考點一　重組DNA技術(shù)的基本工具
1.基因工程的概念理解
2.基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)——“分子手術(shù)刀”
(2)DNA連接酶——“分子縫合針”
(3)基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
教材深挖1.[選擇性必修3第71頁“旁欄思考”]存在于原核生物中的限制酶的作用是什么?提示 切割外源DNA以保證自身安全,防止外來病原物的危害。2.[選擇性必修3第74頁“拓展應(yīng)用1”]限制酶來源于原核生物,為什么不能切割自身的DNA分子?提示 原核生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制,其DNA分子中不具備這種限制酶的識別序列,或通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到限制酶所識別序列的堿基上,使限制酶不能將其切開。
鏈高考·前掛后連(1)用某種限制性內(nèi)切核酸酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后,出現(xiàn)3個條帶,表明該質(zhì)粒上一定至少有3個被該酶切開的位置。[2020·浙江卷](　　)(2)用限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒。[2017·北京卷](　　)(3)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均特異性地識別6個核苷酸序列。[2014·江蘇卷](　　)
1.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
2.限制酶的選擇原則(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶,以便將目的基因“切出”,如圖可選擇PstⅠ。②不能選擇切割位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶,防止破壞目的基因,如圖不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如圖也可選擇用PstⅠ和EcRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切割位點,而且這兩種限制酶切割后不會完全破壞標記基因)。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類
(3)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶,圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取,丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。
3.標記基因的作用:可用于檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞。
練思維·考教銜接[根據(jù)2021全國乙卷、2021遼寧卷、2020江蘇卷、2019江蘇卷、2018全國Ⅱ卷、2020北京卷情境設(shè)計]用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶,其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題。(1)EcRⅠ是一種　　　　 　　　　　酶,它通過識別特定的　　　　 切割特定位點。經(jīng)SmaⅠ和EcRⅤ切割出來的載體為　　　　末端。?(2)常用的DNA連接酶有E.cli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中　　　　　 　酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA連接酶連接。上圖中　　　　　　　　 　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是　　　　　　。?
限制性內(nèi)切核酸(或限制)
EcRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcRⅤ
(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點,可以保證質(zhì)粒在受體細胞中能　　 　　;質(zhì)粒DNA分子上有　　　　　　　　,便于外源DNA插入;質(zhì)粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因),利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞,方法是　? 　。用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞,能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞?
(4)若某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5'末端,獲得了L1-GFP融合基因(簡稱為甲),并將其插入質(zhì)粒P0,構(gòu)建了真核表達載體P1,其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下,圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。據(jù)圖推斷,該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時,使用了兩種限制酶,這兩種酶是　　 　　。使用這兩種酶進行酶切是為了保證　　 　　,也是為了保證　　　　　　　　　。?
(5)下圖C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時mRNA自身的延伸方向為5'-端→3'-端。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質(zhì)粒連接,克隆C1酶基因時在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點。該基因內(nèi)部沒有這兩種酶切位點。圖中酶切位點1和2所對應(yīng)的酶分別是　 。?
考向一 結(jié)合基因工程工具酶的應(yīng)用,考查生命觀念1.(2024·山東青島模擬)食物中的生物胺會引起胃腸道不適和過敏等不良反應(yīng),微生物來源的多銅氧化酶( MCO)能高效分解生物胺?？蒲腥藛T采用PCR技術(shù)獲得發(fā)酵乳桿菌的MCO基因,然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達。若目的基因MCO經(jīng)限制酶切開后的末端如圖甲,要MCO片段能與載體質(zhì)粒pCLY15 (圖乙)高效連接,
需用于切割pCLY15的酶組合為(　　)A.BsrGⅠ和NtⅠ　B.BsrGⅠ和XmaⅠC.KpnⅠ和XmaⅠD.KpnⅠ和SmaⅠ
解析 根據(jù)酶切位點分析,目的基因應(yīng)位于啟動子和終止子之間,為高效連接應(yīng)選用黏性末端相同的酶,而不能選用平末端。KpnⅠ酶切后產(chǎn)生 5'-GTAC-3'的末端,XmaⅠ酶切后產(chǎn)生 5'-CCGG-3'的末端,剛好與目的基因的游離末端配對,C項符合題意。
考向二 結(jié)合基因工程載體的應(yīng)用,考查生命觀念2.下圖甲、乙中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點,下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述,錯誤的是(　　)A.若通過PCR技術(shù)提取該目的基因應(yīng)該選用引物甲和引物丙B.構(gòu)建基因表達載體,可選用BamHⅠ剪切C.構(gòu)建基因表達載體時為了防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,可以選用BclⅠ和HindⅢ剪切D.在導(dǎo)入目的基因的受體細胞中,四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因不能同時表達
解析 構(gòu)建基因表達載體時,應(yīng)至少保留一個完整的標記基因,便于目的基因的檢測和篩選,圖甲中BamHⅠ同時切割兩種標記基因,不能選用BamHⅠ剪切,B項錯誤。
考點二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因:在基因工程的設(shè)計和操作中,用于改變　　　　　　　　或獲得　　　　　　　等的基因。主要是指　　　　　　　　的基因。?(2)篩選目的基因①從相關(guān)的已知　　　　　　　　　清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。?②利用　　　　　　　　　　　和序列比對工具進行篩選。?(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕颉＂诶肞CR　　　　和擴增　　　　　　。?
③通過構(gòu)建　　　　　　來獲取目的基因。?
2.基因表達載體的構(gòu)建　 基因工程的核心內(nèi)容(1)構(gòu)建基因表達載體的目的:使目的基因在受體細胞中　　　　　　　　,并且可以　　　　給下一代,并能夠　　　　和發(fā)揮作用。?
(2)基因表達載體的組成
(3)基因表達載體的構(gòu)建過程
3.將目的基因?qū)胧荏w細胞 該步驟未涉及堿基互補配對原則
4.目的基因的檢測與鑒定
教材深挖1.[選擇性必修3第77頁“相關(guān)信息”]Bt抗蟲蛋白基因產(chǎn)生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的　　　　　環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性,而人和牲畜的胃液呈　　　　　,腸道細胞也　　　　　　　　。因此,Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生危害。?2.[選擇性必修3第77頁“相關(guān)信息”]真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要　　　　　　　　　。因此,PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。引物是一小段能與　? 　 。?
DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸
3.[選擇性必修3第79頁“旁欄思考”改編]PCR可以擴增mRNA嗎?利用PCR擴增目的基因時,為什么要用2種不同的引物?提示 不可以,因為PCR是用DNA雙鏈作模板的,不能直接用單鏈RNA進行PCR,必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再進行PCR。DNA是兩條反向平行的雙鏈,而復(fù)制時只能從固定的方向(模板鏈的3'端)開始,所以引物的堿基序列是不同的。4.[選擇性必修3第83頁“到社會中去”]轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育過程中,檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪兩種?提示 抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲。
鏈高考·前掛后連(1)若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時用到的限制性內(nèi)切核酸酶,則一定有利于該重組質(zhì)粒進入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。[2020·浙江卷](　　)(2)抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株,其DNA檢測均含目的基因,抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNA。[2020·浙江卷](　　)(3)可用抗原—抗體反應(yīng)檢測抗體基因表達產(chǎn)物。[2020·北京卷](　　)(4)可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細胞。[2014·廣東卷](　　)
1.目的基因的獲取方法(1)利用PCR獲取和擴增目的基因。(2)人工合成目的基因①逆轉(zhuǎn)錄法:主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板,借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈DNA,其過程如下:
②化學(xué)合成法:依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列,推測出其基因序列,然后直接合成目的基因,其過程如下:
(3)從基因文庫中獲取目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息,例如,根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——mRNA,以及基因的表達產(chǎn)物 ——蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。
2.啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入
考向一 結(jié)合基因工程的操作程序,考查科學(xué)思維1.(2024·廣東統(tǒng)考)自然界中很少出現(xiàn)藍色的花,天然藍色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細胞液泡中的花青素在堿性條件下顯藍色。我國科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達載體(如下圖),通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中,在細胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍。
下列相關(guān)敘述錯誤的是(　　)A.上述獲得藍色玫瑰的方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B.將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC.sfp和idgS基因具有各自的啟動子,表達是相互獨立進行的D.農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上
解析 靛藍能夠穩(wěn)定顯色,不受pH的影響,故無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因, A項正確;將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ,則會將終止子一同切除,故只能用BamHⅠ,B項錯誤;sfp和idgS基因具有各自的啟動子,表達是相互獨立進行的,C項正確;將目的基因?qū)胫参锛毎刹捎棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,故農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上,D項正確。
2.(2023·山東名校聯(lián)考)某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點,同時還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程,如下圖所示。請回答下列問題。
(1)將目的基因?qū)胫参锛毎?采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是　　　　;該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段,稱為　　　　。該方法中農(nóng)桿菌的作用是　? 　。?(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比,選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是? 　。防止目的基因自連和質(zhì)粒自連,以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率;防止目的基因與質(zhì)粒反向連接?(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標記基因進行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖,農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因?　　　　(填“是”或“否”)。為什么?含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞
感染煙草細胞,把目的基因插入煙草細胞的染色體DNA上
考向二 圍繞PCR技術(shù),考查科學(xué)思維3.下列關(guān)于實驗“PCR片段的擴增及電泳鑒定”的敘述,錯誤的是(　　)A.進行PCR擴增的依據(jù)是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理B.PCR反應(yīng)中,變性和復(fù)性階段分別需要耐高溫的解旋酶和耐高溫DNA聚合酶參與C.PCR反應(yīng)中,延伸階段可將脫氧核苷酸連接到引物的3'-端D.電泳時,DNA分子在凝膠中的遷移速率與DNA的大小和構(gòu)象等有關(guān)
解析 PCR反應(yīng)中,變性階段需要高溫解開DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),無需解旋酶,復(fù)性階段是指引物與模板結(jié)合,無需DNA聚合酶,延伸階段可將脫氧核苷酸連接到引物的3'-端,B項錯誤,A、C兩項正確;電泳時,DNA分子在凝膠中的遷移速率與DNA的大小和構(gòu)象等有關(guān),瓊脂糖凝膠的濃度也會影響DNA分子的遷移速率,D項正確。
考點三　實驗:DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定(1)實驗原理
2.DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)實驗基礎(chǔ)
(2)PCR實驗操作步驟和電泳鑒定
(3)DNA的測定:凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為　　　　　的紫外燈下被檢測出來。?
教材深挖1.[選擇性必修3第85頁“結(jié)果分析與評價”]電泳鑒定時未出現(xiàn)特異性條帶的原因有哪些?提示 模板DNA出現(xiàn)污染;Taq DNA聚合酶出現(xiàn)質(zhì)量問題;引物特異性不強(如與非目的基因的核苷酸序列有同源性)或形成引物二聚體;復(fù)性時的溫度過低;PCR循環(huán)次數(shù)過多等。2.[選擇性必修3第85頁“結(jié)果分析與評價”]如何來評價擴增的效果?提示 觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
鏈高考·前掛后連(1)在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶。[2019·全國Ⅰ卷](　　)(2)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)。[2014·江蘇卷](　　)
1.PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
2.PCR擴增過程圖示與PCR中的數(shù)量關(guān)系
第二輪:由①得到的DNA分子如下:
由②得到的DNA分子如下:
以此類推,可得以下規(guī)律:
注:第三輪循環(huán)后,開始出現(xiàn)雙鏈等長的目的基因片段。
考向一 圍繞DNA的粗提取與鑒定,考查科學(xué)探究1.下列有關(guān)“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述,正確的是(　　)A.新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取B.DNA不溶于體積分數(shù)為95%的冷酒精而溶于2 ml/L的NaCl溶液C.在研磨植物細胞時加入研磨液是為了溶解細胞壁D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后即呈藍色
解析 豬是哺乳動物,其成熟的紅細胞中無細胞核,不含DNA,因此新鮮豬血不能用于提取DNA,A項錯誤;DNA不溶于體積分數(shù)為95%的冷酒精,但能溶于2 ml/L的NaCl溶液,因此可用酒精進一步純化DNA,B項正確;在研磨植物細胞時加入研磨液是為了破壞細胞壁,C項錯誤;溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑,沸水浴加熱后,顏色呈藍色,D項錯誤。
考向二 圍繞DNA片段的擴增及電泳鑒定,考查科學(xué)探究2.大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后,擬核DNA就會纏繞在細胞壁碎片上,靜置一段時間,質(zhì)粒分布在上清液中,利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA。用三種限制酶處理提取的產(chǎn)物,電泳結(jié)果如圖所示。下列關(guān)于質(zhì)粒的粗提取和鑒定的敘述,正確的是(　　)A.DNA溶于酒精,可用二苯胺試劑在沸水浴條件下鑒定DNAB.電泳鑒定DNA利用了DNA在電場中會向著它所帶電荷相同的電極移動的原理C.根據(jù)電泳結(jié)果,質(zhì)粒上沒有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位點,而有限制酶Ⅲ的切割位點D.用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒,被染色的質(zhì)粒還需要通過紫外燈照射才能看到結(jié)果
解析 DNA不溶于酒精,可用二苯胺試劑在沸水浴條件下鑒定DNA,A項錯誤;DNA帶負電荷,DNA在電場中會向著與它所帶電荷相反的電極移動,B項錯誤;因為質(zhì)粒的本質(zhì)是環(huán)狀的DNA,限制酶Ⅰ和Ⅱ處理后電泳只有一條條帶,可能是該質(zhì)粒上有一個切割位點,也可能沒有切割位點,C項錯誤;用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒時,電泳結(jié)果中的這些條帶通常需要在紫外線下觀察和照射才能顯示出來,因此需要紫外燈照射,D項正確。
3.下圖為利用PCR技術(shù)擴增特定DNA片段的部分示意圖,圖中引物為單鏈DNA片段,它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列有關(guān)描述正確的是(　　)A.利用PCR技術(shù)擴增目的基因時不需要解旋酶而需要耐高溫的DNA聚合酶B.引物是子鏈合成延伸的基礎(chǔ),子鏈沿著模板鏈的5'→3'方向延伸C.從理論上推測,第四輪循環(huán)產(chǎn)物中只含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16D.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中才開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段且占1/2
解析 利用PCR技術(shù)擴增目的基因時不需要解旋酶,該過程中氫鍵的斷裂是通過高溫完成的,而子鏈延伸過程需要耐高溫的DNA聚合酶,A項正確;耐高溫的DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈,即子鏈沿著模板鏈的3'→5'方向延伸,B項錯誤;DNA復(fù)制為半保留復(fù)制,DNA復(fù)制4次,共形成24個DNA,其中2個DNA含有母鏈和子鏈(引物A或引物B),(24-2)個DNA都含有子鏈(含有引物A和引物B),因此,第四輪循環(huán)產(chǎn)物中只含有引物A的DNA片段所占的比例為1/16,C項錯誤;第三輪循環(huán)共形成8個DNA,其中只有2個兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段,占比為1/4,D項錯誤。
角度1 基因工程的基本工具1.(2023·全國新課標卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具,將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接,以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。
下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(　　)A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割,用E.cli DNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.cli DNA連接酶連接
解析 E.cli DNA連接酶不能連接具有平末端的DNA片段,A項錯誤。質(zhì)粒用酶3切割,目的基因用酶1切割,得不到相同的黏性末端,所以二者不能連接,B項錯誤。質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA連接酶能將目的基因和質(zhì)粒連接起來,且避免了目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,所以效率最高,C項正確。酶4會破壞抗生素抗性基因,即標記基因,D項錯誤。
2.(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達載體(重組質(zhì)粒),并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(　　)A.若用HindⅢ酶切,目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
解析 用一種限制酶切割,目的基因在質(zhì)粒上可以正向或反向插入,進而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同,A項正確。用一種限制酶切割后,質(zhì)粒有可能發(fā)生自身環(huán)化,導(dǎo)致目的基因未能插入,B項正確。SphⅠ酶切會在重組質(zhì)粒上產(chǎn)生特定的片段,通過DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離和檢測這些片段,從而確定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功,C項正確。根據(jù)質(zhì)粒圖示,攜帶目的基因的受體菌需要同時具有AmpR和TetR基因才能在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,會破壞四環(huán)素抗性基因(TetR),D項錯誤。
角度2 基因工程的操作程序3.(2023·山東卷)科研人員構(gòu)建了可表達J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進行了檢測,該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示,其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是　　　　　　　。除圖甲中標出的結(jié)構(gòu)外,作為載體,質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有　　　　 　　　　　　　(答出2個結(jié)構(gòu)即可)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后,為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確,需進行PCR檢測,若僅用一對引物,應(yīng)選擇圖甲中的引物　　　　　　　　　。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈,由此可知引物F1與圖甲中J基因的　　(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。?(3)重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)正確表達后,用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達以及表達水平,結(jié)果如圖乙所示。其中,出現(xiàn)條帶1證明細胞內(nèi)表達了　　　　　　　　,條帶2所檢出的蛋白　　　　　　(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。?
復(fù)制原點、標記基因、限制酶識別(或切割)位點
F1和R2或者F2和R1
解析 (1)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位;質(zhì)粒作為載體,必須具備啟動子、終止子、標記基因、復(fù)制原點和限制酶識別(或切割)位點等。(2)為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確,可對J基因和質(zhì)粒中原部分序列進行PCR擴增,則可選擇F1和R2或者F2和R1作為引物;據(jù)“J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈”可判斷左端為b鏈的3'-端,引物F1的左端為5'-端,可推知引物F1與b鏈間堿基互補配對,其與圖甲中J基因的a鏈相應(yīng)部分的序列相同。(3)據(jù)圖乙可知,條帶1既可與抗J蛋白抗體結(jié)合,又可與抗V5抗體結(jié)合,可推測出現(xiàn)條帶1證明該細胞內(nèi)合成了J蛋白和V5蛋白,即表達了J-V5融合蛋白;條帶2只用抗J蛋白抗體檢測出現(xiàn),而用抗V5抗體檢測未出現(xiàn),說明該細胞表達的是單一的J蛋白,而非J-V5融合蛋白,可推測該J蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。
角度3 DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定4.(2023·廣東卷)“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是:裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)A.裂解:使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C.沉淀:可反復(fù)多次以提高DNA的純度D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色
解析 細胞破裂后才能釋放出其中的DNA,A項正確。分離的目的是將混合物中的一些非DNA雜質(zhì)去除,例如多糖和蛋白質(zhì),B項正確。通過反復(fù)沉淀可以去除雜質(zhì),提高DNA的純度,C項正確。鑒定DNA時,加入二苯胺后需要水浴加熱,D項錯誤。
5.(2022·山東卷)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗,下列說法錯誤的是(　　)A.過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C.在一定溫度下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
解析 低溫時DNA酶的活性較低,過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解,A項正確。離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀,B項錯誤。沸水浴條件下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色,C項正確。由于是粗提取,因此提取的DNA中很可能含有蛋白質(zhì),D項正確。
6.(2023·浙江卷1月節(jié)選)甲植物細胞核基因具有耐鹽堿效應(yīng),乙植物細胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應(yīng)。某研究小組用甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交相關(guān)研究,基本過程包括獲取原生質(zhì)體、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合、篩選融合細胞、雜種植株再生和鑒定,最終獲得高產(chǎn)耐鹽堿再生植株。用PCR技術(shù)鑒定再生植株。已知甲植物細胞核具有特異性DNA序列a,乙植物細胞質(zhì)具有特異性DNA序列b;M1、M2為序列a的特異性引物,N1、N2為序列b的特異性引物。完善實驗思路。
(1)提取純化再生植株的總DNA,作為PCR擴增的　　　　。?(2)將DNA提取物加入PCR反應(yīng)體系,　　　 　為特異性引物,擴增序列a;用同樣的方法擴增序列b。?(3)得到的2個PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)　　　　　后,若每個PCR擴增產(chǎn)物在凝膠中均出現(xiàn)了預(yù)期的　　　條條帶,則可初步確定再生植株來自雜種細胞。?
1.(選擇性必修3第80頁正文“拓展思考”)為什么切割含有目的基因的DNA片段和載體要選用同一種限制酶?是否只能用同一種限制酶?提示 選用同一種限制酶切割會產(chǎn)生相同的末端,可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來。也可以使用能產(chǎn)生相同末端的不同限制酶切割。2.(選擇性必修3第80頁正文)基因表達載體是載體的一種,除目的基因、標記基因外,還必須含有啟動子、　　　　等。其中標記基因和啟動子的作用分別是　　　　　 　　　　　、　　　　　　　 　　　。?
便于重組DNA分子的篩選
與RNA聚合酶識別和結(jié)合
3.設(shè)計引物是PCR技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如圖),請分別說明理由。①第1組:　 ;?②第2組:　 。?
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效　引物Ⅰ自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效

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