(1)圖1中,過程①指的是從擬南芥中提取RNA,經(jīng) 催化,合成cDNA;過程②指的是以cDNA為模板,通過PCR擴增目的基因,需要在引物的 端,加入限制酶 、 的識別序列。
(2)構建表達載體時,將PCR產(chǎn)物與質粒分別雙酶切后,先進行瓊脂糖凝膠電泳,將目標片段與無關片段分離,從瓊脂糖凝膠中只回收目標片段,再用DNA連接酶進行連接,以避免 。
(3)將轉化后得到的單克隆農(nóng)桿菌進行PCR鑒定,結果如圖3所示,根據(jù)此結果,科研人員欲選擇1、2號菌進行測序,原因是 。
(4)將擬南芥的 直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間,然后培養(yǎng)植株,將得到的種子接種在含有 (填抗生素名稱)的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),以篩選出成功導入目的基因的陽性植株。
(5)提取轉基因及野生型植株的蛋白質進行電泳檢測,結果如圖4所示。若其中 號為轉基因植株的蛋白質電泳結果,則說明成功構建超量表達A的擬南芥轉基因株系。
答案(1)逆轉錄酶 5' BamHⅠ SalⅠ
(2)目標片段與無關片段重新連接(目的基因自連以及質粒自連)
(3)1、2號菌的PCR產(chǎn)物長度與基因A基本相符,但無法確定PCR產(chǎn)物的堿基序列是否與基因A相同
(4)花序 潮霉素
(5)①
解析(1)圖1中,過程①是以RNA為模板,經(jīng)逆轉錄酶催化,合成cDNA的過程;子鏈沿著引物3'端延伸形成目的基因,限制酶的識別序列應該加在引物的5'端,即在目的基因的外側。KpnⅠ會破壞目的基因,Hind Ⅲ會破壞卡那霉素抗性基因,因此選擇BamHⅠ、SalⅠ兩種限制酶。(2)將PCR產(chǎn)物與質粒分別雙酶切,使目的基因及剪切后的質粒兩端黏性末端不同,這樣可避免目的基因自連以及質粒自連;只回收目標片段,再用DNA連接酶進行連接,以避免目標片段與無關片段重新連接。(3)圖3的結果顯示1、2號菌含與目的基因長度相同的DNA片段,但1、2號菌是不是目的基因,還要進行堿基序列的檢測。(4)將擬南芥的花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間,可以形成農(nóng)桿菌轉化的擬南芥種子。T-DNA上的標記基因是潮霉素抗性基因,因此需將得到的種子接種在含有潮霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),以篩選出成功導入目的基因的陽性植株。(5)圖4的①號目的蛋白條帶寬,說明其目的基因表達量高,若①號為轉基因植株的蛋白質電泳結果,②號為野生型植株的蛋白質電泳結果,則說明成功構建了超量表達A的擬南芥轉基因株系。
2.(2024·天津二模)(13分)磷脂酸(PA)是調節(jié)植物生長發(fā)育和逆境響應的重要信使物質。為了解植物細胞中PA的動態(tài)變化,研究人員用無縫克隆技術將高度專一的PA結合蛋白(PABD)基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合,構建有效監(jiān)測細胞PA變化的熒光探針,并測定擬南芥細胞內PA含量。無縫克隆技術連接DNA片段的機理和構建熒光探針表達載體的過程如圖所示,請回答下列問題。
注:bar為草胺膦抗性基因;Kanr為卡那霉素抗性基因。
(1)無縫克隆時,T5核酸外切酶(從核苷酸鏈的外側向內側剪切核苷酸)沿 (填“5'→3'”或“3'→5'”)的方向水解DNA,其目的是形成 。T5核酸外切酶催化的最適溫度為37 ℃,而過程①選擇的溫度為50 ℃,目的是 ,防止過度水解DNA。
(2)過程②兩個片段復性后存在“缺口”的原因是 ,過程③所需的酶有 。
(3)與傳統(tǒng)的酶切再連法相比,無縫克隆技術構建重組質粒的優(yōu)點有 (多選)。
A.不受限制酶酶切位點的限制
B.不需要使用PCR技術擴增目的基因
C.不會出現(xiàn)目的基因的反向連接和自身環(huán)化
(4)PCR擴增GFP基因時需依據(jù) 的部分核苷酸序列設計引物R2。已知引物F1的堿基序列是5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3',據(jù)圖分析,擴增目的片段的所用的引物R2可對應下表中的 (填序號)。
(5)利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉化擬南芥,將獲得的種子進行表面消毒,均勻鋪在含有 的培養(yǎng)基上進行篩選和鑒定,將篩選得到的種子種植可得到轉基因擬南芥,通過觀測轉基因擬南芥根尖細胞中 ,了解PA的分布和含量。
答案(1)5'→3' 黏性末端 降低酶活性
(2)過程①形成的黏性末端大于互補配對的區(qū)段(同源序列) DNA聚合酶和DNA連接酶
(3)AC
(4)PABD基因和GFP基因 ③
(5)草胺膦 綠色熒光點的分布
解析(1)由圖可知,無縫克隆時,過程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA,以形成黏性末端。溫度能影響酶活性,T5核酸外切酶催化的最適溫度為37 ℃,而過程①選擇的溫度為50 ℃,目的是降低酶活性,防止過度水解DNA。(2)過程②在復性的過程中,兩個片段的黏性末端可根據(jù)互補序列進行配對結合,但由于過程①形成的黏性末端大于互補配對的區(qū)段(同源序列),因此過程②兩個片段復性后存在“缺口”。過程③缺口處DNA鏈的補齊,可以看作DNA分子的復制過程,所需的酶有DNA聚合酶(將游離的單個脫氧核苷酸加到子鏈3'末端)和DNA連接酶(將兩個DNA片段進行連接)。(3)傳統(tǒng)的酶切再連法需要用特定的限制酶將目的基因和質粒先進行切割,再用DNA連接酶對目的基因和質粒進行連接,在該過程會形成多個小片段,操作復雜,而無縫克隆技術構建重組質粒不受限制酶酶切位點的限制,不會引入多余堿基,不會出現(xiàn)移碼突變,不會出現(xiàn)目的基因的反向連接和自身環(huán)化,操作時間短,成功率高,但該過程也需要利用PCR技術擴增目的基因,故選A、C。(4)用于PCR擴增的引物是根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列來設計的,由重組DNA圖可知,GFP基因和PABD基因進行連接,因此PCR擴增GFP基因時需根據(jù)GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列設計引物R2,而設計引物F1僅需根據(jù)PABD基因一端的核苷酸序列,由于PCR擴增GFP基因時需根據(jù)GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2,即引物R2的一部分能與引物F1進行堿基互補配對,觀察表中①②③的引物堿基序列可知,③的5'端部分堿基序列與F1的5'端部分堿基序列互補,因此可知,R2可對應于表中的③。(5)由圖可知,bar(草胺膦抗性基因)為標記基因,位于T-DNA上,農(nóng)桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞,并且整合到受體細胞染色體的DNA上,因此利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉化擬南芥,將獲得的種子進行表面消毒,均勻鋪在含有草胺膦的培養(yǎng)基上進行篩選和鑒定。由題意“將高度專一的PA結合蛋白(PABD)基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合,構建有效監(jiān)測細胞PA變化的熒光探針,并測定擬南芥細胞內PA含量”可知,通過觀測轉基因擬南芥根尖細胞中綠色熒光點的分布,了解PA的分布和含量。
①
5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCG-3'
②
5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGACA-3'
③
5'-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATAA-3'

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