第31講　微生物的利用
1.細菌的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基:擴大培養(yǎng)用　　　　　　　　培養(yǎng)基,劃線分離用　　　　　　　　　　　培養(yǎng)基。?(2)不同微生物對培養(yǎng)基的需求
(3)培養(yǎng)的方法:需要將已有細菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中,一般用　　　　　　　　(工具)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。?2.細菌分離的方法與特點
3.無菌操作(1)目的:防止實驗室的培養(yǎng)物被其他　　　　　　　污染;避免操作者自身被微生物感染。?
(2)常用的幾種滅菌方法
4.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離(1)大腸桿菌①分裂方式:　　　　　　。?②特性:大腸桿菌是革蘭氏　　　性、　　　　　　(代謝類型)的腸道桿菌,在腸道中一般對人無害,但若進入人的　　　　系統(tǒng),就會對人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是　　　　　　技術(shù)中被廣泛采用的工具。?(2)實驗內(nèi)容:將大腸桿菌擴大培養(yǎng)和劃線分離,即用　　　　　　　　培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)大腸桿菌,培養(yǎng)后再在　　　　　　　　　　培養(yǎng)基上劃線進行分離,隨后培養(yǎng)基上就會形成一個個單獨的菌落。?
(4)大腸桿菌分離的用途:單菌落的分離是　　　　　　　　的通用方法,也是用于篩選　　　　　　　菌株的最簡便方法之一。?
考向一　劃線分離法和涂布分離法【典例1-1】 如圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序為1、2、3、4、5。下列敘述正確的是(　　)A.在五個區(qū)域中劃線前后都要對接種環(huán)和培養(yǎng)基進行滅菌B.劃線操作時完全打開培養(yǎng)皿蓋,劃完立即蓋上C.接種時不能劃破培養(yǎng)基,否則難以達到分離單菌落的目的D.第1區(qū)和第5區(qū)的劃線最終要連接起來,以便比較前后的菌落數(shù)
【典例1-2】 用劃線分離法或涂布分離法純化大腸桿菌時(　　)①可以用相同的培養(yǎng)基②都需要使用接種環(huán)進行接種③都需要在酒精燈火焰旁進行接種④都可以用來計數(shù)活菌A.①②　B.③④C.①③D.②④
概念辨析微生物接種的兩種常用方法比較
考向二　無菌操作【典例1-3】 下列有關(guān)微生物培養(yǎng)的敘述中,不正確的是(　　)A.獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染B.單菌落的分離是消除污染的雜菌的通用方法C.培養(yǎng)基都必須使用高壓蒸汽滅菌法滅菌D.倒置平板防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落
【典例1-4】 (2018浙江選考十校聯(lián)盟3月適應(yīng)性考試)回答下列與微生物的培養(yǎng)和利用有關(guān)的問題。(1)微生物在試管中培養(yǎng)時通常加棉塞,周圍沒有皺褶和縫隙,容易拔出,但用手提著棉塞時,試管又不能落下。棉塞的作用有兩個:一是　　　　　　　　　　　　　;二是保證通氣良好。制作棉塞所用的棉花不能用脫脂棉,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。?(2)測定微生物生長曲線的方法有很多,有血細胞計數(shù)板法、平板　　　　　計數(shù)法、　　　　　法等。制作生長曲線時,以　　　　　　　　　　作縱坐標(biāo),　　　　　　　　作橫坐標(biāo)。?(3)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,一般要將pH調(diào)至　　　　　　　　,以利于細菌的生長繁殖。?
答案:(1)防止雜菌污染　脫脂棉易吸水,吸水后容易引起污染　(2)菌落　比濁　菌數(shù)的對數(shù)　生長時間　(3)中性偏堿解析:(1)微生物培養(yǎng)過程中棉塞既可以防止雜菌的污染,又可以保證通氣良好。因為脫脂棉易吸水,吸水后容易引起污染,所以制作棉塞所用的棉花不能用脫脂棉。(2)測定微生物生長曲線的方法有很多,有血細胞計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、比濁法等。制作生長曲線時,應(yīng)以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo),生長時間為橫坐標(biāo)。(3)培養(yǎng)一般細菌時,需要將培養(yǎng)基的pH調(diào)至中性偏堿。
考向三　大腸桿菌的培養(yǎng)和分離【典例1-5】 (2018浙江麗水學(xué)院附中階段考)下列是有關(guān)大腸桿菌的培養(yǎng)實驗,請回答問題。(1)配制培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基時,根據(jù)“細菌喜葷,霉菌喜素”的規(guī)律,通常在培養(yǎng)基中加入蛋白胨和　　　　　　　　　　作為營養(yǎng)物質(zhì),為維持一定的滲透壓,常需加入一定量的　　　　　　　　　　　　。?
(2)大腸桿菌培養(yǎng)和分離的實驗中,在　　　　　　　　　　　中進行擴大培養(yǎng),培養(yǎng)液經(jīng)　　　　　　　　　后,在LB固體培養(yǎng)基上進行　　　　　　　　　,并將培養(yǎng)皿　　　　　　　　　　　放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),可以獲得如圖效果。為了檢測接種、培養(yǎng)過程是否受雜菌污染以及　　　　　　　　　　　　,應(yīng)同時將未接種的培養(yǎng)基放入相同條件的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。?(3)對獲得的純菌種通常可以依據(jù)　　　　　　　　　的形狀、大小等特征進行初步的鑒定。?
(4)下列關(guān)于“大腸桿菌培養(yǎng)和分離”的操作中,敘述正確的是(　　)A.高壓滅菌加熱結(jié)束時,打開放氣閥使壓力表指針回到零后,開啟鍋蓋B.倒平板時,應(yīng)將打開的皿蓋放到一邊,以免培養(yǎng)基濺到皿蓋上C.為了防止污染,接種工具經(jīng)火焰滅菌后應(yīng)趁熱快速挑取菌落D.用記號筆標(biāo)記培養(yǎng)皿中菌落時,應(yīng)標(biāo)記在皿底上
答案:(1)酵母提取物　NaCl　(2)LB液體培養(yǎng)基　稀釋　分離　倒置　無菌操作是否規(guī)范　(3)菌落　(4)D
解析:(1)配制培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基時,根據(jù)“細菌喜葷,霉菌喜素”的規(guī)律,通常在培養(yǎng)基中加入蛋白胨和酵母提取物作為營養(yǎng)物質(zhì),為維持一定的滲透壓,常需加入一定量的NaCl。(2)大腸桿菌培養(yǎng)和分離的實驗中,在LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng),培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后,在LB固體培養(yǎng)基上進行分離,并將培養(yǎng)皿倒置放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);為了檢測接種、培養(yǎng)過程是否受雜菌污染以及無菌操作是否規(guī)范,應(yīng)同時將未接種的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(3)通常對獲得的純菌種可以依據(jù)菌落的形狀、大小等特征進行初步的鑒定。(4)高壓滅菌加熱結(jié)束,等待壓力表指針回到零后,才能開啟鍋蓋,不能直接打開放氣閥使壓力表指針回到零,A項錯誤;倒平板過程中不能打開培養(yǎng)皿的皿蓋,以防止雜菌污染,B項錯誤;接種環(huán)在火焰上灼燒后,待冷卻后才可以快速挑取菌落,C項錯誤;用記號筆標(biāo)記培養(yǎng)皿中菌落時,應(yīng)標(biāo)記在皿底上,D項正確。
易錯提醒(1)恒溫培養(yǎng)時,培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā),倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上;如果正放培養(yǎng)皿,則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并且擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落,則菌落中的菌會隨水?dāng)U散,菌落間相互影響,很難再分成單菌落,達不到分離的目的。因此恒溫培養(yǎng)時,培養(yǎng)皿必須倒置。(2)平板劃線時除第一次劃線外,每一次劃線的起點都是上一次劃線的末端,而不是第一次劃線的末端。
分離以尿素為氮源的微生物1.菌種特點含有　　　酶,可通過降解尿素作為其生長的氮源。?2.培養(yǎng)基:以　　　　為唯一氮源的培養(yǎng)基,以　　　 　　　　為對照。?3.實驗原理(1)篩選以尿素為氮源的微生物,可使用以尿素為唯一氮源的　　　　培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)。?(2)脲酶能將尿素分解成　　　　,致使培養(yǎng)基的pH升高,使培養(yǎng)基中的酚紅由紅黃色變成　　　　色。?
考向一　分離以尿素為氮源的微生物【典例2-1】 下圖是“分離以尿素為氮源的微生物”實驗的基本流程,請回答下列問題。
(1)尿素溶液可用　　　　　　　　　　　　　　使之無菌。若要檢查B過程滅菌是否徹底,可以采用的方法是　　　　　　　。?(2)圖中步驟C為　　　　　　　。相對于劃線分離法,過程D涂布分離法的優(yōu)點是　　　　　　　　　　　　。?(3)如果菌落周圍出現(xiàn)　　　　色環(huán)帶,說明該菌落能分泌脲酶。?
答案:(1)G6玻璃砂漏斗過濾　將空白培養(yǎng)基放在適宜溫度下培養(yǎng)一段時間,觀察有無菌落出現(xiàn)　(2)倒平板　單菌落更易分開　(3)紅解析:(1)尿素用G6玻璃砂漏斗過濾除去其中的細菌等微生物。(3)若菌落能分泌脲酶,則菌落周圍會出現(xiàn)紅色環(huán)帶。
疑難解析1.培養(yǎng)基中觀測指標(biāo)的分析(1)培養(yǎng)基中的酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化(變紅),標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用,從而證明這一菌株能以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大,表明菌株利用尿素的能力越強。(2)與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較,尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落,這一現(xiàn)象表明能利用尿素的細菌在土壤菌群中只占極少部分。2.樣品稀釋的原因和標(biāo)準(zhǔn)(1)稀釋原因:樣品的稀釋度直接影響平板上生長的菌落數(shù)。在適當(dāng)?shù)南♂尪认?培養(yǎng)基表面生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此,恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)的關(guān)鍵。(2)稀釋標(biāo)準(zhǔn):選用一定范圍的樣品稀釋液進行培養(yǎng),為了保證結(jié)果準(zhǔn)確,一般選擇菌落數(shù)在30~300的平板計數(shù)。
考向二　實驗應(yīng)用【典例2-2】 (2018浙江寧波3月新高考模擬)研究小組從土壤中篩選以多環(huán)芳烴(PAHs)為碳源和能源的細菌,用以降解工業(yè)廢水和生活污水中的PAHs。請回答下列問題。(1)為了從土壤中篩選PAHs降解菌,需配制以　　　　　　為唯一碳源的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基經(jīng)　　　　[A.121 ℃(500 g/cm2壓力),15 min　B.90 ℃(500 g/cm2壓力),15 min?C.121 ℃(1 kg/cm2壓力),15 min　D.90 ℃(500 g/cm2壓力),30 min]高壓蒸汽滅菌,待冷卻至60 ℃后倒平板。(2)倒平板時應(yīng)使錐形瓶的瓶口通過火焰,目的是　　　。在倒平板的過程中,如果培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位,則這個平板不能用來培養(yǎng)PAHs降解菌,原因是　　　。?
(3)制備土壤稀釋液,用　　　　　方法接種于固體培養(yǎng)基表面,培養(yǎng)時,需將培養(yǎng)皿　　　并放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。?(4)用劃線法純化PAHs降解菌的過程中,在第二次及其后的劃線操作時,須從上一次劃線的末端開始劃線,原因是　　　　　　。?
答案:(1)PAHs　C　(2)防止雜菌污染　空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生　(3)涂布　倒置　(4)使細菌數(shù)隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少,最終得到由單個細菌繁殖而成的菌落
解析:(1)從土壤中篩選PAHs降解菌,需配制以PAHs為唯一碳源的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃(1 kg/cm2壓力)、15 min的高壓蒸汽滅菌,待冷卻至60 ℃后倒平板。(2)倒平板時,為了防止雜菌污染,應(yīng)使錐形瓶的瓶口通過火焰。在倒平板的過程中,如果培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位,則可能導(dǎo)致空氣中的微生物在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生,因此這個平板不能用來培養(yǎng)PAHs降解菌。(3)制備土壤稀釋液,用涂布方法接種于固體培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)時,為了防止培養(yǎng)皿被污染,需將培養(yǎng)皿倒置并放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。(4)用劃線法純化PAHs降解菌的過程中,在第二次及其后的劃線操作時,須從上一次劃線的末端開始劃線,原因是:使細菌數(shù)隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少,最終得到由單個細菌繁殖而成的菌落。
導(dǎo)師點睛微生物篩選過程中必要的兩種對照培養(yǎng)基及其作用
(2016浙江10月選考,32節(jié)選)請回答從土壤中分離產(chǎn)脲酶細菌和脲酶固定化實驗的有關(guān)問題。(1)LB固體培養(yǎng)基:取適量蛋白胨、酵母提取物、NaCl,加入一定量的蒸餾水溶解,再加　　　　　　　　　,滅菌備用。?(2)尿素固體培養(yǎng)基:先將適宜濃度的尿素溶液用　　　　　　　　滅菌過的 G6玻璃砂漏斗過濾,G6玻璃砂漏斗因為　　　　　　　　　　　　　　　　　,故用于過濾除菌。然后將尿素溶液加入已經(jīng)滅菌的含有酚紅的培養(yǎng)基中,備用。?
(3)取適量含產(chǎn)脲酶細菌的10-4、10-5兩種土壤稀釋液,分別涂布接種到LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48 h,推測固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)最少的是　　　　(A.10-5稀釋液+尿素固體培養(yǎng)基　B.10-5稀釋液+LB固體培養(yǎng)基　C.10-4稀釋液+尿素固體培養(yǎng)基　D.10-4稀釋液+LB固體培養(yǎng)基)。在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生脲酶細菌菌落周圍出現(xiàn)　　　　　　,其原因是細菌產(chǎn)生的脲酶催化尿素分解產(chǎn)生　　　 所致。?(4)制備固定化脲酶時,用石英砂吸附脲酶,裝柱。再用蒸餾水洗滌固定化酶柱,其作用是　　　　　　　　　　　。?
答案:(1)瓊脂　(2)高壓蒸汽　孔徑小,細菌不能濾過　(3)A　紅色環(huán)　氨(或NH3)　(4)除去游離的脲酶

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