考點1 基因工程的基本工具
學(xué)生用書P343
1.基因工程的概念
（1）手段：按照人們的愿望，通過[1] 轉(zhuǎn)基因 等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。
（2）目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和[2] 生物產(chǎn)品 。
（3）操作水平：[3] 分子水平 。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作[4] 重組DNA技術(shù) 。
2.基因工程的基本工具
教材補遺[選必3 P72“旁欄思考”]DNA連接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因：①DNA連接酶是催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，而DNA聚合酶只能催化單個脫氧核苷酸加到已有的DNA片段3'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶起作用時不需要模板。
3.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
基礎(chǔ)自測
1.重組DNA技術(shù)所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。（ × ）
2.所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列。（ × ）
3.切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。（ × ）
4.限制酶和DNA連接酶的作用部位一致，但作用相反。（ √ ）
5.所有DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端。（ × ）
6.載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。（ √ ）
7.載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因。（ × ）
深度思考
1.原核生物中存在限制酶的意義是什么？
提示 當(dāng)外源DNA入侵時，原核生物會利用限制酶切割外源DNA以保證自身安全，這是原核生物在長期進化過程中形成的防御機制。
2.原核生物中限制酶為什么不切割自身的DNA？
提示 原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾等。
3.基因工程中的載體與細(xì)胞膜上的載體相同嗎？
提示 不同?；蚬こ讨械妮d體通常是質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等，主要作用是攜帶外源基因進入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中進行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA進行同步復(fù)制；細(xì)胞膜上的載體一般為蛋白質(zhì)，主要是運載要進入細(xì)胞的特定物質(zhì)。
4.天然質(zhì)粒一般不能直接用作基因工程載體的原因是什么？
提示 只有具有能自我復(fù)制、有一個或多個限制酶切割位點、有標(biāo)記基因及對受體細(xì)胞無害等特點的質(zhì)粒才可以直接用作基因工程的載體。實際上天然質(zhì)粒一般不完全具備上述條件，其往往需要進行人工改造后才能用于基因工程操作。
學(xué)生用書P345
命題點 基因工程所需的工具酶分析
1.[2023新課標(biāo)]某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點）和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。
下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（ C ）
A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA連接酶連接
B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA連接酶連接
C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA連接酶連接
D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cli DNA連接酶連接
解析 只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化或者使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，而且酶3切割產(chǎn)生平末端，E.cli DNA連接酶不能連接具有平末端的DNA片段，A錯誤；用酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，無法連接，B錯誤；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA連接酶連接，使目的基因定向插到質(zhì)粒中，C正確；用酶4切割質(zhì)粒會破壞標(biāo)記基因，不能選擇酶4切割，D錯誤。
通性通法
圖解限制酶的選擇依據(jù)
甲乙
（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類
①應(yīng)選擇位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲中可選擇PstⅠ。
②不能選擇目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲中不能選擇Sma Ⅰ。
（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類
①通常選擇與待切割目的基因相同的限制酶，以確保出現(xiàn)相同的黏性末端，如圖乙中的PstⅠ。
②在只有一種標(biāo)記基因時，選擇的限制酶不能破壞標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因。
2.[2023保定模擬，10分]如圖為大腸桿菌及質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)模式圖，據(jù)圖回答下列問題。
（1）a和質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)相同，都是 DNA ，二者還具有其他共同點，如 能夠自我復(fù)制 （寫出一條即可）。
（2）若質(zhì)粒的切割末端為，則與之連接的目的基因切割的黏性末端應(yīng)為；可使用 DNA連接酶 把質(zhì)粒和目的基因連接在一起。
（3）氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上作為 標(biāo)記基因 ，其作用是 便于重組DNA的鑒定和篩選 。
（4）下列常在基因工程中作為載體的是（ C ）
A.蘇云金桿菌抗蟲基因
B.農(nóng)桿菌環(huán)狀RNA分子
C.大腸桿菌的質(zhì)粒
D.動物細(xì)胞的染色體
（5）除質(zhì)粒外，常用的載體還有 噬菌體 和 動植物病毒 等。
解析 （1）圖中a是擬核DNA，擬核DNA和質(zhì)粒的本質(zhì)都是DNA分子，均能夠自我復(fù)制。（2）DNA連接酶可以將具有互補末端的2個DNA片段連接在一起，形成重組DNA分子，若質(zhì)粒的切割末端為，則與之連接的目的基因切割的黏性末端應(yīng)為。（3）質(zhì)粒上常具有標(biāo)記基因（如抗生素的抗性基因），便于重組DNA的鑒定與篩選。
考點2 基因工程的基本操作程序
學(xué)生用書P346
1.基因工程的基本操作程序
教材補遺 [選必3 P77“相關(guān)信息”]Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。
2.利用PCR獲取和擴增目的基因
PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的異同
基礎(chǔ)自測
1.基因表達載體中含有啟動子和密碼子。（ × ）
2.基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心。（ √ ）
3.啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼子。（ × ）
4.Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與雙子葉植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起。（ √ ）
5.將重組表達載體導(dǎo)入動物受精卵常用基因槍法。（ × ）
6.PCR擴增時，50 ℃左右，引物與作為模板的單鏈DNA特定部位相互配對、結(jié)合。（ √ ）
深度思考
1.構(gòu)建基因表達載體時，為什么一般選用兩種限制酶切割目的基因和載體？
提示 因為用不同的限制酶分別處理目的基因和載體時，可以使目的基因兩側(cè)和載體上各自具有兩個不同的黏性末端，防止目的基因或載體發(fā)生自身環(huán)化及目的基因與載體反向連接。
2.啟動子與起始密碼子、終止子與終止密碼子有什么不同？
提示 啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
3.在構(gòu)建基因表達載體時，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的識別序列，為什么？
提示 不能，因為目的基因的序列中若含有用到的限制酶的識別序列，目的基因可能會被切斷。
4.在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過程中，為什么一定要將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上？
提示 Ti質(zhì)粒的T－DNA是可轉(zhuǎn)移的DNA，可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中，就可以使目的基因進入植物細(xì)胞。
5.復(fù)性時，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機的，但兩條解開的DNA模板鏈結(jié)合的概率較低，其原因是什么？
提示 ①模板鏈一般較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率低；②加入引物的量足夠多，而模板鏈較少，故引物和模板鏈結(jié)合的機會遠(yuǎn)大于模板鏈間的。
學(xué)生用書P347
命題點1 PCR的過程和應(yīng)用分析
1.[2021湖北]某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（ D ）
A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間
C.延長延伸的時間 D.提高復(fù)性的溫度
解析 PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速率，但不會減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯誤；延長熱變性的時間和延伸的時間對延伸中的配對影響不大，故不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)生，B、C錯誤；非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過低使引物與模板的結(jié)合位點增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。
2.[2022遼寧]抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12－5是我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進行目的基因監(jiān)測，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是（ B ）
A.預(yù)變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復(fù)制
B.后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
C.延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制
D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因后即可上市
解析 預(yù)變性的溫度為94 ℃，在這個溫度下，雙鏈DNA解旋為單鏈，但模板鏈不易和引物結(jié)合，不能進行復(fù)制，A錯誤。延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長了延伸時間，使目的基因的擴增更加充分，B正確。延伸過程需要引物與模板鏈結(jié)合，在引物的3'端加上相應(yīng)的核苷酸，C錯誤。轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因且已經(jīng)表達使生物體表現(xiàn)出相應(yīng)性狀后，還需要經(jīng)過系列的安全性評價，符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后才能上市，D錯誤。
命題點2 基因工程的基本操作程序分析
3.[2023全國乙節(jié)選，10分]GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因為材料，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉栴}。
（1）構(gòu)建突變基因文庫。科研人員將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。
（2）構(gòu)建目的基因表達載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)建表達載體，其模式圖如圖所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為 終止子 ；②為 啟動子 ，其作用是 被RNA聚合酶識別并結(jié)合，驅(qū)動GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄 。
（3）目的基因的表達?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達載體導(dǎo)入大腸桿菌中進行表達，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是 密碼子的簡并使GFP基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前相同 （答出1點即可）。
（4）新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進行測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因（黃色熒光蛋白基因）。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達，實驗思路是 選擇合適的運載體，利用合適的限制酶和DNA連接酶將YFP基因和運載體連接起來，構(gòu)建基因表達載體，之后將基因表達載體導(dǎo)入酵母菌，檢測酵母菌是否會發(fā)黃色熒光 。
解析 （2）一個基因表達載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動子、終止子以及標(biāo)記基因等。啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。（3）結(jié)合題中信息可知，將構(gòu)建好的表達載體導(dǎo)入大腸桿菌中進行表達，發(fā)現(xiàn)有的大腸桿菌發(fā)綠色熒光，即GFP蛋白的熒光顏色，推測發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子的簡并使GFP基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前的相同。（4）基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的篩選與獲取；②基因表達載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測與鑒定。欲通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達，可通過基因工程的方法將目的基因?qū)虢湍妇髾z測酵母菌是否發(fā)黃色熒光，如果發(fā)黃色熒光，則可證明YFP基因能在真核細(xì)胞中表達，否則，不能證明YFP基因能在真核細(xì)胞中表達。
4.[2021福建節(jié)選，10分]微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于動植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用?？蒲腥藛T將棗樹的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌。回答下列問題：
（1）根據(jù)棗樹的MT cDNA的核苷酸序列設(shè)計了相應(yīng)的引物（圖中甲），通過PCR擴增MT基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為 引物1和引物4 。
（2）本實驗中，PCR所用的DNA聚合酶擴增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點及相應(yīng)的酶切序列如圖中乙所示。
①選用 EcR Ⅴ 酶將載體P切開，再用 T4 DNA （填“T4 DNA”或“E.cliDNA”）連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P'。
②載體P'不具有表達MT基因的 啟動子 和 終止子 。選用 Xh Ⅰ和Pst Ⅰ 酶組合對載體P'和載體E進行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進行連接，將得到的混合物導(dǎo)入用 鈣 離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。
解析 （1）據(jù)題中信息知，A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置，若要通過PCR技術(shù)擴增MT基因，應(yīng)選用引物1和引物4。（2）①通過PCR技術(shù)擴增出的MT基因的末端為平末端，載體P中有限制酶Xh Ⅰ、EcR Ⅴ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ 的酶切位點，用限制酶Xh Ⅰ、Pst Ⅰ 切割載體P得到的均為黏性末端，而用限制酶EcR Ⅴ和Sma Ⅰ 切割載體P得到的均是平末端，但不能用限制酶Sma Ⅰ 進行酶切，若用限制酶Sma Ⅰ 進行酶切，無法將目的基因插入載體E中，因此，應(yīng)選用EcR Ⅴ酶將載體P切開，再用能連接平末端的T4 DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P'。②載體P'不具有表達MT基因的啟動子和終止子。再選用Xh Ⅰ 和Pst Ⅰ 酶組合對載體P'和載體E進行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進行連接，將得到的混合物導(dǎo)入用鈣離子處理的大腸桿菌中，篩出MT工程菌。
考點3 DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴增與鑒定
學(xué)生用書P348
1.DNA的粗提取與鑒定
2.DNA片段的擴增及電泳鑒定
（1）原理
（2）方法步驟
基礎(chǔ)自測
1.進行“DNA的粗提取”實驗時，為獲得較好的提取效果，應(yīng)離心2次，第一次離心后應(yīng)保留上清液，第二次離心后應(yīng)棄去上清液，且兩次離心的轉(zhuǎn)速也不相同。（ √ ）
2.Taq DNA聚合酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA聚合酶。（ √ ）
3.PCR中離心的目的是讓反應(yīng)組分在離心管中分層分布。（ × ）
4.電泳鑒定PCR產(chǎn)物時，應(yīng)在每個加樣孔中加入等量的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液的混合液。（ × ）
5.粗提取的DNA溶于2 ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍(lán)色[2023江蘇，T9D]。（ × ）
6.過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解[2022山東，T13A]。（ √ ）
深度思考
1.能否選擇哺乳動物的成熟紅細(xì)胞作為DNA粗提取的實驗材料，為什么？
提示 不能。因為哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體等，不含DNA。
2.DNA的電泳鑒定實驗中，影響DNA分子遷移速率的因素有哪些？
提示 影響DNA分子遷移速率的因素有凝膠濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等。
學(xué)生用書P349
命題點1 DNA的粗提取與鑒定
1.[2023廣東改編]“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（ D ）
A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)
B.分離：可去除混合物中的部分多糖、蛋白質(zhì)等
C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度
D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色
解析 “DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解、分離、沉淀、鑒定。裂解的目的是使細(xì)胞破裂，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確。DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)等，分離過程中混合物中的部分多糖、蛋白質(zhì)等可被去除，B正確。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度可去除雜質(zhì)，反復(fù)多次以提高DNA的純度，C正確。進行DNA鑒定時可以使用二苯胺試劑，但要進行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D錯誤。
命題點2 DNA片段的擴增與電泳鑒定
2.[2023浙江6月]某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。
圖甲
圖乙
下列敘述正確的是（ B ）
A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因表達
B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子
D.若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子
解析 由圖甲可知，Gata3基因與GFP基因共用一個啟動子，且由題干可知兩基因能正常表達出相關(guān)蛋白質(zhì)，A錯誤；由于啟動子在左側(cè)，基因在右側(cè)，轉(zhuǎn)錄基因時，先轉(zhuǎn)錄Gata3基因，再轉(zhuǎn)錄GFP基因，且翻譯的方向是沿mRNA從5'→3'，因此翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；由圖乙可知，大片段包含GFP基因編碼區(qū)片段，小片段不包含GFP基因編碼區(qū)片段，則2號小鼠是Gata3-GFP基因純合子，4號小鼠是野生型，C錯誤；若用引物1和引物3進行PCR，雜合子和Gata3-GFP基因純合子均能擴增出條帶，僅有Gata3基因時無法擴增出條帶，不利于區(qū)分雜合子和純合子，D錯誤。
1.[2023遼寧]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實時監(jiān)控CD163蛋白的表達和轉(zhuǎn)運過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起（如下圖），使其表達成一條多肽。該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去（ B ）
A.CD163基因中編碼起始密碼子的序列
B.CD163基因中編碼終止密碼子的序列
C.RFP基因中編碼起始密碼子的序列
D.RFP基因中編碼終止密碼子的序列
解析 由題意可知，若想使紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起，使其表達成一條多肽，則CD163基因和紅色熒光蛋白RFP基因都需進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，再結(jié)合圖示可知，CD163基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中不能出現(xiàn)終止密碼子，否則在翻譯時會提前終止，無法表達出既含CD163蛋白又含紅色熒光蛋白RFP的一整條多肽，因此該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去CD163基因中編碼終止密碼子的序列，B符合題意，A、C、D不符合題意。
2.[2023湖北]用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（ D ）
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同
B.若用Pνu Ⅰ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否
D.若用Sph Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
解析 若用Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用Pvu Ⅰ酶切，會破壞氨芐青霉素抗性基因，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落可能是由含有目的基因的重組質(zhì)粒形成的，也可能是由質(zhì)粒自身連接的產(chǎn)物形成的，因此，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；若用Sph Ⅰ酶切，由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的堿基對數(shù)不同，因此可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；若用Sph Ⅰ酶切，會破壞四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌能在含Amp（氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中形成菌落，不能在含Tet（四環(huán)素）的培養(yǎng)基中形成菌落，D錯誤。
3.[2021山東]粗提取DNA時，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是（ A ）
A.加入適量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95％的冷卻的酒精
D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2 ml/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14 ml/L
解析 木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)，故在得到的濾液中加入適量的木瓜蛋白酶后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A符合題意。將制備的含有DNA的濾液放入60～75 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘，利用DNA和蛋白質(zhì)對高溫的耐受性不同，使蛋白質(zhì)變性，從而更好地與DNA分離，B不符合題意。DNA不溶于體積分?jǐn)?shù)為95％的冷卻的酒精，因此向含有DNA的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95％的冷卻的酒精后DNA會析出，C不符合題意。DNA在0.14 ml/L的NaCl溶液中的溶解度最低，因此將含DNA的NaCl溶液調(diào)至0.14 ml/L，濾液中幾乎不含DNA，D不符合題意。
4.[2023山東，10分]科研人員構(gòu)建了可表達J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示。其中V5編碼序列表達標(biāo)簽短肽V5。
（1）與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是 RNA聚合酶 。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有 標(biāo)記基因、復(fù)制原點 （答出2個結(jié)構(gòu)即可）。
（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物 F2和R1（或F1和R2） 。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物 F1 與圖甲中J基因的 a鏈 （填“a鏈”或“b 鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。
（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達以及表達水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達了 J-V5融合蛋白 ，條帶2所檢出的蛋白 不是 （填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。
解析 （1）啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能夠驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點等。（2）如果引物的結(jié)合位點全部位于目的基因上，則無論目的基因插入的方向如何，均可通過PCR進行擴增，因此若通過PCR檢測目的基因是否正確插入，所選的一對引物中的一個必須與目的基因結(jié)合，另一個必須在目的基因外側(cè)，這2個引物方向相反并且均指向目的基因。由以上分析可知，若要確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，則可利用圖甲中引物F2和R1進行PCR擴增。若J基因沒有連接到質(zhì)粒中，則引物R1沒有結(jié)合部位，擴增不出J基因；若J基因連接到質(zhì)粒中但反向插入，則利用圖甲中引物F2和R1擴增不出J基因。同理可知，還可選擇圖甲中引物F1和R2進行PCR擴增，以確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確。轉(zhuǎn)錄時mRNA的合成方向為5'→3'，又知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，所以b鏈左側(cè)是3'端，右側(cè)是5'端。PCR擴增時引物F1與模板鏈3'端的堿基進行互補配對，所以引物F1與圖甲中J基因的b鏈左側(cè)相應(yīng)部分的序列互補，與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達以及表達水平。分析題圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體檢測后，均有條帶1，說明細(xì)胞內(nèi)表達了J-V5融合蛋白。用抗J蛋白抗體檢測后，出現(xiàn)條帶2，而用抗V5抗體檢測后，沒有出現(xiàn)條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。
5.[2023江蘇，12分]為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題：
（1）分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有 模板、引物 ，擴增程序中最主要的不同是 延伸時間 。
（2）有關(guān)基因序列如圖2。引物F2-F、F1-R應(yīng)在下列選項中選用 CD 。
A.ATGGTG……CAACCA
B.TGGTTG……CACCAT
C.GACGAG……CTGCAG
D.CTGCAG……CTCGTC
（3）將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有 限制酶、DNA連接酶 。
（4）轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有 ABC 。
A.稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落
B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高
C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落
D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化
（5）為了驗證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1
-F和F2-R進行了PCR擴增，質(zhì)粒P1～P4的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有 P3、P4 。
（6）對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進一步通過基因測序確認(rèn)，原因是 電泳僅能檢測DNA分子的大小，無法確定DNA分子的堿基序列是否正確 。
解析 （1）進行PCR反應(yīng)所需的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（一般要添加Mg2＋）。分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有模板、引物。擴增程序中最主要的不同是延伸的時間。（2）由圖1可知，引物F2-F用于擴增F2片段（AnB1），引物F1-R用于擴增F1片段（EGFP）。C選項中5'－CTGCAG－3'能與AnB1中左側(cè)部分序列進行堿基互補配對，因此引物F2-F選用C。D選項中5'－CTCGTC－3'能與EGFP中右側(cè)部分序列進行堿基互補配對，因此引物F1-R選用D。（3）傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建時，會用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口，然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，該過程不需要使用限制酶、DNA連接酶。（4）用稀釋涂布平板法計數(shù)時，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進行計數(shù)，稀釋涂布平板不需要控制每個平板的菌落數(shù)，A錯誤；抗性平板上未長出菌落的原因可能是轉(zhuǎn)化失敗或涂布器溫度過高，一般不是培養(yǎng)基溫度太高，B錯誤；轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能生長，故抗性平板上不會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化微生物的方法，用稀釋涂布平板法在抗性平板上接種后，長出的單菌落無需進一步劃線純化，D正確。（5）EGFP的長度為720 bp，AnB1的長度為390 bp，二者的總長為720＋390＝1 100（bp），用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1-F和F2-R進行PCR擴增，若質(zhì)粒符合設(shè)計，則用引物F1-F和F2-R應(yīng)擴增出長度為1 100 bp的片段，根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4。（6）電泳僅能檢測DNA分子的大小，無法確定DNA分子的堿基序列是否正確，因此對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進一步通過基因測序確認(rèn)。
6.[2022遼寧節(jié)選，4分]某抗膜蛋白治療性抗體藥物研發(fā)過程中，需要表達N蛋白胞外段，制備相應(yīng)的單克隆抗體，增加其對N蛋白胞外段特異性結(jié)合的能力。Ⅰ.N蛋白胞外段抗原制備，流程如圖。
（1）構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒時，選用氨芐青霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，目的是 篩選出含目的基因（N蛋白胞外段基因）的病毒包裝細(xì)胞 。用脂質(zhì)體將重組慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞，質(zhì)粒被包在脂質(zhì)體 雙分子層中 （填“雙分子層中”或“兩層磷脂分子之間”）。
（2）質(zhì)粒在包裝細(xì)胞內(nèi)組裝出由 N蛋白胞外段基因重組慢病毒質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和蛋白質(zhì)外殼 組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細(xì)胞進而表達并分離、純化N蛋白胞外段。
解析 （1）構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒時，選用氨芐青霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，將病毒包裝細(xì)胞置于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可以將含有目的基因（N蛋白胞外段基因）的病毒包裝細(xì)胞篩選出來。用脂質(zhì)體將重組慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞，質(zhì)粒被包在脂質(zhì)體的雙分子層中。（2）質(zhì)粒在包裝細(xì)胞內(nèi)組裝出由N蛋白胞外段基因重組慢病毒質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和蛋白質(zhì)外殼組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細(xì)胞進而表達并分離、純化N蛋白胞外段。
學(xué)生用書·練習(xí)幫P529
一、選擇題
1.[2024哈爾濱九中模擬]限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（ A ）
A.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
B.DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端
D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來，所以也能剪切自身的DNA
解析 限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能切割，A正確；DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，B錯誤；E.cli DNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端，C錯誤；限制酶主要從原核生物中分離純化而來，但是因為原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D錯誤。
2.[2024重慶南開中學(xué)模擬]常見的啟動子可分為三類：組成型啟動子，驅(qū)動基因在所有細(xì)胞、組織和器官中持續(xù)表達；組織特異性啟動子，調(diào)控基因只在某些特定的部位中表達；誘導(dǎo)型啟動子，通常在光、鹽等信號作用下，使目的基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高。下列敘述錯誤的是（ B ）
A.啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游
B.細(xì)胞分化與組織特異性啟動子的調(diào)控有關(guān)，與組成型啟動子無關(guān)
C.乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建需要將組織特異性啟動子與目的基因連接
D.鹽誘導(dǎo)型啟動子在高鹽環(huán)境中被激活，可增加農(nóng)作物的抗逆性
解析 啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因上游，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能夠啟動轉(zhuǎn)錄，A正確；根據(jù)題干信息“組成型啟動子，驅(qū)動基因在所有細(xì)胞、組織和器官中持續(xù)表達”可知，細(xì)胞分化與組成型啟動子有關(guān)，B錯誤；組織特異性啟動子，調(diào)控基因只在某些特定的部位中表達，據(jù)此推知，乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建需要將組織特異性啟動子與目的基因連接，保證目的基因在乳腺細(xì)胞中表達，C正確；根據(jù)題干信息“誘導(dǎo)型啟動子，通常在光、鹽等信號作用下，使目的基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高”可知，鹽誘導(dǎo)型啟動子在高鹽環(huán)境中被激活，可增加農(nóng)作物的抗逆性，D正確。
3.[2023武漢武昌區(qū)質(zhì)檢]關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列敘述正確的是（ B ）
A.實驗中用95％的酒精預(yù)冷后可以更好地溶解DNA
B.將粗提物溶于NaCl后，加入二苯胺試劑，混合均勻后，沸水浴鑒定
C.將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，棄去上清液
D.還可選用新鮮菜花、香蕉或豬肝、豬血等作為本實驗的材料
解析 DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可初步將DNA與蛋白質(zhì)分離，A錯誤；鑒定DNA時，將粗提物溶于NaCl，并與二苯胺試劑混合后進行沸水浴，觀察顏色變化，B正確；將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，棄去沉淀物，收集上清液，C錯誤；哺乳動物成熟紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器，因此豬血不可用于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，D錯誤。
4.[2024福州一測]下列關(guān)于凝膠電泳實驗操作，敘述錯誤的是（ B ）
A.加樣孔應(yīng)靠近負(fù)極端，以便帶負(fù)電的DNA分子向正極移動
B.接通電源后電泳一段時間，離加樣孔越近的DNA分子越小
C.紫外燈照射下，凝膠上條帶的熒光強度與DNA含量呈正相關(guān)
D.通過觀察指示劑在凝膠中遷移的位置來判斷何時停止電泳
解析 脫氧核苷酸是組成DNA分子的單體，其中的磷酸基團能解離出氫離子，使DNA分子帶負(fù)電，加樣孔靠近負(fù)極端，有利于DNA分子向正極移動，A正確。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，DNA分子越小，其在凝膠中的遷移速率越快，電泳一段時間后，離加樣孔越遠(yuǎn)，B錯誤。DNA含量越高，在紫外燈照射下，凝膠上條帶的熒光強度就越強，C正確。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳，D正確。
5.[2023北京東城區(qū)二模]下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，正確的是（ B ）
A.PCR反應(yīng)體系中需要添加耐高溫的解旋酶和DNA聚合酶
B.PCR過程中在引物的3'端添加脫氧核苷酸實現(xiàn)子鏈延伸
C.利用PCR對目的基因進行擴增時需要基因序列全部已知
D.在設(shè)計兩種引物時，需要讓引物和引物之間的堿基序列互補
解析 PCR反應(yīng)體系中需要添加耐高溫的DNA聚合酶，不需要添加解旋酶，A錯誤；合成子鏈時，引物先與模板鏈配對結(jié)合，然后在引物的3'端進行子鏈延伸，B正確；利用PCR對目的基因進行擴增時，知道目的基因兩端的一小段序列即可，C錯誤；在設(shè)計兩種引物時，兩種引物之間的堿基序列不能互補配對，D錯誤。
6.[2024浙江大聯(lián)考]用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切割后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體（重組質(zhì)粒），并導(dǎo)入受體菌中。根據(jù)題目所提供的信息，下列敘述正確的是（ A ）
A.質(zhì)粒用限制酶HindⅢ切割后含有2個游離的磷酸基團
B.若用限制酶HindⅢ和ScaⅠ切割，一定可防止目的基因與質(zhì)粒的反向連接
C.若用限制酶PvuⅠ切割，在含四環(huán)素培養(yǎng)基中形成的菌落，一定含有目的基因
D.若用限制酶SphⅠ切割，篩選時應(yīng)先將轉(zhuǎn)化處理的菌液涂布到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，待長成菌落，再影印接種到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中
解析 題圖質(zhì)粒中限制酶Hind Ⅲ的切割位點有1個，用該限制酶切割質(zhì)粒，獲得1個DNA片段，其含有2個游離的磷酸基團，A正確。由于題圖質(zhì)粒中限制酶Sca Ⅰ的切割位點有兩個，若用限制酶Hind Ⅲ和Sca Ⅰ進行切割，不一定能防止目的基因和質(zhì)粒的反向連接，B錯誤。由題圖可知，氨芐青霉素抗性基因中含有限制酶Pvu Ⅰ的切割位點，若用限制酶Pvu Ⅰ切割質(zhì)粒，則氨芐青霉素抗性基因會被破壞，而四環(huán)素抗性基因正常，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中，導(dǎo)入重組質(zhì)粒（含目的基因）或空質(zhì)粒的受體菌均能形成菌落，C錯誤。由題圖可知，四環(huán)素抗性基因中含有限制酶Sph Ⅰ的切割位點，若用限制酶Sph Ⅰ切割質(zhì)粒，則會破壞四環(huán)素抗性基因，而氨芐青霉素抗性基因正常，進行篩選時，可先將轉(zhuǎn)化處理的菌液涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，待長成菌落（導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌和導(dǎo)入空質(zhì)粒的受體菌都能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中形成菌落），再影印接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長的受體菌即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌，D錯誤。
7.楊樹被根瘤農(nóng)桿菌感染后會長出瘤狀物，稱為冠癭瘤。冠癭瘤內(nèi)的冠癭堿是一種含氮有機物，這種有機物是根瘤農(nóng)桿菌生存所需的碳源和氮源。冠癭瘤的形成是由于根瘤農(nóng)桿菌攜帶天然的Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖所示。下列說法錯誤的是（ C ）
A.Ti質(zhì)粒上的生長素基因可在楊樹生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用
B.Ti質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)域至少含有一個限制酶的切割位點
C.冠癭堿合成基因在根瘤農(nóng)桿菌細(xì)胞中表達并分泌到細(xì)胞外
D.根瘤農(nóng)桿菌內(nèi)Ti質(zhì)粒的存在決定了其感染植物的范圍
解析 Ti質(zhì)粒上的生長素基因可隨T-DNA整合到楊樹細(xì)胞的染色體DNA上，并進行表達，故Ti質(zhì)粒上的生長素基因可在楊樹生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，A正確；Ti質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)域至少含有一個限制酶的切割位點，以便插入目的基因，B正確；冠癭堿合成基因會隨T-DNA整合到楊樹細(xì)胞的染色體DNA上，并在楊樹細(xì)胞中表達，C錯誤；根瘤農(nóng)桿菌內(nèi)Ti質(zhì)粒的存在決定了其能感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力，D正確。
二、非選擇題
8.[寫出實驗思路/2024貴陽模擬，12分]研究發(fā)現(xiàn)作物M的品系甲有抗蟲等多種優(yōu)良性狀，但甜度不高。為了改良品系甲，增加其甜度，育種工作者做了如下實驗：從品系乙中提取與甜度有關(guān)的S基因，通過基因重組技術(shù)，以Ti質(zhì)粒為載體，以品系甲的葉片細(xì)胞為受體細(xì)胞，培育出轉(zhuǎn)S基因的新品系?；卮鹣铝袉栴}。
（1）利用PCR技術(shù)從品系乙的基因組中獲取S基因時，需要在一定的緩沖液中進行，除需提供引物、原料外，還需提供的物質(zhì)有 耐高溫的DNA聚合酶、DNA模板 ，用于獲取S基因的引物需滿足的條件是 能與S基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸 ，在利用PCR技術(shù)獲取目的基因的過程中，4種脫氧核苷酸加在引物的 3' （填“3'”或“5'”）端。
（2）如圖是S基因和載體上的限制酶的酶切位點。為了成功構(gòu)建基因表達載體，確保目的基因插入載體的方向正確，最好選用限制酶 Xba Ⅰ、Hind Ⅲ 切割S基因和載體；由圖可知，構(gòu)建基因表達載體時，S基因須插在T-DNA上，T-DNA的作用是 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上 。
（3）若要通過實驗檢測S基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。
從轉(zhuǎn)基因植株相應(yīng)細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，使用相應(yīng)的抗體進行抗原—抗體雜交，檢測是否表達出S蛋白。
解析 （1）利用PCR技術(shù)擴增S基因時，需要有引物、4種脫氧核苷酸（原料）、耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）、DNA模板等。用于獲取S基因的引物需滿足的條件是能與S基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸。PCR擴增的原理是DNA雙鏈復(fù)制，PCR過程中，4種脫氧核苷酸加在引物的3'端。（2）據(jù)圖分析，S基因上含有限制酶BamHⅠ的酶切位點，而限制酶Sal Ⅰ的酶切位點在T-DNA以外的區(qū)域，因此在構(gòu)建基因表達載體時，以上兩種限制酶均不能用。S基因上下游均有限制酶EcR Ⅰ的酶切位點，若使用該限制酶切割S基因和載體，則易導(dǎo)致目的基因、載體自身環(huán)化以及目的基因反向連接，因此最好選用限制酶Xba Ⅰ、Hind Ⅲ切割S基因和載體。構(gòu)建基因表達載體時，S基因（目的基因）必須插在T-DNA上，因為T-DNA可將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。（3）若要通過實驗檢測S基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中表達出目的蛋白，可采用抗原—抗體雜交技術(shù)進行檢測，實驗思路：從轉(zhuǎn)基因植株相應(yīng)細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，使用相應(yīng)的抗體進行抗原—抗體雜交，檢測是否表達出S蛋白。
9.[2023昆明質(zhì)檢，15分]如圖為“乙肝基因工程疫苗”生產(chǎn)過程圖解，質(zhì)粒上箭頭所指部位為相應(yīng)的限制酶的切割位點。質(zhì)粒中LacZ基因編碼產(chǎn)生的酶可以分解培養(yǎng)基中的X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；否則菌落為白色。
回答下列問題。
（1）過程①選用限制酶的最佳方案是 B 。
A.EcR Ⅴ和EcR Ⅰ B.BamH Ⅰ和EcR Ⅰ
C.EcR Ⅴ和BamH Ⅰ D.只有BamH Ⅰ
（2）構(gòu)建基因表達載體時，一般將目的基因插在啟動子和終止子之間。啟動子的作用是 RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 。
（3）為了篩選含目的基因表達載體的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中額外加入 青霉素 和 X-gal ，培養(yǎng)一段時間后挑選出 白色 （填“藍(lán)色”或“白色”）的菌落進一步培養(yǎng)，從而獲得大量目的菌。實驗室中通過發(fā)酵工程可以對目的菌進行擴大培養(yǎng)，一般選用 液體 （填“液體”或“固體”）培養(yǎng)基，理由是 大腸桿菌能與液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣充分接觸，有利于其大量繁殖 。
（4）目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，常用 抗原—抗體雜交 技術(shù)檢測目的基因是否翻譯出乙肝病毒外殼蛋白。
解析 （1）若選擇EcR Ⅴ，會破壞青霉素抗性基因和目的基因，影響篩選，結(jié)合題圖可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時選用限制酶的最佳方案是BamH Ⅰ和EcR Ⅰ，故選B。（2）構(gòu)建基因表達載體時，一般將目的基因插在啟動子和終止子之間。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。（3）轉(zhuǎn)基因成功的大腸桿菌內(nèi)含有青霉素抗性基因，且LacZ基因被破壞，因此需要在培養(yǎng)基中加入青霉素和X-gal。LacZ基因被破壞，不能分解X-gal，則菌落呈白色，有青霉素抗性基因，則大腸桿菌在含青霉素的培養(yǎng)基中能存活，因此若出現(xiàn)白色菌落，則說明基因表達載體成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌。實驗室中通過發(fā)酵工程可以對目的菌進行擴大培養(yǎng)，一般選用液體培養(yǎng)基，這樣大腸桿菌能與液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣充分接觸，有利于其大量繁殖。（4）目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)可用抗原—抗體雜交技術(shù)。
一、選擇題
10.[2024武漢部分學(xué)校調(diào)研]如圖是蛋白質(zhì)工程中改造目的基因的一種技術(shù)路線。S1核酸酶可以去除雙鏈DNA突出的單鏈區(qū)；外切核酸酶Ⅲ只能從DNA雙鏈的3'末端逐個水解核苷酸，產(chǎn)生不同長度的5'突出末端。下列敘述錯誤的是（ B ）
A.步驟一需使用兩種限制酶切割目的基因片段M
B.步驟二、三分別使用了S1核酸酶、外切核酸酶Ⅲ
C.步驟四宜選用T4 DNA連接酶處理DNA片段
D.質(zhì)粒載體2中目的基因片段N的長度可有多種
解析 經(jīng)步驟一處理后，得到的目的基因片段一端是平末端，一端是黏性末端，則步驟一需使用兩種限制酶切割目的基因片段M，A正確。經(jīng)步驟二處理（用酶a處理）后，又增加了一個新的黏性末端，經(jīng)步驟三處理（用酶b處理）后，黏性末端全部消失，又知S1核酸酶可以去除雙鏈DNA突出的單鏈區(qū)，外切核酸酶Ⅲ只能從DNA雙鏈的3'末端逐個水解核苷酸，則酶a最可能為外切核酸酶Ⅲ，酶b最可能為S1核酸酶，B錯誤。T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，C正確。由于外切核酸酶Ⅲ只能從DNA雙鏈的3'末端逐個水解單核苷酸，且水解后可以產(chǎn)生不同長度的5'突出末端，所以經(jīng)過酶a、酶b處理后，可以得到多種目的基因片段，D正確。
11.[2024玉林聯(lián)考]白細(xì)胞介素-2（IL-2）是一種免疫調(diào)節(jié)因子，化學(xué)本質(zhì)是糖蛋白?？蒲腥藛T將含IL-2基因的DNA片段和質(zhì)粒pPIC9K（部分結(jié)構(gòu)如圖所示）構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并導(dǎo)入酵母菌GS115（組氨酸缺陷菌株）中，篩選得到了能分泌IL-2的工程菌株。下列有關(guān)敘述錯誤的是（ B ）
A.組氨酸合成基因可作為標(biāo)記基因篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的酵母菌細(xì)胞
B.構(gòu)建重組質(zhì)粒時可選用Avr Ⅱ和Nt Ⅰ切割目的基因和質(zhì)粒pPIC9K
C.RNA聚合酶識別并結(jié)合質(zhì)粒上的啟動子，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄
D.酵母菌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體能對蛋白質(zhì)進行加工修飾
解析 酵母菌GS115是組氨酸缺陷菌株，不能合成組氨酸，導(dǎo)入組氨酸合成基因后就可以合成組氨酸，可以用不含組氨酸的培養(yǎng)基篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的酵母菌GS115，A正確；據(jù)圖可知，為保證目的基因（Avr Ⅱ會破壞目的基因）和啟動子（Sac Ⅰ會破壞啟動子）的完整性，可用EcR Ⅰ和Nt Ⅰ分別切割含有IL-2基因的DNA片段和質(zhì)粒pPIC9K，B錯誤；質(zhì)粒上的啟動子可作為RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄，C正確；酵母菌細(xì)胞是真核細(xì)胞，其含有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體能對蛋白質(zhì)進行加工修飾，D正確。
12.[2023大同檢測]為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花細(xì)胞中。
下列操作與實驗?zāi)康牟环氖牵?C ）
A.用限制性內(nèi)切核酸酶EcRⅠ和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒
B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞
C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞
D.用PCR技術(shù)檢測C基因是否整合到菊花染色體上
解析 根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制酶切割位點可知，用限制性內(nèi)切核酸酶EcR Ⅰ和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒，A不符合題意；將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，即用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞，B不符合題意；圖2中顯示標(biāo)記基因是潮霉素抗性基因，因此可在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞，C符合題意；可采用PCR技術(shù)檢測C基因是否整合到菊花染色體上，D不符合題意。
13.[2023長春模擬]用Xh Ⅰ和Sal Ⅰ 兩種限制酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖1和圖2所示。以下敘述錯誤的是（ C ）
A.圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B.圖2中泳道②的酶切產(chǎn)物說明該限制酶斷開了4個磷酸二酯鍵
C.若用兩種限制酶同時切割該DNA，電泳后泳道中將出現(xiàn)7條條帶
D.圖2泳道①中是用Sal Ⅰ 處理得到的酶切產(chǎn)物
解析 不同的限制酶識別并切割的核苷酸序列不同，圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同，A正確。分析圖1和圖2可知，泳道②是限制酶Xh Ⅰ的酶切產(chǎn)物分離結(jié)果，該DNA片段共有2個該限制酶酶切位點，所以斷開了4個磷酸二酯鍵，B正確。由題圖可知，若用兩種限制酶同時切割該DNA，該DNA的每個酶切位點都會被切開，則將被切成6個片段，如果6個片段分子大小不同則在泳道中出現(xiàn)6條條帶；如果其中有片段分子大小相同，則條帶數(shù)目小于6條，C錯誤。根據(jù)圖2分析泳道①中是用Sal Ⅰ（其有3處切割位點，切割后產(chǎn)生4個DNA片段）處理得到的酶切產(chǎn)物分離結(jié)果，D正確。
14.[2023南京六校調(diào)研]大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物用作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關(guān)敘述正確的是（ D ）
A.兩輪PCR過程中復(fù)性時的溫度一樣
B.單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C.第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR的產(chǎn)物——DNA的兩條鏈
D.利用該技術(shù)將某功能蛋白的結(jié)構(gòu)改變屬于蛋白質(zhì)工程
解析 單核苷酸的定點誘變需進行兩輪PCR反應(yīng)，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴增的大引物，為了使引物與模板鏈準(zhǔn)確配對，第二輪PCR的復(fù)性溫度應(yīng)比第一輪的高，A錯誤；單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；由圖可知，第二輪PCR需加入另一種側(cè)翼引物，C錯誤；蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，利用該技術(shù)將某功能蛋白的結(jié)構(gòu)改變屬于蛋白質(zhì)工程，D正確。
15.[情境創(chuàng)新/2023南通檢測，多選]CAR-T細(xì)胞療法是通過設(shè)計CAR基因，導(dǎo)入癌癥患者的T細(xì)胞中，使其轉(zhuǎn)化為CAR-T細(xì)胞，CAR-T細(xì)胞膜上的CAR蛋白與癌細(xì)胞表面抗原特異結(jié)合后，激活CAR-T細(xì)胞使其增殖、分化，從而實現(xiàn)對癌細(xì)胞的特異性殺傷和記憶，主要過程如圖。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是對腫瘤起識別、抵抗和攻擊作用的細(xì)胞群體。下列說法正確的是（ AD ）
A.胞外結(jié)合區(qū)DNA序列可來自患者自身的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞
B.CAR基因缺少啟動子，無法在T細(xì)胞中復(fù)制，故過程②在導(dǎo)入T細(xì)胞前完成
C.重組分子導(dǎo)入T細(xì)胞后，應(yīng)當(dāng)用PCR技術(shù)檢驗指導(dǎo)CAR合成的基因是否表達成功
D.CAR-T細(xì)胞經(jīng)過程④形成的效應(yīng)細(xì)胞能準(zhǔn)確識別癌細(xì)胞并引發(fā)細(xì)胞凋亡
解析 由題意可知，CAR-T細(xì)胞膜上的CAR蛋白可與癌細(xì)胞表面抗原特異結(jié)合，因此CAR蛋白的胞外結(jié)合區(qū)DNA序列可來自患者自身的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，A正確；啟動子能啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄，CAR基因缺少啟動子，無法在T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，故過程②在導(dǎo)入T細(xì)胞前完成，B錯誤；通過PCR技術(shù)可以檢測目的基因是否成功插入或轉(zhuǎn)錄出mRNA，不能檢驗指導(dǎo)CAR合成的基因是否表達成功，C錯誤；CAR-T細(xì)胞經(jīng)CAR蛋白的作用接受癌細(xì)胞的信息后，會增殖分化成效應(yīng)細(xì)胞進而準(zhǔn)確識別癌細(xì)胞并引發(fā)癌細(xì)胞凋亡，D正確。
二、非選擇題
16.[2024廣東七校第一次聯(lián)考，12分]E蛋白是一種具有特定功能的人體蛋白質(zhì)。某研究小組擬利用乳腺生物反應(yīng)器合成E蛋白，主要過程如圖所示。結(jié)合基因工程和胚胎工程的相關(guān)知識，回答問題。
（1）步驟①過程中需要將E基因和奶牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起，目的是 使E基因能在乳腺細(xì)胞中特異性表達（或讓E基因只在乳腺細(xì)胞中表達） 。步驟②通常采用 顯微注射 法將基因表達載體導(dǎo)入奶牛的 受精卵 。為了提高移植后胚胎的發(fā)育率，通常需要等胚胎發(fā)育到 囊胚 階段才進行步驟④。
（2）在進行步驟④之前，應(yīng)該選取 滋養(yǎng)層 細(xì)胞進行性別鑒定，獲取該細(xì)胞后，通過PCR反應(yīng)擴增SRY基因（Y染色體上特有的性別決定基因）片段，然后對擴增產(chǎn)物進行檢測，將檢測反應(yīng)呈 陰性 （填“陽性”或“陰性”）的胚胎進行胚胎移植。
（3）若要在分子水平上判斷E基因是否翻譯出E蛋白，可從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中提取蛋白質(zhì)，采用 抗原—抗體雜交 技術(shù)進行鑒定。
解析 （1）將目的基因與奶牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起的目的是讓目的基因在乳腺細(xì)胞中特異性表達。將目的基因?qū)胧荏w（奶牛）的常用方法是顯微注射法。欲讓目的基因能夠在奶牛中成功表達，應(yīng)該將重組載體導(dǎo)入奶牛的受精卵中。胚胎發(fā)育到囊胚階段（注：由于本題中需對胚胎進行性別鑒定，胚胎需發(fā)育至囊胚階段。）進行移植可提高移植后胚胎的發(fā)育率。（2）胚胎移植前，應(yīng)選取滋養(yǎng)層細(xì)胞做性別鑒定。Y染色體是雄性個體中存在的染色體，而進行胚胎移植時應(yīng)選擇雌性的胚胎，因此獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞后，通過PCR反應(yīng)擴增SRY基因片段，然后對擴增產(chǎn)物進行檢測，需要選取反應(yīng)呈陰性的胚胎進行移植。（3）可通過抗原—抗體雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中是否含有E蛋白。
17.[角度創(chuàng)新/2024福州一測，15分]甜菜堿是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。馬鈴薯自身不能積累甜菜堿，利用基因工程技術(shù)，可以把與甜菜堿合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因——甜菜堿醛脫氫酶基因（BADH）轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，使其積累甜菜堿，以期達到增強抗逆性的目的。
（1）根據(jù)BADH基因的序列，甲同學(xué)設(shè)計了特異性引物進行PCR擴增以獲取目的基因，他的引物設(shè)計如下（只標(biāo)注了引物的部分堿基序列）
引物1：5'－CAAGACCT－3'
引物2：5'－AGGTCTTA－3'
此引物設(shè)計不合理，請說明理由： 引物1和引物2會因局部發(fā)生堿基互補配對而失效 。
（2）馬鈴薯外植體經(jīng) 脫分化 形成愈傷組織，將其放入成功轉(zhuǎn)入圖1所示表達載體的農(nóng)桿菌菌液中浸泡后，再在培養(yǎng)基中加入 潮霉素 ，從而篩選出 轉(zhuǎn)入BADH基因的馬鈴薯細(xì)胞 。
（3）圖中所示的基因表達載體需含有啟動子，它是 RNA聚合酶 識別并結(jié)合的位點。現(xiàn)有兩種啟動子：組成型啟動子和逆境誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子能夠持續(xù)、高效地啟動目的基因在植物各種組織中表達，因此也會增加物質(zhì)和能量的消耗，阻礙植物的生長發(fā)育。選擇逆境誘導(dǎo)型啟動子（目的基因只有在逆境誘導(dǎo)下才能表達）的優(yōu)點是 避免外源基因持續(xù)大量表達，減少物質(zhì)和能量的消耗 。
（4）為了檢測目的基因是否成功導(dǎo)入，以從馬鈴薯細(xì)胞提取的DNA為模板，PCR擴增 BADH基因 片段，電泳結(jié)果如圖2（1為空白對照組，2、3為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯組）。與3號相比，2號馬鈴薯株系抵抗逆境能力沒有增強，可利用 PCR等 技術(shù)檢測BADH基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。
解析 （1）分析引物1和引物2的序列可知，引物1和引物2可發(fā)生局部堿基互補配對，導(dǎo)致引物失效，故引物設(shè)計不合理。（2）馬鈴薯外植體經(jīng)脫分化可形成愈傷組織。據(jù)圖1可知，T-DNA上含有潮霉素抗性基因，將愈傷組織放入成功轉(zhuǎn)入圖1所示表達載體的農(nóng)桿菌菌液中浸泡后，再在培養(yǎng)基中添加潮霉素，可篩選出轉(zhuǎn)入BADH基因的馬鈴薯細(xì)胞。（3）啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。結(jié)合組成型啟動子和逆境誘導(dǎo)型啟動子的特點可知，逆境誘導(dǎo)型啟動子的優(yōu)點是可避免外源基因持續(xù)大量表達，減少物質(zhì)和能量的消耗。（4）為了檢測目的基因是否成功導(dǎo)入，可通過PCR等技術(shù)檢測馬鈴薯的染色體DNA上是否插入了BADH基因或檢測BADH基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。課標(biāo)要求
核心考點
五年考情
核心素養(yǎng)對接
1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具；
2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟；
3.DNA的提取和鑒定；
4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗
基因工程的基本工具
2023：重慶T12、湖北T4和T22（4）、新課標(biāo)T6；
2022：湖北T24（3）；
2021：湖北T7、全國乙T38
1.科學(xué)思維——建立模型：基因工程的操作流程。分析與綜合：理解基因工程的工具；PCR的原理，推斷PCR反應(yīng)所需的條件；根據(jù)基因表達的過程，推斷目的基因檢測與鑒定的方式。
2.科學(xué)探究——通過DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴增與鑒定的實際操作，培養(yǎng)科學(xué)探究能力
基因工程的基本操作程序
2023：遼寧T8和T25、江蘇T22、天津T17、山東T25、湖南T19（2）、全國乙T38、浙江1月T24（5）；
2022：江蘇T24、全國乙T38、遼寧T12和T24Ⅰ、天津T15；
2021：山東T25、遼寧T24、廣東T22、湖北T16、全國甲T38、天津T16、江蘇T23、福建T21、浙江6月T29（二）（2）；
2020：浙江7月T24和T29（二）（1）（2）、浙江1月T29（二）（2）；
2019：江蘇T33、全國ⅠT38、天津T9
DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴增與鑒定
2023：江蘇T9D、廣東T11；
2022：山東T13；
2021：山東T13；
2020：海南T10；
2019：江蘇T10
命題分析預(yù)測
1.基因工程是高考的重點，常以科研或生產(chǎn)實踐為情境，考查基因工程的基本工具及基本操作程序，也常與核酸的結(jié)構(gòu)、遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)、細(xì)胞工程、胚胎工程等知識相結(jié)合進行綜合考查，多以非選擇題形式呈現(xiàn)，但也可以選擇題的形式呈現(xiàn)。
2.預(yù)計2025年高考試題仍可能延續(xù)往年的考查形式及特點，分層設(shè)置問題，多角度考查基因工程的工具、操作程序等相關(guān)知識，同時原因分析型試題的比例將大大增加
項目
種類
作用底物
作用結(jié)果
限制酶
DNA分子
切開磷酸二酯鍵，形成黏性末端或平末端
DNA連接酶
兩個DNA分子片段
通過形成磷酸二酯鍵，進而形成新的DNA分子
DNA聚合酶
DNA片段、脫氧核苷酸
通過形成磷酸二酯鍵，進而形成新的單鏈DNA分子
DNA酶
[10] DNA分子
斷開磷酸二酯鍵，形成脫氧核苷酸
解旋酶
雙鏈DNA分子
斷開堿基對間的氫鍵，形成單鏈DNA分子
RNA聚合酶
DNA片段、核糖核苷酸
通過形成磷酸二酯鍵，進而形成單鏈RNA分子
類型
PCR
體內(nèi)DNA復(fù)制
時期
人工控制，隨時進行
有絲分裂和減數(shù)分裂前的間期
場所
細(xì)胞外
細(xì)胞內(nèi)
解旋方式
90 ℃以上高溫條件下變性解旋
解旋酶催化
酶
耐高溫的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶等
子鏈合成方式
從兩條引物的3'端開始連續(xù)合成
一條連續(xù)合成，另一條不連續(xù)合成
結(jié)果
擴增DNA片段或基因
合成整個DNA分子
相同點
①都需要DNA模板、引物、能量和一定的溫度條件；②都遵循堿基互補配對原則；③DNA的合成都是從子鏈的5'端向3'端延伸
項目
本質(zhì)
位置
功能
啟動子
DNA片段
目的基因上游
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
終止子
DNA片段
目的基因下游
使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來
起始密碼子
mRNA上三個
相鄰的堿基
mRNA首端
翻譯的起始信號（編碼氨基酸）
終止密碼子
mRNA上三個
相鄰的堿基
mRNA尾端
翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）

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