188P/V262I）。相對(duì)于野生型，BAPB92（A188P）酶活力提高了2.6倍，BAPB92（Q239R）酶活力提高了2.5倍，BAPB92（A188P/V262I）酶活力提高了3.3倍，并且突變體蛋白酶的熱穩(wěn)定性和耐堿情況均得到較大提高。下列相關(guān)敘述正確的是（）
A．堿性蛋白酶BAPB92的改造無需設(shè)計(jì)蛋白酶突變體的結(jié)構(gòu)
B．水解替換酶BAPB92第188位的氨基酸可獲得突變體BAPB92（A188P）
C．枯草桿菌堿性蛋白酶的改造工程遵循的原理是基因重組
D．三種突變體中BAPB92（A188P/V262I）降低反應(yīng)活化能的效果最顯著
27．蛋白質(zhì)工程是新崛起的一項(xiàng)生物工程，又稱第二代基因工程。下圖為蛋白質(zhì)工程的流程。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）
A．蛋白質(zhì)工程就是根據(jù)人們需要，直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工改造
B．蛋白質(zhì)工程是通過基因改造或基因合成等方法，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)
C．①②過程為轉(zhuǎn)錄和翻譯
D．蛋白質(zhì)工程是從④開始的
28．甜味蛋白是一類具有甜度高，熱量低等特性的天然甜味劑，有望經(jīng)生物技術(shù)改造和量產(chǎn)后能廣泛應(yīng)用于食品，飲料，藥品生產(chǎn)等。莫內(nèi)林最初是從一種西非植物的漿果中分離提純到的甜味蛋白，甜度是蔗糖的3000倍左右。圖示利用大腸桿菌生產(chǎn)莫內(nèi)林，其中M基因可表達(dá)合成莫內(nèi)林。表是為PCR擴(kuò)增M基因設(shè)計(jì)的引物，畫線部分是所需使用的限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。
（1）引物1的結(jié)合位點(diǎn)可能在（選填圖中的編號(hào)）。畫線部分的序列在A中（有/沒有），在B中（有/沒有）。
（2）已知C中的培養(yǎng)基成分有水、酵母粉、蛋白胨和氯化鈉，并按一定比例添加氨芐青霉素。將C中有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后作為菌種在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，積累產(chǎn)物，以下操作合理的是。
A．發(fā)酵罐和培養(yǎng)基需嚴(yán)格滅菌
B．發(fā)酵罐中培養(yǎng)基成分可去掉氨芐青霉素和瓊脂
C．為避免雜菌污染，培養(yǎng)過程中不能補(bǔ)充培養(yǎng)基
D．培養(yǎng)過程中，只需合理控制好溫度和pH
為了探究莫內(nèi)林對(duì)血糖濃度的影響，將上述大腸菌生產(chǎn)的莫內(nèi)林配制成與20mg/L蔗糖溶液等甜度閾值的濃度胃灌空腹小鼠，得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖（a），另用不同濃度的莫內(nèi)林溶液胃灌空腹小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖（b）
（3）結(jié)合相關(guān)信息和所學(xué)知識(shí)，分析實(shí)驗(yàn)可知。
A．莫內(nèi)林可升高血糖，不適宜作為代糖
B．與蔗糖相比，莫內(nèi)林升血糖的效果不顯著
C．莫內(nèi)林和蔗糖元素組成相同，因此可轉(zhuǎn)化為血糖
D．一定范圍內(nèi)，莫內(nèi)林對(duì)血糖的影響不隨其濃度顯著變化
（4）通過大腸桿菌生產(chǎn)的莫內(nèi)林甜度較天然莫內(nèi)林大為降低，天然莫內(nèi)林也易因溫度等降低甜度甚至甜味消失，請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)和利用相關(guān)的生物技術(shù)，分析兩種莫內(nèi)林甜度降低的原因并提出進(jìn)一步改進(jìn)的工程思路。
限時(shí)：60分鐘
一．單選題（3分×15）
1．CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由向?qū)NA（SgRNA）和Cas9蛋白兩部分組成，SgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白到特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，其機(jī)制如圖所示。下列說法正確的是（）
A．Cas9蛋白相當(dāng)于限制酶，切割特定基因位點(diǎn)的脫氧核糖和堿基之間的化學(xué)鍵
B．向?qū)NA可以在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有時(shí)會(huì)因SgRNA錯(cuò)誤結(jié)合而出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，一般SgRNA序列越長(zhǎng)，脫靶率越低
D．對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行編輯時(shí)，使用Cas9蛋白和相同的sgRNA進(jìn)行基因編輯
2．下列有關(guān)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的敘述正確的是（）
A．將粗提取出的DNA絲狀物放入二苯胺試劑中沸水浴后冷卻變藍(lán)
B．在紫色洋蔥鱗片葉外表皮的不同部位觀察到的質(zhì)壁分離程度可能不同
C．用顯微鏡觀察洋蔥根尖裝片時(shí)，需保持細(xì)胞活性以觀察有絲分裂過程
D．檢測(cè)酵母菌細(xì)胞呼吸產(chǎn)物時(shí)，加入酸性重鉻酸鉀溶液出現(xiàn)灰綠色，說明一定有酒精產(chǎn)生
3．下圖是幾種限制酶的切割位點(diǎn)，下列說法正確的是（）
A．限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通過E．cliDNA連接酶相互連接
B．DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成
C．所有限制酶的識(shí)別序列均由6個(gè)核苷酸組成
D．SmaI切割后產(chǎn)生的是黏性末端
4．下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)敘述，錯(cuò)誤的是（）
A．酵母和菜花均可作為提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 ml/L NaCl溶液也溶于蒸餾水
C．DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍(lán)
D．向洋蔥研磨液的上清液中加蒸餾水?dāng)嚢?，可見玻棒上有白色絮狀?br>5．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟。下列關(guān)于基因表達(dá)載體及其構(gòu)建的敘述，錯(cuò)誤的是（）
A．用兩種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，比用一種限制酶效果更好
B．用兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒之后，也要用兩種酶即DNA連接酶、DNA聚合酶進(jìn)行連接
C．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，插入目的基因不能破壞標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)的完整性
D．基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因、目的基因等組成部分
6．研究發(fā)現(xiàn)，植物的抗寒性是累積性的數(shù)量性狀，由多種抗寒基因調(diào)控。如圖是蒺藜苜蓿體內(nèi)的部分抗寒基因在冷馴化過程中的相對(duì)表達(dá)量，下列有關(guān)分析正確的是（）
A．植物的抗寒性說明基因與性狀之間是一一對(duì)應(yīng)的
B．本實(shí)驗(yàn)的自變量是蒺藜苜蓿冷馴化的時(shí)間和溫度
C．為提高蒺藜苜蓿的抗寒性，宜進(jìn)行5～24h冷馴化
D．通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA的合成量就能得出抗寒基因的表達(dá)量
7．科學(xué)家從某植物中提取乙烯受體基因（Ers1），通過基因工程技術(shù)將Ers1基因反向連接到質(zhì)粒中，篩選出轉(zhuǎn)入反義Ersl基因的該種植物，其果實(shí)的儲(chǔ)藏期將延長(zhǎng)，過程如圖所示。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）
A．PCR擴(kuò)增時(shí)，需在Ers1基因左右兩端分別添加XhI、HpaI酶切序列
B．篩選農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中可加入潮霉素，過程④包括脫分化和再分化
C．轉(zhuǎn)基因植物中反義Ersl基因和Ersl基因分別轉(zhuǎn)錄出的mRNA堿基序列能互補(bǔ)
D．若目的基因成功轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，則可檢測(cè)到Kanr和hyg的表達(dá)產(chǎn)物
8．如圖是RT-PCR過程示意圖，①和②表示逆轉(zhuǎn)錄酶催化的逆轉(zhuǎn)錄過程，③表示PCR過程。據(jù)圖分析下列說法錯(cuò)誤的是（）
A．逆轉(zhuǎn)錄酶具有DNA聚合酶的能力
B．③過程只需要引物b
C．RT-PCR不可直接檢測(cè)基因表達(dá)水平
D．RT-PCR可檢測(cè)某些RNA病毒
9．將馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因Pin Ⅱ?qū)霔顦浼?xì)胞，培育成了抗蟲楊樹。如圖表示含目的基因的DNA分子和農(nóng)桿菌質(zhì)粒，圖中Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因，箭頭表示識(shí)別序列完全不同的4種限制酶的切割位點(diǎn)。下列敘述不正確的是（）
A．目的基因插入到質(zhì)粒的T-DNA上，才能整合到受體細(xì)胞染色體中
B．為使目的基因與質(zhì)粒高效重組，最好選用EcRⅠ和PstⅠ
C．成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)為不抗氨芐青霉素、抗新霉素
D．轉(zhuǎn)化了的楊樹細(xì)胞在合適條件下經(jīng)脫分化即可形成抗蟲楊樹
10．宿主細(xì)胞膜表面表達(dá)出由侵入病毒基因編碼的特異性抗原，從而成為免疫應(yīng)答的靶細(xì)胞。新冠病毒的S蛋白是吸附與入侵的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，S基因突變顯著增強(qiáng)了病毒傳播性。研究人員將新冠病毒原始毒株(WT)和S基因突變毒株(D614G)按圖1實(shí)驗(yàn)步驟獲取S基因，檢測(cè)D614G突變株的S蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示，下列說法正確的是（）
A．新冠病毒侵入細(xì)胞后，S蛋白作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫自穩(wěn)功能
B．步驟③需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶構(gòu)建表達(dá)載體
C．步驟④用抗原-抗體雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入S蛋白基因
D．突變株減少S蛋白在細(xì)胞膜的表達(dá)量，逃避免疫應(yīng)答，利于病毒傳播
11．科研人員以抗四環(huán)素基因?yàn)闃?biāo)記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細(xì)胞貧血癥。下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，合理的是（）
A．基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子是DNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)
B．利用小鼠的成熟紅細(xì)胞提取mRNA可獲得β-珠蛋白基因的編碼序列
C．常用Ca2＋處理大腸桿菌使其成為易于吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞
D．用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出的大腸桿菌一定含有β-珠蛋白基因
12．下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是（）
A．基因工程操作需要使用三種工具酶
B．基因工程是在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作
C．DNA連接酶主要作用于DNA中的氫鍵
D．利用基因工程技術(shù)可培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
13．下列植物育種方式中，不需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的是（）
A．利用秋水仙素獲得三倍體無子西瓜
B．利用花藥離體培養(yǎng)得到單倍體植株
C．利用基因工程培養(yǎng)抗蟲的棉花植株
D．利用細(xì)胞工程培養(yǎng)“番茄—馬鈴薯”雜種植株
14．近年來，人工智能(AI)算法在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)被開發(fā)，下列關(guān)于AI算法在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域應(yīng)用的設(shè)想中，實(shí)現(xiàn)難度最大的是（）
A．根據(jù)人類對(duì)蛋白質(zhì)的功能需求設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)
B．根據(jù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)推測(cè)其氨基酸序列
C．按照設(shè)定的氨基酸序列推測(cè)mRNA的堿基序列
D．按照設(shè)定的mRNA的堿基序列設(shè)計(jì)新基因
15．T4溶菌酶在高溫時(shí)易失去活性。研究人員對(duì)編碼T4溶菌酶的基因進(jìn)行改造，使T4溶菌酶第3位的異亮氨酸變?yōu)榘腚装彼?，該半胱氨酸與第97位的半胱氨酸之間形成一個(gè)二硫鍵，提高了酶的耐熱性。下列相關(guān)敘述正確的是（）
A．T4溶菌酶耐熱性提高的原因是組成該酶的氨基酸種類和數(shù)量發(fā)生了改變
B．T4溶菌酶的改造屬于蛋白質(zhì)工程，自然界中的酶都可通過蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造
C．該方法得到的T4溶菌酶不需要功能的鑒定
D．若高溫使蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的功能也會(huì)受到影響
二．多選題（5分×5）
16．下圖為基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，下列有關(guān)說法正確的是（）
A．EcR V切制出來的載體P1為平末端
B．T4DNA連接酶既可以連接平末端又可以連接黏性末端
C．構(gòu)建基因表達(dá)載體用到的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體等
D．天然質(zhì)粒具備限制酶切割位點(diǎn)，標(biāo)記基因，即可作為載體
17．鏈霉菌是一種異養(yǎng)需氧型的細(xì)菌，為利用鏈霉菌生產(chǎn)藥物 A，研究者構(gòu)建重組 DNA 并導(dǎo)入鏈霉菌。重組 DNA 含啟動(dòng)子 P、藥物 A 基因和 Ne 基因（卡那霉素抗性基因）。培養(yǎng)和篩選過程如下圖所示。
下列敘述不正確的是（）
A．實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基需要先調(diào) pH 再行高壓蒸汽滅菌后才能使用
B．稀釋后涂布時(shí)應(yīng)用涂布器沾取少量菌液并均勻地涂布在培養(yǎng)基的表面
C．卡那霉素抗性強(qiáng)弱與藥物A基因的表達(dá)量呈正相關(guān)
D．應(yīng)選用培養(yǎng)基b 的菌株進(jìn)一步鑒定以生產(chǎn)藥物 A
18．孤獨(dú)癥譜系障礙與 SHANK3 基因的分子缺陷密切相關(guān)，我國(guó)科學(xué)家利用 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，對(duì)獼猴的 SHANK3 基因進(jìn)行編輯，首次獲得該病的模型猴。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的 Cas9 蛋白通過識(shí)別特定核苷酸序列、切除 SHANK3 基因部分序列，使其失去作用。以下說法錯(cuò)誤的是（）
A．Cas9 是一種限制酶，斷開 SHANK3 基因中特定部位的磷酸二酯鍵
B．自然條件下精子在雌性動(dòng)物的生殖道內(nèi)獲得受精能力，在子宮中完成受精作用
C．對(duì)母猴乙注射促性腺激素進(jìn)行同期發(fā)情處理，使其生殖器官的生理變化與母猴甲同步
D．對(duì)卵母細(xì)胞、受精卵、早期胚胎的培養(yǎng)，都需要一定的 CO2濃度維持培養(yǎng)液的 pH
19．下列是通過基因工程對(duì)生物體遺傳物質(zhì)進(jìn)行改造的實(shí)例，其中子代能遺傳獲得該性狀的是（）
A．將干擾素基因表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌，篩選獲得的干擾素工程菌
B．將煙草花葉病毒外殼蛋白基因?qū)霟煵蒹w細(xì)胞，最終獲得的轉(zhuǎn)基因煙草
C．將抗凝血酶基因?qū)胙蚴芫眩嘤鲎鳛槿橄偕锓磻?yīng)器的奶羊
D．以修飾的腺病毒為載體，將治療囊性纖維化病的正常基因?qū)牖颊叻谓M織中
20．腈水合酶（N0）廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)和醫(yī)藥原料生產(chǎn)等領(lǐng)域,但不耐高溫。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽,可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶（N1）。下列有關(guān)敘述正確的是（）。
A．N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩(wěn)定性的原因之一
B．加入連接肽需要通過改造基因來實(shí)現(xiàn)
C．獲得N1的過程需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯
D．自然界中的酶都可以通過蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造
三．簡(jiǎn)答題（15分×2）
21．CD3D嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突變引起的，該突變阻止了T細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所需的CD3D蛋白的合成。科研人員對(duì)第3代CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行改造，獲得一種超精確的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），該系統(tǒng)主要由向?qū)gRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶組成，作用機(jī)制如圖1。利用該系統(tǒng)在CD3D-SCID患者的造血干細(xì)胞中可以更正約71.2%的致病突變。
（1）研究發(fā)現(xiàn)，Cas9切口酶催化雙鏈DNA 鍵水解，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)，據(jù)此推測(cè)，至少通過次DNA復(fù)制可以完成修復(fù)。
（2）sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補(bǔ)配對(duì)的特殊序列，由23個(gè)連續(xù)堿基組成。sgRNA設(shè)計(jì)是否合理，對(duì)于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的切割有重要影響，否則會(huì)導(dǎo)致sgRNA脫靶，試分析其原因是。
（3）為了對(duì)改造后的CD3D基因進(jìn)行研究，把CD3D基因和His標(biāo)簽基因（His標(biāo)簽由6個(gè)組氨酸組成）連接起來構(gòu)建融合基因，并構(gòu)建重組基因表達(dá)載體，圖2為載體、CD3D基因的結(jié)構(gòu)、不同限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)，欲將標(biāo)簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，已知組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG。
①PCR的一般過程為，在變性之前通常有預(yù)變性，其目的是。判斷是否擴(kuò)增出DNA片段，判斷的依據(jù)是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。如果電泳鑒定的結(jié)果不止一條條帶分析可能的原因有（至少答兩點(diǎn)）。
②寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5′ 3′。
③為構(gòu)建融合基因并將其插入載體，科研人員設(shè)計(jì)了一對(duì)與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物，設(shè)計(jì)時(shí)需在引物（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶的識(shí)別序列和His基因的編碼序列，請(qǐng)寫出該引物開頭的12個(gè)堿基序列：5′ 3′。
22．In-Fusin技術(shù)是一項(xiàng)新型的無縫克隆技術(shù)。技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15~20bp），然后用In—Fusin酶（能識(shí)別雙鏈線性化DNA片段5'→3'末端16個(gè)堿基，并使其降解）處理即可實(shí)現(xiàn)無縫連接。它的操作步驟（如圖）大致為：①利用PCR技術(shù)將質(zhì)粒線性化；②PCR擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因；③目的基因與線性化質(zhì)粒同源區(qū)域在In—Fusin酶作用下形成重組質(zhì)粒；④將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。回答下列問題：
（1）過程①需要用到的酶是，質(zhì)粒線性化前后所含有的游離磷酸基團(tuán)的個(gè)數(shù)分別為個(gè)。
（2）過程③中，同源序列1、2中的堿基序列不同，這樣設(shè)計(jì)的好處是。
（3）過程④中，用處理大腸桿菌，以便重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。重組質(zhì)粒利用大腸桿菌細(xì)胞中的DNA聚合酶和酶，實(shí)現(xiàn)完全環(huán)化。
（4）通過檢測(cè)大腸桿菌的致死率可反映其轉(zhuǎn)化后的抗性效果。在含的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后分別用顯微鏡計(jì)數(shù)法和稀釋涂布平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果分別是M、N，則致死率可用 ×100%表示，此結(jié)果較真實(shí)值偏高。材料保存溫度
花菜
辣椒
蒜黃
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
限制酶名稱
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
BamH Ⅰ
G↓GATCC
Sau3A Ⅰ
↓GATC
平板類型
①
②
③
甲：無抗生素
+
+
+
乙：卡那霉素
-
-
+
丙：？
-
+
+
?。?？
-
-
+
引物1
5’GGAATTCCATATGGGCGAATGGGAAATTATCG3’
引物2
5’TTTGGATCCTTACGGCGGCGGAACCGGAC3’

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