1.下列有關(guān)目的基因的篩選與獲取的敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A．目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因
B．篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步
C．來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因
D．從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是獲取目的基因較為有效的方法之一
2．有關(guān)PCR技術(shù)的說法，正確的是（ ）
A．PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制
B．PCR擴(kuò)增中必須有解旋酶才能解開DNA雙鏈
C．PCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴(kuò)增
D．PCR反應(yīng)中兩種引物的堿基間應(yīng)互補(bǔ)以保證與模板鏈的正常結(jié)合
3．下列屬于PCR技術(shù)的條件的是（ ）
①單鏈的脫氧核苷酸序列引物 ②目的基因所在的DNA片段 ③脫氧核苷酸 ④核糖核苷酸 ⑤DNA連接酶 ⑥耐高溫的DNA聚合酶
⑦DNA限制酶
A．①②③⑤B．①②③⑥
C．①②③⑤⑦D．①②④⑤⑦
4．關(guān)于PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較，下列敘述正確的是（ ）
A．兩者所用的酶相同
B．兩者都可以在儀器中自動(dòng)完成
C．兩者都需要ATP提供能量
D．兩者都依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
5.構(gòu)建基因表達(dá)載體的四個(gè)基本組件是（ ）
A．復(fù)制原點(diǎn)、抗生素基因、內(nèi)含子、目的基因
B．目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因
C.目的基因、內(nèi)含子、外顯子、標(biāo)記基因
D．熒光基因、復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、抗生素基因
6．基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子的作用是（ ）
A．使目的基因的導(dǎo)入更容易
B．是RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程
C．鑒別受體細(xì)胞是否導(dǎo)入目的基因
D．具有DNA聚合酶的結(jié)合部位，啟動(dòng)復(fù)制過程
7．在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，下列說法正確的是（ ）
①一個(gè)表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子 ②有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止
④所有基因表達(dá)載體的構(gòu)建是完全相同的
A．②③B．①④
C．①②D．③④
8．關(guān)于啟動(dòng)子、終止子及密碼子的敘述，正確的是（ ）
A．啟動(dòng)子和終止子位于DNA上，分別啟動(dòng)和終止DNA的復(fù)制
B．起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別啟動(dòng)和終止翻譯
C．起始密碼子和終止密碼子分別轉(zhuǎn)錄自啟動(dòng)子和終止子
D．mRNA上有多少種密碼子，tRNA上就有多少種反密碼子
9．基因工程的核心是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，下列不屬于基因表達(dá)載體作用的是（ ）
A．防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”
B．能協(xié)助目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制
C．含有啟動(dòng)子和終止子協(xié)助目的基因表達(dá)
D．具有標(biāo)記基因，便于篩選重組受體細(xì)胞
10．[2023·新疆兵團(tuán)二中?？糫關(guān)于基因表達(dá)載體的相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A．目的基因與載體結(jié)合可能涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
B．具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，以便目的基因的插入
C．終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使翻譯在所需要的地方停下來
D．啟動(dòng)子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位
11.基因工程中常用細(xì)菌等原核生物作受體細(xì)胞的原因不包括（ ）
A．繁殖速度快
B．遺傳物質(zhì)相對(duì)較少
C．多為單細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便
D．DNA為單鏈，變異少
12．受體細(xì)胞不同，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不相同，下列受體細(xì)胞與導(dǎo)入方法匹配錯(cuò)誤的是（ ）
13.在基因工程操作技術(shù)中，為保證目的基因更好地導(dǎo)入受體細(xì)胞，有時(shí)需要用Ca2＋處理。下列有關(guān)敘述，正確的是（ ）
A．顯微注射法中要用Ca2＋處理動(dòng)物受精卵
B．花粉管通道法中要用Ca2＋處理植物體細(xì)胞
C．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中要用Ca2＋處理植物細(xì)胞
D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌細(xì)胞
14．下列有關(guān)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的說法中，正確的是（ ）
A．大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí)通常需要使用鈉離子處理
B.通過顯微注射法可將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中
C．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并在受體細(xì)胞維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化
D．可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)雱?dòng)物受精卵中
15.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物是否成功轉(zhuǎn)錄出mRNA，應(yīng)通過何種分子雜交方法實(shí)現(xiàn)（ ）
A．DNA分子雜交
B．DNA和mRNA之間分子雜交
C．mRNA和蛋白質(zhì)之間分子雜交
D．抗原—抗體分子雜交
16．檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否培育成功的一步是（ ）
A．目的基因的篩選與獲取
B．基因表達(dá)載體的構(gòu)建
C．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
D．目的基因的檢測(cè)與鑒定
17．棉花產(chǎn)業(yè)在我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有舉足輕重的地位，為了抵抗蟲害，我國育成了擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，棉田生態(tài)環(huán)境得到改善。在判斷抗蟲基因是否成功轉(zhuǎn)入棉花基因組的方法中，不屬于分子檢測(cè)的是（ ）
A．通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡
B．檢測(cè)目的基因片段與DNA探針能否形成雜交帶
C．檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA與DNA探針能否形成雜交帶
D．檢測(cè)目的基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)能否與特定抗體形成雜交帶
1．[2023·江蘇連云港高中?？糫下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法，錯(cuò)誤的是（ ）
A．PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)
B．PCR技術(shù)的原理是DNA分子半保留復(fù)制
C．復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
D．PCR過程中只需要模板DNA、兩種引物分子、4種脫氧核苷酸
2．[2023·山東青島第十九中學(xué)?？糫利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A．第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16
B．設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連
C．復(fù)性溫度過高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物
D．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列
3．利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法可以將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒是一種天然存在的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。下列關(guān)于Ti質(zhì)粒的敘述正確的是（ ）
A．Ti質(zhì)粒上T－DNA區(qū)段會(huì)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并存在于細(xì)胞質(zhì)中
B．T－DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后不能利用植物體內(nèi)的酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯
C．Ti質(zhì)粒上的T－DNA區(qū)段會(huì)整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上
D．將目的基因與Ti質(zhì)粒整合的過程稱為轉(zhuǎn)化
4．[2023·浙江校聯(lián)考]研究人員利用農(nóng)桿菌將外源基因A導(dǎo)入到水稻細(xì)胞中，然后通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了含有外源基因A的第一代水稻植株。圖為重組Ti質(zhì)粒示意圖。下列敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A．外源基因A必須整合在T－DNA片段內(nèi)
B．培養(yǎng)水稻細(xì)胞時(shí)需添加潮霉素進(jìn)行篩選
C．水稻的組織培養(yǎng)過程中需調(diào)整植物激素的比例
D．第一代水稻植株中存在不含外源基因A的細(xì)胞
5．下列哪一種方法不能用于檢測(cè)目的基因是否成功導(dǎo)入或表達(dá)（ ）
A．在顯微鏡下直接觀察受體細(xì)胞中是否含有目的基因
B．通過PCR等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞的DNA分子上是否含有目的基因
C．提取受體細(xì)胞合成的相應(yīng)蛋白質(zhì)，利用抗原—抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)
D．抗蟲基因?qū)胫参锛?xì)胞后，檢測(cè)植物是否具有抗蟲特性
6．[2023·遼寧錦州高二?？糫（不定項(xiàng)）采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是（ ）
A．將毒素蛋白注射到棉受精卵中
B．將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
C．將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)
D．將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵
7.請(qǐng)回答有關(guān)基因工程的問題：
（1）構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生 末端。
（2）利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)載體含有人胰島素基因及其啟動(dòng)子等，其中啟動(dòng)子的作用是 。在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，常用 處理大腸桿菌，以利于表達(dá)載體進(jìn)入。
（3）為了檢測(cè)胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標(biāo)記的 片段作探針與mRNA雜交。為了檢測(cè)胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成蛋白質(zhì)，常用 技術(shù)。
（4）如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物細(xì)胞，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的 中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細(xì)胞的 上。
8．[2023·安徽安慶模擬預(yù)測(cè)]下圖為“乙肝基因工程疫苗”生產(chǎn)過程圖解，質(zhì)粒上箭頭所指部位為相應(yīng)的限制酶的切割位點(diǎn)。質(zhì)粒中LacZ基因編碼產(chǎn)生的酶可以分解培養(yǎng)基中的X－gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。請(qǐng)回答下列問題：
（1）過程①選用限制酶的最佳方案是 。
A．只有BamHⅠ
B．BamHⅠ和EcRⅠ
C．EcRⅤ和BamHⅠ
D．EcRⅤ和EcRⅠ
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，一般將目的基因插在啟動(dòng)子和終止子之間。啟動(dòng)子的作用是 。
（3）過程②需要先將大腸桿菌用 處理，目的是 。
（4）為了篩選含目的基因表達(dá)載體的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中額外加入 ，培養(yǎng)一段時(shí)間后挑選出 （填“藍(lán)色”或“白色”）的菌落進(jìn)一步培養(yǎng)，從而獲得大量目的菌。
（5）目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，常用 技術(shù)檢測(cè)目的基因是否翻譯出乙肝病毒外殼。
9．[2023·黑龍江牡丹江三中?？糫下圖表示某生物DNA結(jié)構(gòu)的一部分及限制酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)，請(qǐng)回答以下問題
（1）若目的基因?yàn)榭瓜x基因，需要在連接Ti質(zhì)粒前進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要在樣本中再加入 、 和 酶，一般要經(jīng)歷多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 、 三步。擴(kuò)增后切割目的基因，應(yīng)使用表中的限制酶是________________________________________________________________________。
（2）若目的基因?yàn)橐葝u素基因，科研人員構(gòu)建了如圖所示的重組載體，tetr為四環(huán)素抗性基因，ampr為氨芐青霉素抗性基因。
構(gòu)建重組載體需要的酶有 、 。圖中的啟動(dòng)子上有 的識(shí)別和結(jié)合部位，從而驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)后，將其涂布于含 的選擇培養(yǎng)基上。
探究·實(shí)踐 DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
1．如圖表示PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA分子的過程中，DNA聚合酶作用的底物。據(jù)圖分析正確的是（ ）
A．圖中A為引物，是一種單鏈RNA分子
B．圖中B為DNA模板鏈，F(xiàn)端為3′末端
C．PCR技術(shù)中通過控制溫度來實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的解聚和結(jié)合
D．DNA聚合酶無需引物也能將單個(gè)脫氧核苷酸連接成DNA片段
2．[2023·浙江杭州高二?？计谥衇帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。下列關(guān)于電泳的敘述，正確的是（ ）
A．電泳中帶電粒子遷移速率只與所帶電荷有關(guān)
B．電泳的過程要在一定的pH下進(jìn)行，所以要使用緩沖液
C．DNA片段根據(jù)長(zhǎng)度大小在凝膠上分開，形成連續(xù)的條帶
D．切斷電源后即可用肉眼觀察到DNA條帶在凝膠上的位置
3．[2023·河南鄭州校聯(lián)考期中]下列關(guān)于PCR擴(kuò)增DNA片段及電泳鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是（ ）
A．在凝膠中DNA分子的遷移速率主要和DNA分子的大小、構(gòu)象等有關(guān)
B．耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的5′端開始連接脫氧核苷酸
C．作為引物的脫氧核苷酸序列必須不斷的加進(jìn)每一次的擴(kuò)增當(dāng)中
D．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般可通過瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行鑒定
4．[2023·山東濟(jì)寧一中統(tǒng)考一模]基因工程中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。下列關(guān)于PCR及電泳鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是（ ）
A．PCR通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚及模板與引物的結(jié)合
B．PCR反應(yīng)的緩沖液中需同時(shí)添加Mg2＋、引物、DNA模板、TaqDNA聚合酶等
C．因DNA分子在凝膠載樣緩沖液中帶正電荷或負(fù)電荷，可用于電泳
D．將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液需沒過凝膠
5．下列關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是（ ）
A．瓊脂糖凝膠電泳是對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的一種方法
B．制備瓊脂糖凝膠時(shí)，需加入適量的核酸染料
C．電泳結(jié)束后，可通過電子顯微鏡觀察到凝膠中的DNA分子條帶
D．該實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理
6．如圖是PCR擴(kuò)增過程的示意圖，其中敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A．①、②過程均不需要酶的參與
B．PCR的原理是DNA半保留復(fù)制，解聚和復(fù)制不是同時(shí)進(jìn)行的
C．在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)的類似
D．該過程需要設(shè)計(jì)兩種特異性的引物，要求這兩種引物的序列互補(bǔ)
7．PCR產(chǎn)物常用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，下列與PCR和瓊脂糖凝膠電泳有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A．利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，不需要知道目的基因的全部堿基序列
B．需將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與內(nèi)含指示劑的電泳緩沖液混合后加樣
C．PCR使用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份并在－20℃儲(chǔ)存，使用前取出并緩慢融化
D．瓊脂糖溶液中加入的核酸染料利于DNA在300nm紫外燈下被檢測(cè)出來
8．[2023·遼寧阜新高二?？计谀（不定項(xiàng)）下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，正確的是（ ）
A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理
B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃儲(chǔ)存
C．將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，放在高溫環(huán)境中迅速融化
D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
9.[2023·黑龍江哈爾濱期末]目前，常用PCR技術(shù)對(duì)病原體進(jìn)行核酸檢測(cè)，該技術(shù)通過放大或復(fù)制人的樣本中存在的遺傳物質(zhì)來發(fā)揮作用。回答下列問題：
（1）PCR技術(shù)是一項(xiàng)根據(jù) 原理，在體外對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
（2）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要進(jìn)行以下操作：①從病人組織樣本中提取DNA；②分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；③采集病人組織樣本；④利用PCR擴(kuò)增DNA片段。若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是_____________________________________________（用數(shù)字序號(hào)表示）。
（3）為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的 應(yīng)該能與病原菌的兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。在反應(yīng)過程中，使用DNA聚合酶能夠從其 端開始連接脫氧核苷酸，快速擴(kuò)增目的基因。
（4）PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、 三步，其中變性的結(jié)果是 。PCR產(chǎn)物常用 鑒定。
10．PCR是利用體內(nèi)DNA復(fù)制的原理，進(jìn)行生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。RT—PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，具體過程如圖所示。
（1）PCR反應(yīng)的基本步驟是 ，過程中主要借助對(duì) 控制，使得化學(xué)反應(yīng)有序高效地進(jìn)行。
（2）科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶只能催化 方向的聚合反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)染色體DNA的復(fù)制過程，有一條子鏈?zhǔn)窍群铣啥痰腄NA片段（稱為岡崎片段），再形成較長(zhǎng)的分子，在PCR過程中無岡崎片段形成的原因是 。
（3）過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、 、 和引物A等。
（4）過程Ⅱ首先要將反應(yīng)體系的溫度升高到95℃，其目的是 。
（5）過程Ⅰ擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上至少需要 個(gè)引物B。
（6）利用RT－PCR技術(shù)獲取的目的基因 （填“能”或“不能”）在物種之間交流；該技術(shù)還可用于對(duì)某些微量RNA病毒的檢測(cè)，可提高檢測(cè)的靈敏度，原因是 。
11．PCR技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，可用于擴(kuò)增目的基因、制作探針、引入定點(diǎn)突變、定量檢測(cè)DNA等。完成下列有關(guān)PCR技術(shù)和相關(guān)應(yīng)用的問題：
（1）PCR技術(shù)可用于基因工程四個(gè)基本步驟中的 和 步驟。
（2）在影響擴(kuò)增反應(yīng)的各種因素中，引物的設(shè)計(jì)最為重要，引物的3′端應(yīng)采用簡(jiǎn)并密碼子較少的氨基酸的對(duì)應(yīng)核苷酸序列，否則會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增的非特異性序列數(shù)量 。
（3）在正常變性和退火之后研究某TaqDNA聚合酶的催化效率，得到了下列表格：
83℃下沒有產(chǎn)物的原因是 。
（4）PCR反應(yīng)后期，由于 等原因，反應(yīng)速率會(huì)降低。
（5）PCR過程中，溫度的控制至關(guān)重要，變性溫度過低會(huì)因?yàn)? ，最終導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。復(fù)性溫度過高則會(huì)因 導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的量 。
（6）不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1∶50～1∶100，在PCR反應(yīng)的最初10～15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物消耗完后，非限制性引物引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。假設(shè)反應(yīng)體系中原來有a個(gè)模板DNA，最初10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA，后20個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈，則需要限制性引物 個(gè)。因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的 不同，可通過 將其分離。
第2節(jié) 基因工程的基本操作程序
必備知識(shí)基礎(chǔ)練
1．答案：A
解析：目的基因主要指編碼蛋白質(zhì)的基因，A錯(cuò)誤；基因工程的第一步是目的基因的篩選與獲取，B正確；來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因，使其具有抗蟲性狀，C正確；基因結(jié)構(gòu)已知且功能清晰，因此能進(jìn)行較為有效的篩選，從而獲得所需要的基因，D正確。
2．答案：A
解析：PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制，A正確；PCR擴(kuò)增中通過高溫條件解開DNA雙鏈，不需要解旋酶，B錯(cuò)誤；PCR技術(shù)中以脫氧核糖核苷酸為原料，擴(kuò)增DNA，且以指數(shù)方式擴(kuò)增，C錯(cuò)誤；PCR反應(yīng)中兩種引物的堿基間應(yīng)該不能互補(bǔ)配對(duì)，否則無法保證與模板鏈的正常結(jié)合，D錯(cuò)誤。
3．答案：B
解析：PCR需要一對(duì)引物，即一對(duì)單鏈的脫氧核苷酸序列引物，①正確；PCR需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正確；PCR需要脫氧核苷酸作為原料，③正確；核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④錯(cuò)誤；采用PCR合成DNA時(shí)，不需要DNA連接酶，但需要耐高溫的DNA聚合酶，⑤錯(cuò)誤，⑥正確；體外合成DNA時(shí)，不需要限制酶，⑦錯(cuò)誤。因此，A、C、D錯(cuò)誤，B正確。
4．答案：D
解析：DNA復(fù)制過程中需要解旋酶和DNA聚合酶，PCR需要耐高溫的DNA聚合酶，因此兩者所用的酶不同，A錯(cuò)誤；PCR可以在儀器中完成，而體內(nèi)DNA復(fù)制必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，B錯(cuò)誤；細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，ATP提供能量，PCR過程中不需要ATP提供能量，C錯(cuò)誤；兩者均以DNA的兩條鏈為模板，4種游離的脫氧核苷酸為原料，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成子鏈，D正確。
5．答案：B
解析：基因表達(dá)載體的組成：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋標(biāo)記基因。啟動(dòng)子在基因的首段，它是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，能控制著轉(zhuǎn)錄的開始。終止子在基因的尾端，它控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束。B正確。
6．答案：B
解析：?jiǎn)?dòng)子在基因表達(dá)載體中位于目的基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，B符合題意。
7．答案：A
解析：一個(gè)表達(dá)載體的組成一般包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因，①錯(cuò)誤；啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，②正確；終止子在基因的尾端，控制轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，故終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止，③正確；由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建是不完全相同的，④錯(cuò)誤。
8．答案：B
解析：?jiǎn)?dòng)子、終止子均位于DNA上，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程，A錯(cuò)誤；在基因表達(dá)過程中，起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，調(diào)控基因的翻譯過程，B正確；起始密碼子和終止密碼子都轉(zhuǎn)錄自基因的編碼區(qū)，而啟動(dòng)子和終止子都位于基因的非編碼區(qū)，C錯(cuò)誤；終止密碼子一般不對(duì)應(yīng)反密碼子，D錯(cuò)誤。
9．答案：A
解析：限制酶是從微生物(主要是原核生物)中分離出來的，目的基因所導(dǎo)入的細(xì)胞不含有所使用的限制酶，不會(huì)發(fā)生切割，A錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體中有復(fù)制原點(diǎn)，目的基因會(huì)隨著載體的復(fù)制而復(fù)制，B正確；基因的表達(dá)過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，控制著轉(zhuǎn)錄的開始，而終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，C正確；標(biāo)記基因便于目的基因的鑒定和篩選，D正確。
10．答案：C
解析：目的基因與載體結(jié)合時(shí)其黏性末端之間會(huì)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，A正確；作為載體必須具備的條件之一是具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，以便目的基因能夠與之結(jié)合，B正確；終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，C錯(cuò)誤；啟動(dòng)子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，D正確。
11．答案：D
解析：原核生物繁殖快，可很快獲得大量的轉(zhuǎn)基因生物，A正確；原核生物的遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，這樣減少對(duì)目的基因的干擾，B正確；原核生物多為單細(xì)胞，一般采用Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，C正確；細(xì)菌的遺傳物質(zhì)是DNA，且DNA也是雙鏈的，D錯(cuò)誤。
12．答案：B
解析：花粉管通道法是一種十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的方法，我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的，A正確；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞，常采用Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)，這種方法能使大腸桿菌細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，B錯(cuò)誤；顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正確；大豆屬于雙子葉植物，雙子葉植物和裸子植物常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入目的基因，D正確。
13．答案：D
解析：若將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞，常用感受態(tài)細(xì)胞法，通常采用Ca2＋處理細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞。故農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌細(xì)胞，D正確。
14．答案：C
解析：大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí)通常需要使用鈣離子處理，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，A錯(cuò)誤；目的基因需要和載體結(jié)合后形成重組DNA分子才能注入，B錯(cuò)誤；目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化，C正確；將目的基因?qū)雱?dòng)物受精卵常用顯微注射法，D錯(cuò)誤。
15．答案：B
解析：DNA雜交是檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法，A錯(cuò)誤；DNA—RNA雜交是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的分子雜交方法，B正確；RNA—蛋白質(zhì)雜交方法是不存在的，C錯(cuò)誤；抗原—抗體雜交技術(shù)是檢測(cè)是否翻譯了相應(yīng)的蛋白質(zhì)的方法，D錯(cuò)誤。
16．答案：D
解析：基因工程技術(shù)的基本步驟：目的基因的篩選與獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定，目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)與鑒定才知道，故轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否培育成功的一步是目的基因的檢測(cè)與鑒定，D正確。
17．答案：A
解析：基因表達(dá)的檢測(cè)常采用分子水平檢測(cè)和個(gè)體水平檢測(cè)，分子水平檢測(cè)常包含分子雜交、抗原—抗體雜交。通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡屬于個(gè)體水平檢測(cè)，其它選項(xiàng)均屬于分子水平檢測(cè)。
能力素養(yǎng)綜合練
1．答案：D
解析：根據(jù)PCR技術(shù)的原理與定義可知PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，A正確；PCR技術(shù)的原理是DNA分子半保留復(fù)制，B正確；復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，C正確；PCR過程中需要模板DNA、兩種引物分子、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶，D錯(cuò)誤。
2．答案：A
解析：DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，第四輪循環(huán)即DNA復(fù)制4次，共形成24＝16個(gè)DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個(gè)DNA分子含有引物A或引物B，其余14個(gè)DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率為14/16＝7/8，A錯(cuò)誤；設(shè)計(jì)引物時(shí)，需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連，影響引物與目的基因單鏈的結(jié)合，B正確；復(fù)性溫度過高可能導(dǎo)致不能正?；謴?fù)DNA結(jié)構(gòu)，PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，C正確；用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列，只需要知道部分序列，用以合成引物即可，D正確。
3．答案：C
解析：Ti質(zhì)粒上T－DNA區(qū)段會(huì)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體DNA上，并存在于細(xì)胞核中，A錯(cuò)誤；T－DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，能利用植物體內(nèi)的酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，B錯(cuò)誤；Ti質(zhì)粒上T－DNA區(qū)段可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，C正確；T－DNA上的目的基因與受體細(xì)胞的染色體整合的過程稱為轉(zhuǎn)化，D錯(cuò)誤。
4．答案：B
解析：Ti質(zhì)粒的T－DNA片段可以整合在受體細(xì)胞的染色體DNA中，故外源基因A必須整合在T－DNA片段內(nèi)，A正確；質(zhì)粒中的潮霉素抗性基因用于篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，故培養(yǎng)水稻細(xì)胞時(shí)不需要添加潮霉素進(jìn)行篩選，B錯(cuò)誤；水稻組織培養(yǎng)過程中需調(diào)節(jié)植物激素的種類和比例，以保證愈傷組織再分化并得到完整的植株，C正確；第一代水稻植株進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體分離，產(chǎn)生的配子細(xì)胞可能不含有外源基因A，D正確。
5．答案：A
解析：在顯微鏡下無法觀察到基因，因此該方法不能用于檢測(cè)目的基因是否成功導(dǎo)入，A符合題意；通過PCR等技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因或檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，B不符合題意；利用抗原—抗體雜交技術(shù)可以檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，C不符合題意；轉(zhuǎn)基因棉花是否具有抗蟲特性，是通過檢測(cè)棉花細(xì)胞中是否產(chǎn)生毒蛋白或從個(gè)體水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花是否能抗蟲來確定的，D不符合題意。
6．答案：CD
解析：將毒素蛋白注射到棉受精卵中，子代沒有抗性基因，子代不能夠抗蟲，A錯(cuò)誤；將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中，單獨(dú)將DNA注入細(xì)胞會(huì)被細(xì)胞分解，B錯(cuò)誤；將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)，可獲得抗蟲基因，并能遺傳給子代，C正確；將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵，可獲得抗蟲基因，并能遺傳給子代，D正確。
7．答案：(1)平
(2)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄 Ca2＋
(3)胰島素基因 抗原—抗體雜交
(4)T－DNA 染色體DNA
解析：(1)用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生平末端。(2)啟動(dòng)子是位于基因上游一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。常用Ca2＋處理大腸桿菌，使大腸桿菌處于易于吸收外源DNA的狀態(tài)。(3)檢測(cè)胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用分子雜交技術(shù)，用有標(biāo)記的胰島素基因單鏈做探針，與mRNA雜交。檢測(cè)蛋白質(zhì)常用抗原—抗體雜交技術(shù)。(4)農(nóng)桿菌的T－DNA可以進(jìn)入宿主細(xì)胞后整合到染色體DNA上。
8．答案：(1)B
(2)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄
(3)Ca2＋ 將大腸桿菌變成感受態(tài)細(xì)胞，處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化
(4)X－gal 白色
(5)抗原—抗體雜交
解析：(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的最佳方法是使用雙酶切法處理目的基因和載體，使其產(chǎn)生相同的黏性末端，進(jìn)而通過DNA連接酶構(gòu)建基因表達(dá)載體，選擇限制酶的要求是不能破壞目的基因，故不選擇EcRⅤ，可以選擇BamHⅠ和EcRⅠ處理目的基因和質(zhì)粒，B正確。(2)啟動(dòng)子的作用是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。(3)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，使用鈣離子(Ca2＋)處理，目的是將大腸桿菌變成感受態(tài)細(xì)胞，處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。(4)LacZ基因編碼的酶可使X－gal分解，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因的插入使LacZ基因破壞，不能表達(dá)出相應(yīng)的酶，進(jìn)而不能使培養(yǎng)基中X－gal分解，因此菌落呈現(xiàn)白色。(5)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，常用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否翻譯出乙肝病毒外殼。如果目的基因表達(dá)，就可以檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。
9．答案：(1)引物 脫氧核苷酸(或dNTP) TaqDNA聚合 變性 復(fù)性 延伸 EcRⅠ和SacⅠ
(2)DNA連接酶 限制酶 RNA聚合酶 氨芐青霉素
解析：(1)若目的基因?yàn)榭瓜x基因，需要在連接Ti質(zhì)粒前進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR技術(shù)需要的條件，在樣本中需要再加入引物、脫氧核苷酸(或dNTP)、TaqDNA聚合酶，一般要經(jīng)歷多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性、延伸三步。擴(kuò)增后切割目的基因，根據(jù)限制酶識(shí)別的序列可以看出，應(yīng)使用表中的限制酶EcRⅠ和SacⅠ切割圖中的目的基因，這樣做使目的基因兩端產(chǎn)生了不同的黏性末端，可以在目的基因和質(zhì)粒連接時(shí)，防止目的基因和Ti質(zhì)粒自身環(huán)化，保證Ti質(zhì)粒與目的基因的正確連接。(2)DNA連接酶和限制酶是構(gòu)建重組載體需要的工具酶。圖中的啟動(dòng)子上有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合部位，從而驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，便于基因的正常表達(dá)。由于重組質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因，將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)后，將其涂布于含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，在其上能正常生長(zhǎng)的大腸桿菌是成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌。
探究·實(shí)踐 DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
1．答案：C
解析：圖中A為引物，是一種單鏈DNA分子，A錯(cuò)誤；圖中B為DNA模板鏈，引物與模板鏈3′端堿基互補(bǔ)，F(xiàn)端為5′末端，B錯(cuò)誤；PCR技術(shù)中通過控制溫度來實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的解聚(高溫變性)和結(jié)合(低溫復(fù)性)，C正確；無引物，則DNA聚合酶不能將單個(gè)脫氧核苷酸連接成DNA片段，D錯(cuò)誤。
2．答案：B
解析：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離?？梢?，待測(cè)樣品中各種分子的形狀、大小及帶電性質(zhì)的差異等均會(huì)影響其在電泳中的遷移速度，A錯(cuò)誤；電泳的過程要在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電，故需要使用緩沖液以保持pH的穩(wěn)定，B正確；DNA片段根據(jù)長(zhǎng)度大小在凝膠上分開，形成不連續(xù)的條帶，且每個(gè)條帶包含的DNA片段長(zhǎng)度是相同的，C錯(cuò)誤；DNA條帶在凝膠上的位置需要在紫外燈下進(jìn)行觀察，D錯(cuò)誤。
3．答案：B
解析：DNA分子在凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，一般DNA分子越大，遷移速度越慢，A正確；耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，B錯(cuò)誤；模板鏈只要加入一次，引物片段必須不斷加入，耐高溫的DNA聚合酶、DNA連接酶可以反復(fù)使用，C正確；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，需要進(jìn)行鑒定，一般選用瓊脂糖凝膠電泳，D正確。
4．答案：B
解析：PCR通過控制90℃以上的高溫時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，在50℃左右的溫度下兩條單鏈DNA與引物結(jié)合，A正確；PCR反應(yīng)的緩沖液中需添加Mg2＋，然后依次加入引物、TaqDNA聚合酶、DNA模板，B錯(cuò)誤；DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，C正確；電泳樣液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜，電泳緩沖液太多則電流加大，D正確。
5．答案：C
解析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物需要進(jìn)行鑒定，一般選用瓊脂糖凝膠電泳，A正確；凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結(jié)合，B正確；電泳結(jié)束后，通過染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來，C錯(cuò)誤；該實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，D正確。
6．答案：D
解析：①表示變性過程，該過程解聚DNA分子在高溫條件下進(jìn)行，不需要酶的催化，②是復(fù)性過程，該過程氫鍵形成也不需要酶的催化，A正確；PCR的原理是DNA復(fù)制，PCR操作過程中，先解聚，后復(fù)制，解聚和復(fù)制不是同時(shí)進(jìn)行的，B正確；PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的原理是DNA復(fù)制，因此在該過程中DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，C正確；該過程需要一對(duì)特異性的引物，要求一對(duì)引物的序列是不互補(bǔ)的，否則會(huì)形成引物二聚體，進(jìn)而影響目的基因的擴(kuò)增，D錯(cuò)誤。
7．答案：B
解析：利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，不需要知道目的基因的全部堿基序列，只需要一段已知目的基因的核苷酸序列即可，A正確；加樣時(shí)需要將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與內(nèi)含指示劑的凝膠載樣緩沖液混合，B錯(cuò)誤；PCR緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存，PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖液中穩(wěn)定性較差的成分，同時(shí)保護(hù)酶的活性不被破壞，C正確；凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來，D正確。
8．答案：ABD
解析：為避免外源DNA的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理，A正確；PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃儲(chǔ)存，防止緩沖液性質(zhì)變化，同時(shí)也可防止酶變性失活，B正確；將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化，C錯(cuò)誤；在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，防止污染試劑，D正確。
9．答案：(1)DNA半保留復(fù)制
(2)③①④②
(3)引物 3′
(4)延伸 雙鏈DNA解聚為單鏈 瓊脂糖凝膠電泳
解析：(1)PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，其原理為DNA半保留復(fù)制。(2)利用PCR技術(shù)檢測(cè)病原菌的步驟是：采集病人組織樣本→從病人組織樣本中提取DNA→利用PCR擴(kuò)增DNA片段→分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，即③①④②。(3)PCR反應(yīng)中，所用的引物必須與病原菌DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，與病原菌的兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。根據(jù)DNA復(fù)制的方向可推測(cè)，DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。(4)PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步。其中高溫變性：雙鏈DNA解聚為單鏈；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；中溫延伸：合成子鏈。PCR產(chǎn)物常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
10．答案：(1)變性、復(fù)性、延伸 溫度
(2)5′→3′ 不同于體內(nèi)DNA復(fù)制的邊解旋邊復(fù)制，PCR過程是先解聚后復(fù)制
(3)RNA提取物 逆轉(zhuǎn)錄酶
(4)讓逆轉(zhuǎn)錄酶變性失活、使mRNA—cDNA雜合雙鏈解開
(5)2n－1
(6)能 增加了待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量(或濃度)，便于檢測(cè)
解析：(1)PCR的基本步驟包括變性、復(fù)性和延伸；PCR過程中主要借助對(duì)溫度的控制，使得化學(xué)反應(yīng)有序高效地進(jìn)行。(2)DNA聚合酶只能識(shí)別DNA的3′端，因此催化5′→3′方向的聚合反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)染色體DNA的復(fù)制過程，需要解旋酶、DNA聚合酶，并且還要將岡崎片段形成較長(zhǎng)的分子，因此還需要DNA連接酶。細(xì)胞內(nèi)是邊解旋邊復(fù)制，PCR復(fù)制過程是先完全解聚再復(fù)制，因此在PCR過程中無岡崎片段形成。(3)過程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的過程，表示逆轉(zhuǎn)錄，需要加入緩沖液、原料、RNA提取物、逆轉(zhuǎn)錄酶和引物A等。(4)過程Ⅱ首先要將反應(yīng)體系的溫度升高到95℃，其目的是讓逆轉(zhuǎn)錄酶變性失活、使mRNA—cDNA雜合雙鏈解開，該反應(yīng)體系中所用的TaqDNA聚合酶至少應(yīng)能耐受95℃高溫。(5)過程Ⅱ擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，由圖示可知，如果擴(kuò)增n次，則可以形成2n個(gè)DNA分子，因此需要2n－1個(gè)引物B。(6)不同生物體內(nèi)DNA分子的基本結(jié)構(gòu)相同，且所有的生物共用一套密碼子，因此利用RT—PCR技術(shù)獲取的目的基因能在物種之間交流；該技術(shù)還可用于對(duì)某些微量RNA病毒的檢測(cè)，可提高檢測(cè)的靈敏度，原因是增加了待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量(或濃度)，便于檢測(cè)。
11．答案：(1)目的基因的篩選與獲取 目的基因的檢測(cè)與鑒定 (2)增多 (3)溫度過高，TaqDNA聚合酶失活 (4)酶活性降低、引物和dNTP濃度降低、生成物增多 (5)雙鏈不能充分解聚 引物不能與模板充分結(jié)合配對(duì) 減少
(6)(210－1)a 相對(duì)分子量(堿基數(shù)量 ) 凝膠電泳技術(shù)
解析：(1)基因工程的四個(gè)基本操作步驟是目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定。(2)用簡(jiǎn)并密碼子較少的氨基酸的對(duì)應(yīng)核苷酸序列，則氨基酸的種類會(huì)增多，非特異性減少，反之由于密碼子的簡(jiǎn)并性，會(huì)導(dǎo)致非特異性序列增多。(3)據(jù)表格信息可知：在22～78℃之間，隨著溫度升高，子鏈延伸速率增大，但當(dāng)溫度達(dá)到83℃時(shí)沒有產(chǎn)物，原因可能是溫度過高，TaqDNA聚合酶失活所致。(4)PCR擴(kuò)增需要dNTP等物質(zhì)，但在反應(yīng)后期，隨著反應(yīng)進(jìn)行，由于反應(yīng)物的物質(zhì)濃度降低、酶活性降低、生成物增多等，故反應(yīng)變慢。(5)若變性溫度過低，則DNA雙鏈不能充分解聚，導(dǎo)致模板減少；若變性溫度過高，則會(huì)導(dǎo)致引物不能與模板充分配對(duì)(模板與引物結(jié)合效率低)，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的量減少。(6)若只有一個(gè)模板DNA，則10次循環(huán)后，產(chǎn)生DNA數(shù)量為210，每條DNA為兩條鏈，故10次循環(huán)后的數(shù)量為210＋1，所用引物需減去模板鏈的數(shù)量，則a個(gè)模板DNA擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)后限制性引物數(shù)量＝(211－2)a/2＝(210－1)a。由于雙鏈DNA和單鏈DNA的相對(duì)分子質(zhì)量(堿基數(shù)量)不同，故可用電泳法將其分離。必備知識(shí)基礎(chǔ)練
進(jìn)階訓(xùn)練第一層
知識(shí)點(diǎn)1
目的基因的篩選與獲取
知識(shí)點(diǎn)2
基因表達(dá)載體的構(gòu)建
知識(shí)點(diǎn)3
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
選項(xiàng)
受體細(xì)胞
導(dǎo)入方法
A
棉花細(xì)胞
花粉管通道法
B
大腸桿菌
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
C
羊受精卵
顯微注射技術(shù)
D
大豆細(xì)胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
知識(shí)點(diǎn)4
目的基因的檢測(cè)與鑒定
能力素養(yǎng)綜合練
進(jìn)階訓(xùn)練第二層
限制酶
EcRⅠ
BamHⅠ
HindⅢ
SacⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
G↓AATTC
G↓GATCC
A↓AGCTT
GAGCT↓C
22℃
37℃
55℃
70℃
78℃
83℃
子鏈延伸速率（個(gè)核
苷酸·秒－1·酶分子－1）
0.25
1.5
22
60
250
0

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第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

版本： 人教版 (2019)

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