一、重組DNA技術(shù)的基本工具
1.基因工程(重組DNA技術(shù))概述
賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品
定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙
DNA重組技術(shù)的基本工具(三種“分子工具”)
準(zhǔn)確切割DNA分子的”分子手術(shù)刀”
將DNA片段再連接起來的”分子縫合針”
將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的”分子運(yùn)輸車”
2.重組DNA技術(shù)的基本工具
(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)
主要是從原核生物中分離純化來的
識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
[易錯提醒]　限制酶作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵，不是氫鍵；在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割2次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。
將兩個(gè)DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
E.cliDNA連接酶
縫合黏性末端和平末端（效率較低）
將外源基因送入受體細(xì)胞, 在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制
①穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制，或整合到受體DNA上同步復(fù)制
②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)
③具有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選
[易錯提醒]　與膜載體的區(qū)別：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。
與DNA相關(guān)的五種酶的比較
都能催化形成磷酸二酯鍵
需要DNA的一條鏈作模板
形成完整的重組DNA分子
在兩個(gè)DNA片段間形成磷酸二酯鍵
將單個(gè)核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵
DNA連接酶和DNA聚合酶
如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。
所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(1)不破壞目的基因原則：
(2)保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：
通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；
為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或?yàn)榱吮ＷC目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）可選擇PstⅠ和EcRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。
(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：
(1)EclⅠ是一種 ,其識別序列是 ,切割位點(diǎn)是 與 之間的 鍵。切割結(jié)果產(chǎn)生的DNA片段末端形式為 。(2)不同來源的DNA片段結(jié)合,在這里需要的酶應(yīng)是 連接酶,此酶的作用是在 與 之間形成 鍵,而起“縫合”作用的。還有一種連接平末端的連接酶是 。
右圖為DNA分子的切割和連接過程
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)(2)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個(gè)核苷酸序列(　　)(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(　　)(4)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因(　　)(5)E.cliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(　 )(6)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。( )　　　(7)DNA連接酶能將兩堿基間的氫鍵連接起來（ ）(8)限制酶也可以識別和切割RNA（ ）(9)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體（ ）
1.(2023·高考新課標(biāo)卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(　　)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cli DNA連接酶連接
2.(2024·遼寧丹東高三質(zhì)檢)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請回答下列問題：(1)EcRⅤ酶切位點(diǎn)為 ，EcRⅤ酶切出來的線性載體P1為____末端。解析：由題圖可知，EcR Ⅴ酶切出來的載體質(zhì)粒為平末端。
(2)用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為____________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。解析：由題圖可知，目的基因的兩端各有一個(gè)游離的腺嘌呤脫氧核苷酸，由于載體P1為平末端，所以載體P1的兩端應(yīng)該各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸，這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P1連接起來。
(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況見下表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是____(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是_______________、___________________。
(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對引物是__________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物，結(jié)果從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp 片段，原因是___________________。
選擇Ti質(zhì)粒做載體的原因是什么?
Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上
MAP30蛋白是一種能使Ⅰ型核酸核糖體失活的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)表明MAP30蛋白具有抗pvx病毒功能，為培育高效表達(dá)該基因的馬鈴薯新品種，科研團(tuán)隊(duì)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將MAP30基因?qū)腭R鈴薯細(xì)胞內(nèi)
構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)為避免反向拼接應(yīng)選擇哪種酶識別切割質(zhì)粒?
Xbal和Hindlll
個(gè)體水平上，檢測轉(zhuǎn)基因馬鈴薯是否具有抗病毒的特性，具體做法是?
向轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株接種pvx病毒，觀察并對比它們的感染情況
普通棉花（無抗蟲特性）
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
4.目的基因的檢測與鑒定
請表述出培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的四個(gè)步驟
二、基因工程的基本操作程序
①從相關(guān)的已知 的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一
在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。
(2)明確目的基因的方法：
②利用 和序列比對工具進(jìn)行篩選。
①通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因
基因比較小、核苷酸序列已知
通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成
③利用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因
(3)獲取目的基因的方法
是一項(xiàng)在生物體外_____________________的核酸合成技術(shù)。
②原理：_________________。
復(fù)制特定DNA片段
(4)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
Taq DNA聚合酶:
一般添加Mg2+,激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶
耐高溫的DNA聚合酶(催化形成磷酸二酯鍵)
90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈
50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。
72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。
常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。
每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍,即成____形式擴(kuò)增(約為2n)
[易錯提醒]　變性過程雙鏈DNA解聚為單鏈不需要解旋酶。
PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較
DNA在高溫下變性解旋
細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）
1.PCR循環(huán)圖示與規(guī)律
注：第三輪循環(huán)后，開始出現(xiàn)雙鏈等長的目的基因片段。
2.篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌。
2.篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞(3)篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如下圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如下圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如下圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
① ; ② 。
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。
（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的
使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代
使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用
鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞
目的基因必須插入到 與 之間。
DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。
質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動植物病毒
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來
翻譯的起始信號(編碼氨基酸)
翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)
啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
DNA分子（含目的基因）
帶有黏性末端或平末端的切口
帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
重組DNA分子（重組質(zhì)粒）
(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程
[易錯提醒]　若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現(xiàn)三種情況：目的基因與目的基因連接；目的基因與質(zhì)粒連接；質(zhì)粒與質(zhì)粒的連接，需篩選出重組質(zhì)粒。
只有該步驟沒涉及堿基互補(bǔ)配對原則
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法（我國創(chuàng)造）
將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)
將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物
Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入
將目的基因拼接到 Ti 質(zhì)粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞。
將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。
[易錯提醒]　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入：第一次拼接是指將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是指將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。
受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
[易錯提醒]　分子水平檢測是否插入了目的基因和是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA時(shí)，都遵循堿基互補(bǔ)配對原則；都使用基因探針，探針是放射性同位素或熒光標(biāo)記的含目的基因的單鏈DNA片段。
(1)根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，但都是能編碼蛋白質(zhì)的基因(　　)(2)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制(　　)(3)表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均啟動于復(fù)制原點(diǎn)(　　)(4)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了使DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)(　　)(5)農(nóng)桿菌特點(diǎn)能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。( )(6)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要設(shè)計(jì)兩種引物（ ）(7)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列（ ）(8)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體（ ）(9)應(yīng)用PCR技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)（ ）
考向1　PCR及應(yīng)用1.(2024·廣東梅州聯(lián)考)PCR引物的3′端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5′端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP(四種脫氧核苷三磷酸)是DNA合成的原料。下列相關(guān)說法錯誤的是(　　)A．圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個(gè)環(huán)節(jié)的低B．dNTP作為擴(kuò)增的原料會依次連接到3′端C．Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯鍵的形成D．經(jīng)過1個(gè)循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同
2. (2024·江蘇百校聯(lián)考）重疊延伸PCR是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經(jīng)過多次PCR擴(kuò)增，獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過程。下列敘述錯誤的是(　　)A．引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性越高B．在第一階段由于引物2和引物3發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，因此兩者置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中C．引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制后，共產(chǎn)生4種雙鏈DNA分子D．在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過2次復(fù)制
考向2　基因工程的操作程序3. (2024·中原名校聯(lián)盟）某質(zhì)粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程如下圖所示。請回答下列問題：
(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是________；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為_______。該方法中農(nóng)桿菌的作用是__________________________________________________________。(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ兩種酶的好處是___________________________________ _________________________________________________________________。
感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入煙草細(xì)胞的染色體DNA上　
防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率，防止目的基因與質(zhì)粒反向連接　
(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素培養(yǎng)基上都可以生長繁殖，農(nóng)桿菌中是否已有目的基因？_____(填“是”或“否”)。為什么？_________________________________________________________。
含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞
(4)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作，篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個(gè)菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長狀況如下圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來。
4.(2024·湖北高三聯(lián)考)基因敲減主要是指從轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平使基因表達(dá)失活的技術(shù)，其中RNA干擾技術(shù)是常用的基因敲減技術(shù)，該技術(shù)首先要根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)出反義RNA和正義RNA構(gòu)建成雙鏈RNA(shRNA)，然后用相關(guān)酶切割shRNA形成反義RNA片段，其可與目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基互補(bǔ)配對，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)酶水解mRNA，實(shí)現(xiàn)對基因的敲減。為檢測設(shè)計(jì)出的shRNA是否能成功敲減基因還需要利用熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。
圖1表示敲減載體構(gòu)建，圖2表示熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)檢測的原理?；卮鹣铝袉栴}：
(1)據(jù)圖1分析，若要從含shRNA基因的DNA分子中擴(kuò)增出shRNA基因并能使其在受體細(xì)胞中表達(dá)，則需要用到的引物是____________________，為使擴(kuò)增出的shRNA基因能夠和質(zhì)粒構(gòu)建敲減載體，在設(shè)計(jì)引物時(shí)需在引物的____ (填“5′”或“3′”)端分別添加__________________酶能夠識別的序列。解析：若要從含shRNA基因的DNA分子中擴(kuò)增出shRNA基因并能使其在受體細(xì)胞中表達(dá)，則應(yīng)包含啟動子、終止子序列，且應(yīng)在模板的3′端結(jié)合引物，故需要用到的引物是引物2、引物5；由題意可知，shRNA是根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)出反義RNA和正義RNA構(gòu)建而成的，結(jié)合題圖1中限制酶的切割位點(diǎn)可知，為使擴(kuò)增出的shRNA基因能夠和質(zhì)粒構(gòu)建敲減載體，在設(shè)計(jì)引物時(shí)需在引物的5′端分別添加BamHⅠ、Hind Ⅲ酶能夠識別的序列。
BamHⅠ、Hind Ⅲ
(2)已知mRNA末端缺失會導(dǎo)致mRNA水解。熒光酶報(bào)道基因與欲敲減的目的基因串聯(lián)可構(gòu)成熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)，熒光酶報(bào)道基因與目的基因的連接點(diǎn)是終止密碼子對應(yīng)的序列，而不是終止子，其原因是__________________________________________________________________________________。解析：終止子是一段特殊的DNA序列，位于基因的下游，轉(zhuǎn)錄過程在終止子處會終止，若連接點(diǎn)為終止子則不能實(shí)現(xiàn)兩基因的mRNA的串聯(lián)，故熒光酶報(bào)道基因與目的基因的連接點(diǎn)是終止密碼子對應(yīng)的序列，而不是終止子。
轉(zhuǎn)錄過程在終止子處會終止，若連接點(diǎn)為終止子則不能實(shí)現(xiàn)兩基因的mRNA的串聯(lián)　
(3)熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)與敲減載體一同導(dǎo)入受體細(xì)胞中可以根據(jù)熒光的有無檢測敲減載體是否成功敲減目的基因，其機(jī)理是______________________________________________________________________________________________________________________________。解析：由題意可知，若敲減載體能夠敲減目的基因，則熒光酶報(bào)道基因和目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA會被水解，熒光酶報(bào)道基因不能正常表達(dá)，無法檢測到熒光，故熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)與敲減載體一同導(dǎo)入受體細(xì)胞中可以根據(jù)熒光的有無檢測敲減載體是否成功敲減目的基因。
若敲減載體能夠敲減目的基因，則熒光酶報(bào)道基因和目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA會被水解，熒光酶報(bào)道基因不能正常表達(dá)，無法檢測到熒光
三、DNA的粗提取與鑒定
利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
(1)提取的基本思路：
③在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。
①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。
②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L NaCl溶液。
DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。
能否選用牛、羊、馬、豬等哺乳動物的紅細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？
注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯游锍墒斓募t細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。
鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用
(破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中)
抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；抑制DNA分子運(yùn)動，使DNA易形成沉淀析出；
(2)過濾或離心取上清液：
在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。
直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。
上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？
低溫放置幾分鐘的作用：
稱取30g洋蔥,切碎,然后放入研缽中,倒入10mL研磨液,充分研磨
可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)
(3)預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；
攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向：
減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子
低溫抑制核酸水解酶活性,抑制DNA降解;低溫抑制DNA分子運(yùn)動，使DNA易形成沉淀析出；低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少斷裂。
將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
[易錯提醒]　加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀物；本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)，可選用雞血細(xì)胞作為材料。
(4)NaCl溶液溶解DNA并鑒定
溶液藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關(guān)。
2ml/L的NaCl溶液5mL
(1)如果選用雞血細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如何快速破碎細(xì)胞？
將雞血細(xì)胞置于蒸餾水中，待細(xì)胞漲破后，收集濾液。
利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，不分解DNA，有利于DNA與蛋白質(zhì)分開。
進(jìn)一步純化DNA——用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。
(2)有時(shí)會在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？
(3)有時(shí)還會反復(fù)利用不同濃度的NaCl溶液來溶解、析出DNA，試猜想該操作的目的？
(1)取材原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。(2)過濾含DNA的研磨液時(shí)不能用濾紙代替紗布，否則會因DNA被吸附到濾紙上，而導(dǎo)致DNA大量損失。(3)鑒定DNA用的二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。(4)在DNA進(jìn)一步提純時(shí)，選用預(yù)冷的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。(5)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作為材料。
2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
在電場的作用下，帶電分子向著與它所帶電荷相反的電極移動的過程。
DNA的熱變性原理，即通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。
在凝膠中DNA分子遷移的速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)。
帶電性質(zhì)差異分子本身大小不同分子本身性狀不同
瓊脂糖凝膠電泳（PCR產(chǎn)物一般都通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定）
(2)方法步驟①PCR擴(kuò)增準(zhǔn)備→移液→混合→____________→反應(yīng)。
②鑒定PCR產(chǎn)物：瓊脂糖凝膠電泳法
配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→將電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
考向1　DNA的粗提取與鑒定1.(2024·廣東一模)下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是(　　)A．新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取B．DNA不溶于體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精而溶于 2 ml/L 的NaCl溶液C．在研磨植物細(xì)胞時(shí)加入研磨液是為了溶解細(xì)胞壁D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后即呈藍(lán)色
2. (2024·貴州遵義聯(lián)考)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)A．圖1中的絲狀物不含有DNAB．圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯C．圖1所示操作的原理是DNA溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶酒精D．圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2 ml/L 的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色
考向2　DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是(　　)A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B．PCR利用了DNA的熱變性原理C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
4.在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如下圖所示。以下相關(guān)敘述中，錯誤的是(　　)A．該載體最可能為鏈狀DNA分子B．兩種限制酶在載體上各有一個(gè)酶切位點(diǎn)C．限制酶R1與R2的切點(diǎn)最短相距約200 bpD．限制酶作用位點(diǎn)會導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂
1.(2021·高考全國卷乙)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如下圖所示。?回答下列問題：(1)常用的DNA連接酶有E.cli DNA連接酶和T4 DNA 連接酶。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA連接酶連接。上圖中__________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。解析：E.cli DNA連接酶只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來。T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。
EcR Ⅰ、Pst Ⅰ　
EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ　
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。解析：DNA連接酶通過催化兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將目的基因片段與質(zhì)粒載體片段連接起來。
(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能__________；質(zhì)粒DNA分子上有__________________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是____________________________________________________。解析：作為載體，質(zhì)粒DNA分子上必須有復(fù)制原點(diǎn)，才能使質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能進(jìn)行自我復(fù)制；質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因，可以用添加特定抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的宿主細(xì)胞，以達(dá)到篩選的目的。
一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)　
用添加特定抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化處理的宿主細(xì)胞　
(4)表達(dá)載體含有啟動子，啟動子是指________________________________ ________________________________________________________________________________________。解析：啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，RNA聚合酶與該區(qū)域結(jié)合可驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
位于基因的上游、一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
2.(2022·廣東選擇考)“綠水逶迤去，青山相向開?！贝罅Πl(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)已成為全社會的共識。基于某些梭菌的特殊代謝能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業(yè))為原料，通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，構(gòu)建一種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)?；卮鹣铝袉栴}：(1)研究者針對每個(gè)需要擴(kuò)增的酶基因(如圖)設(shè)計(jì)一對________，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。解析：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)酶基因的前提是根據(jù)目標(biāo)酶基因兩端的堿基序列設(shè)計(jì)一對引物。
(2)研究者構(gòu)建了一種表達(dá)載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達(dá)庫，經(jīng)篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________，終止子的作用是_____________________________________。解析：基因表達(dá)載體中，抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。終止子可終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。
作為標(biāo)記基因，篩選含有目的基因的受體細(xì)胞　
終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來　
(4)這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了______________，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)的優(yōu)勢在于____________________________________________，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會效益。解析：根據(jù)題意可知，這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，以高污染排放企業(yè)排出的CO2等一碳溫室氣體為原料生產(chǎn)丙酮，實(shí)現(xiàn)了廢物的資源化，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看，利用該技術(shù)生產(chǎn)丙酮的過程中不僅不排放CO2，還可以消耗工業(yè)廢氣中的CO2，有利于減緩溫室效應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)較高的經(jīng)濟(jì)效益，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會效益。
不僅不排放CO2，還可以消耗工業(yè)廢氣中的CO2
3.(2023·山東等級考)科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是___________。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有____________________________________________________________(答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可)。解析：RNA聚合酶與圖甲中啟動子結(jié)合開始轉(zhuǎn)錄。作為載體必須具備的條件：要具有限制酶的切割位點(diǎn)；要有標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)，以便于重組質(zhì)粒的篩選；具有復(fù)制原點(diǎn)，能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；是安全的，對受體細(xì)胞無害，而且要易從供體細(xì)胞分離出來。題圖甲有啟動子和終止子，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)。
限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)(答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可)　
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物_________________。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的______(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。
F2和R1(或F1和R2)　

相關(guān)課件

第55講 基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精品課件（新高考通用）：

這是一份第55講 基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精品課件（新高考通用），共1頁。PPT課件主要包含了1培養(yǎng)抗性植物，轉(zhuǎn)基因抗蟲植物，轉(zhuǎn)基因抗病植物，轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物，基因工程的應(yīng)用，①方法，②成果，轉(zhuǎn)基因鯉魚，①常見藥物類型，②實(shí)例等內(nèi)容，歡迎下載使用。

第53講 胚胎工程-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精品課件（新高考通用）：

這是一份第53講 胚胎工程-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精品課件（新高考通用），共1頁。PPT課件主要包含了體外受精，胚胎移植，胚胎分割，胚胎工程的概念，生殖細(xì)胞，早期胚胎，自然受精，受精前的準(zhǔn)備階段，受精階段，準(zhǔn)備階段Ⅰ精子獲能等內(nèi)容，歡迎下載使用。

第50講 微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精品課件（新高考通用）：

這是一份第50講 微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精品課件（新高考通用），共1頁。PPT課件主要包含了培養(yǎng)基的配制，凝固劑，按物理性質(zhì)分，按功能用途分，選擇培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基，KMg等，自養(yǎng)微生物，異養(yǎng)微生物，①碳源等內(nèi)容，歡迎下載使用。

英語朗讀寶

相關(guān)課件 更多

第54講 免疫調(diào)節(jié)-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精講課件（新教材新高考）

第54講 免疫調(diào)節(jié)-備戰(zhàn)2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)精講課件（新教材新高考）
高考生物一輪復(fù)習(xí)第36講基因工程課件

高考生物一輪復(fù)習(xí)第36講基因工程課件
高考生物一輪復(fù)習(xí)第35講基因工程課件

高考生物一輪復(fù)習(xí)第35講基因工程課件
高考生物一輪復(fù)習(xí)（通用版）課件：第12單元-第1講基因工程

高考生物一輪復(fù)習(xí)（通用版）課件：第12單元-第1講基因工程
資料下載及使用幫助
版權(quán)申訴
版權(quán)申訴
若您為此資料的原創(chuàng)作者，認(rèn)為該資料內(nèi)容侵犯了您的知識產(chǎn)權(quán)，請掃碼添加我們的相關(guān)工作人員，我們盡可能的保護(hù)您的合法權(quán)益。
入駐教習(xí)網(wǎng)，可獲得資源免費(fèi)推廣曝光，還可獲得多重現(xiàn)金獎勵，申請 精品資源制作， 工作室入駐。
版權(quán)申訴二維碼
高考專區(qū)
歡迎來到教習(xí)網(wǎng)
  • 900萬優(yōu)選資源，讓備課更輕松
  • 600萬優(yōu)選試題，支持自由組卷
  • 高質(zhì)量可編輯，日均更新2000+
  • 百萬教師選擇，專業(yè)更值得信賴
微信掃碼注冊
qrcode
二維碼已過期
刷新

微信掃碼，快速注冊

手機(jī)號注冊
手機(jī)號碼

手機(jī)號格式錯誤

手機(jī)驗(yàn)證碼 獲取驗(yàn)證碼

手機(jī)驗(yàn)證碼已經(jīng)成功發(fā)送，5分鐘內(nèi)有效

設(shè)置密碼

6-20個(gè)字符，數(shù)字、字母或符號

注冊即視為同意教習(xí)網(wǎng)「注冊協(xié)議」及「隱私條款」
QQ注冊
手機(jī)號注冊
微信注冊

注冊成功

返回
頂部