1.簡述動物細胞培養(yǎng)的基本條件。2.簡述動物細胞培養(yǎng)的基本操作過程。3.闡明干細胞的概念及其在臨床上的應用。4.簡述動物細胞融合的概念。5.闡明動物細胞融合的基本方法。6.闡明單克隆抗體的制備過程及其應用。7.闡明動物體細胞核移植的基本過程。8.客觀分析動物體細胞核移植的應用前景。
1.通過思考與討論,認同動物細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的基礎。2.客觀分析干細胞在臨床上的應用所產生的效益與風險,能夠運用生物學基本概念和原理,對日常生活中與干細胞有關的問題進行分析和判斷。3.認同動物細胞融合技術是制備單克隆抗體的重要技術。4.認同單克隆抗體在臨床上發(fā)揮了重要作用。5.認同動物細胞核移植技術及克隆動物是動物細胞工程的重要方面。6.認同體細胞核移植技術有廣泛的應用前景,理性看待體細胞核移植技術存在的問題。
一、動物細胞培養(yǎng)1.概念從動物體中取出相關的組織,將它分散成單個細胞,然后在適宜的培養(yǎng)條件下,讓這些細胞生長和增殖的技術。2.條件(1)營養(yǎng):合成培養(yǎng)基中有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等。通常需加入血清等天然成分。(2)無菌、無毒的環(huán)境①需要對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行滅菌處理以及在無菌環(huán)境下進行操作。②應定期更換培養(yǎng)液,以便清除代謝物,防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。
(3)溫度、pH和滲透壓:哺乳動物細胞培養(yǎng)的溫度多以(36.5±0.5) ℃為宜。多數動物細胞生存的適宜pH為7.2~7.4。此外,滲透壓也是動物細胞培養(yǎng)過程中需要考慮的重要環(huán)境參數。(4)氣體環(huán)境:動物細胞培養(yǎng)所需氣體主要有O2和CO2。O2是細胞代謝(有氧呼吸)所必需的,CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。在進行細胞培養(yǎng)時,通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶,將其置于含有95%空氣和5% CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。?
二、干細胞培養(yǎng)及其應用1.干細胞(1)功能:一定條件下,干細胞可以分化成其他類型的細胞。(2)分布:存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。
(3)主要種類:包括胚胎干細胞和成體干細胞等。
2.干細胞的應用有著自我更新能力及分化潛能的干細胞,與組織、器官的發(fā)育、再生和修復等密切相關。具體應用如下。(1)造血干細胞的應用:移植到病人體內,恢復病人的造血和免疫功能。(2)神經干細胞的應用:在治療神經組織損傷和神經系統(tǒng)退行性疾病方面有重要的應用價值。
(3)誘導多能干細胞(iPS細胞)的應用①優(yōu)點:誘導過程無需破壞胚胎,iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞,將它移植回病人體內后,理論上可以避免發(fā)生免疫排斥反應。②過程
3.干細胞應用面臨的挑戰(zhàn)(1)胚胎干細胞的獲取涉及倫理問題。 (2)干細胞用于臨床治療還面臨一些問題,如存在導致腫瘤發(fā)生的風險。
【預習檢測】 1.判斷正誤。(1)制備動物細胞懸液時,先用剪刀剪碎肝組織,再用胃蛋白酶處理。(　　)(2)在動物細胞培養(yǎng)過程中,通常在培養(yǎng)液中通入5%的CO2刺激細胞呼吸。(　　)(3)干細胞是指動物(包括人)胚胎中具有多向分化潛能的細胞。(　　)(4)動物細胞培養(yǎng)應定期更換培養(yǎng)液,以便清除代謝物,保證無毒環(huán)境。(　　)(5)胚胎干細胞和成體干細胞都具有分化成完整個體的潛能。(　　)(6)動物細胞培養(yǎng)時細胞要經過脫分化形成愈傷組織。(　　)
(7)動物細胞培養(yǎng)液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清。(　　)(8)動物細胞培養(yǎng)瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理,分瓶后才能繼續(xù)增殖。(　　)
2.從理論上講,任何涉及喪失正常細胞的疾病,都可以通過移植由胚胎干細胞分化而來的特異細胞或組織來治療。下列說法錯誤的是(　　)A.用神經細胞治療帕金森病等B.用胰島細胞治療糖尿病C.用心肌細胞修復壞死的心肌等D.用甲狀腺細胞治療侏儒癥答案:D
3.下列關于胚胎干細胞的說法,正確的是(　　)A.胚胎干細胞存在于成體組織或器官內B.胚胎干細胞具有全能性,屬于全能干細胞C.胚胎干細胞屬于專能干細胞　D.胚胎干細胞最早發(fā)現于20世紀60年代答案:B
4.下列有關動物細胞培養(yǎng)、動物組織培養(yǎng)的敘述,正確的是(　　)A.在動物細胞培養(yǎng)中,含20%CO2的恒溫培養(yǎng)箱的作用是調控pH和溫度B.動物細胞培養(yǎng)過程中一定不會出現組織分化現象C.原代培養(yǎng)的細胞因具有最接近于體內細胞的生長特性,常用于藥物測試研究D.動物細胞培養(yǎng)過程中,首先要用胃蛋白酶處理部分組織以使細胞分散獲得單個細胞答案:C
解析:在動物細胞培養(yǎng)過程中,需要適宜的溫度和一定的pH等環(huán)境,含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱是用來維持培養(yǎng)液的pH和溫度的。在動物組織培養(yǎng)過程中,加入誘導因子后會誘導細胞分化,如胚胎干細胞經培養(yǎng)可分化出各種細胞。動物細胞培養(yǎng)的適宜pH是7.2~7.4,在該條件下胃蛋白酶會失活。在動物細胞培養(yǎng)過程中,應用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理部分組織,使細胞分散成單個細胞。
5.在動物細胞培養(yǎng)過程中,只屬于原代培養(yǎng)過程的是(　　)A.用胰蛋白酶處理獲得單個細胞的過程B.從機體取得細胞并處理后立即進行培養(yǎng)的過程C.出現接觸抑制現象后取下的細胞繼續(xù)培養(yǎng)的過程D.哺乳動物細胞在培養(yǎng)基中懸浮生長的過程答案:B
6.下列關于動物細胞培養(yǎng)的敘述,錯誤的是(　　)A.動物細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的基礎B.用于培養(yǎng)的細胞最好是取自健康動物體內的組織細胞C.將所取的組織先用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理,使其分散成單個細胞,再制成細胞懸液培養(yǎng)D.貼壁生長的細胞由于接觸抑制,會出現停止分裂的現象,懸浮生長的細胞不會出現停止生長的現象答案:D
知識點一　動物細胞培養(yǎng)
1.為什么要將動物組織分散成單個細胞進行培養(yǎng)?提示:(1)保證細胞所需要的營養(yǎng)供應。(2)保證細胞內有害代謝物的及時排出。2.進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞,說明細胞間的物質主要是什么成分?用胃蛋白酶可以嗎?提示:用胰蛋白酶分散細胞,說明細胞間的物質主要是蛋白質。多數動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2~7.4,胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性。而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高,因此胰蛋白酶適宜用于細胞培養(yǎng)時把動物組織分散成單個細胞。
3.動物細胞培養(yǎng)過程需要經過脫分化嗎?提示:動物細胞培養(yǎng)不需經過脫分化過程。4.為什么進行動物細胞培養(yǎng)時通常需加入血清?提示:(1)血清中含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等,其中一些氨基酸是動物細胞本身不能合成的,必須由培養(yǎng)液提供。(2)血清中還含有生長激素和多種細胞生長所需要的特殊營養(yǎng)物質及其他活性物質等,能促進細胞的生長、增殖。
5.如何理解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)?提示:原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)一般均需對細胞用胰蛋白酶進行分散處理,區(qū)分兩種“培養(yǎng)”的關鍵是看用胰蛋白酶處理的對象。(1)用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處理,分散后培養(yǎng),即為原代培養(yǎng)。(2)細胞培養(yǎng)過程中出現接觸抑制,用胰蛋白酶等處理使其從瓶壁上脫離下來,分裝到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),即為傳代培養(yǎng)。
1.植物組織培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)的比較
2.與動物細胞培養(yǎng)有關的兩組概念的辨析(1)細胞貼壁和接觸抑制①體外培養(yǎng)的動物細胞大多數需要貼附于某些基質表面才能增殖。在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)時,這些細胞往往就貼附在培養(yǎng)瓶的瓶壁上,稱為細胞貼壁。②當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖,這種現象稱為細胞的接觸抑制。(2)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)①原代培養(yǎng):細胞懸液第一次在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。②傳代培養(yǎng):進行分瓶后的擴大培養(yǎng)。
3.動物細胞培養(yǎng)中兩次使用胰蛋白酶的作用不同:第一次是使動物組織分散成單個細胞,第二次是使貼壁細胞從瓶壁上脫落下來。4.動物組織要分散成單個細胞培養(yǎng)的原因分散成單個細胞后容易培養(yǎng),細胞所需的營養(yǎng)容易供應,其代謝廢物容易排出;而用大塊組織培養(yǎng)時,內部細胞的營養(yǎng)供應和代謝廢物的排出都較困難。同時,分散成單個細胞培養(yǎng),可使在細胞水平進行操作的其他技術得以實現。5.選取幼齡動物的組織、器官作為材料的原因動物細胞培養(yǎng)時,一般選取幼齡動物的組織、器官,因其細胞的分化程度低,增殖能力強,有絲分裂旺盛,容易培養(yǎng)。
下圖為動物細胞培養(yǎng)的基本過程示意圖。請據圖回答下列問題。
(1)容器A中放置的一般是幼齡動物的器官或組織,原因是其細胞　　　　　　　　,易于培養(yǎng)。培養(yǎng)時先要剪碎,然后用　　　　　　分散細胞,制成B瓶中的細胞懸液。將細胞懸液轉入C瓶中進行的初次培養(yǎng)稱為　　　　。?
(2)在體外培養(yǎng)細胞時,必須保證環(huán)境是無菌、無毒的。需要采取的措施是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。培養(yǎng)過程中還需要提供O2和CO2等氣體環(huán)境,CO2的作用主要是　　　　　　　　　　　。?(3)動物細胞體外培養(yǎng)時,通常要在培養(yǎng)基中補充一定濃度的某些物質。下圖是血清對正常細胞和癌細胞培養(yǎng)影響的實驗結果。據圖可知,培養(yǎng)　　　　細胞一定要添加血清。?
答案:(1)分裂能力強　胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)　原代培養(yǎng)(2)對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行滅菌處理以及在無菌環(huán)境下進行操作,定期更換培養(yǎng)液　維持培養(yǎng)液的pH(3)正常
解析:(1)動物細胞培養(yǎng)的過程:取動物組織塊(或動物胚胎或幼齡動物的組織、器官)→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理,分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉入培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理,分散成單個細胞,然后離心收集細胞,繼續(xù)傳代培養(yǎng)。(2)為保證動物細胞培養(yǎng)所需的無菌、無毒的環(huán)境,需要對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行滅菌處理以及在無菌環(huán)境下進行操作,定期更換培養(yǎng)液,以便清除代謝物,防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。培養(yǎng)過程還需要提供氣體環(huán)境,所需的氣體主要有O2和CO2,前者供細胞呼吸所用,后者的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。(3)據圖可知,培養(yǎng)癌細胞時,有無血清影響不大,而培養(yǎng)正常細胞時,有血清時的細胞數遠大于無血清時的細胞數,故培養(yǎng)正常細胞必須要添加血清。
【變式訓練】 1.某研究小組準備對某種動物的肝細胞進行動物細胞培養(yǎng),下列有關說法正確的是(　　)A.培養(yǎng)液通常含有蔗糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清B.細胞培養(yǎng)應在CO2培養(yǎng)箱中進行,CO2的作用是刺激細胞的呼吸C.取單個肝細胞進行培養(yǎng)獲得細胞群的方法利用了細胞全能性原理D.動物細胞培養(yǎng)可實現動物分泌蛋白的規(guī)?；a答案:D
解析:動物細胞培養(yǎng)時所用的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基,通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養(yǎng)應在CO2培養(yǎng)箱中進行,CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH。取單個肝細胞進行培養(yǎng)獲得細胞群的方法利用了細胞增殖的原理。動物細胞培養(yǎng)可用于人造皮膚的構建、動物蛋白的規(guī)模化生產等。
2.下列關于動物細胞培養(yǎng)的敘述,錯誤的是(　　)A.用于培養(yǎng)的細胞大多取自胚胎或幼齡動物的器官、組織B.將所取的組織先用胰蛋白酶等進行處理,使其分散成單個細胞C.在動物細胞培養(yǎng)過程中,要定期用胰蛋白酶處理,使細胞從瓶壁上脫離下來,制成細胞懸液D.在動物細胞培養(yǎng)時,貼壁生長的細胞可形成多層細胞答案:D
知識點二　干細胞培養(yǎng)及應用
1.胚胎干細胞(簡稱ES細胞)與成體干細胞的區(qū)別主要有哪些?提示:胚胎干細胞與成體干細胞的區(qū)別主要有以下幾點。(1)分化潛能不同:ES細胞具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞,并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能;成體干細胞具有組織特異性,只能分化成特定的細胞或組織,不具有發(fā)育成完整個體的能力。(2)來源不同:ES細胞來源于早期胚胎,成體干細胞來自成體的組織或器官。
(3)存在階段不同:胚胎干細胞是胚胎發(fā)育過程中特定階段的產物,隨著發(fā)育的進行,逐漸分化為各種細胞、組織、器官;成體干細胞在動物體內始終存在,在特定條件下,成體干細胞或者產生新的干細胞,或者按一定的程序分化,形成新的功能細胞,從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。(4)胚胎干細胞必須從胚胎中獲取,涉及倫理問題;成體干細胞不涉及倫理問題。
2.iPS細胞在治療人類疾病方面有哪些優(yōu)勢和不足?提示:優(yōu)勢:iPS細胞稱為誘導多能干細胞,類似于胚胎干細胞,但誘導過程無需破壞胚胎,而且iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞,將它移植回病人體內后,理論上可以避免免疫排斥反應。不足:誘導產生iPS細胞、促使其分化都需要時間,因此用某人特異的iPS細胞進行臨床治療只限于時間比較充裕的情形。
1.胚胎干細胞與成體干細胞的聯(lián)系胚胎干細胞能分化出各種類型的細胞,包括成體干細胞,也就是說,成體干細胞最終來自胚胎干細胞,由胚胎干細胞逐步分化形成。分化的示意圖如下:在體內,胚胎干細胞隨著發(fā)育的進行,能自行分化成其他各種干細胞;在體外培養(yǎng)條件下,胚胎干細胞必須經過誘導才能分化出其他類型的細胞。
2.iPS細胞與胚胎干細胞iPS細胞稱為誘導多能干細胞,從分化潛能上看,屬于多能干細胞,而胚胎干細胞屬于全能干細胞。從來源上看,胚胎干細胞只能來源于早期胚胎,iPS細胞卻可以由多種細胞經誘導形成,如成纖維細胞、已分化的T細胞、B細胞等都能誘導為iPS細胞。從自身特點上看,胚胎干細胞的應用涉及倫理問題,限制了它在醫(yī)學生的應用,而iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞,將它移植回病人體內后,理論上可以避免發(fā)生免疫排斥反應,它的應用前景優(yōu)于胚胎干細胞。另外,胚胎干細胞往往沒經過人為改造,iPS細胞可以轉入相應的基因或其他因子,往往經過人為改造。
科學家通過轉入四種基因可將體細胞誘導形成多能干細胞(iPS細胞),iPS細胞具有與胚胎干細胞類似的功能。下圖是設想用iPS細胞技術治療鐮狀細胞貧血的流程,請據圖回答下列問題。
(1)胚胎干細胞來源于　　　　　,具有　　　性 ,經誘導能發(fā)育成個體。(2)iPS細胞培育過程中運用到的生物技術有過程①的　　　　　　　　、過程②的轉基因等。?(3)過程①的培養(yǎng)液中除合成培養(yǎng)基的成分外,還需添加　　　　 等天然成分。?(4)經過程③④后,改造得到的A是　　　　　,再植入患者體內,使患者能夠產生正常紅細胞,達到治療鐮狀細胞貧血的目的。?(5)iPS細胞的誘導成功具有的醫(yī)學價值是?? 　。?
答案:(1)早期胚胎　全能(2)動物細胞培養(yǎng)(3)血清(4)造血干細胞(5)治療人類疾病,培育人造組織器官,解決供體器官不足和器官移植后的免疫排斥問題
解析:(1)胚胎干細胞來源于早期胚胎,具有發(fā)育的全能性,經誘導有發(fā)育成個體的潛能。(2)過程①是從患者體內取出體細胞進行動物細胞培養(yǎng),而過程②是把四種基因導入體細胞,涉及轉基因技術。(3)動物細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)液中除合成培養(yǎng)基的成分外,還需添加動物血清等天然成分。(4)鐮刀形細胞貧血癥患者體內無法形成正常的紅細胞,說明其造血干細胞出現功能障礙,所以A細胞是造血干細胞。(5)iPS細胞的誘導成功具有的醫(yī)學價值是治療人類疾病,培育人造組織器官,解決供體器官不足和器官移植后的免疫排斥問題等。
【變式訓練】 1.科學家利用逆轉錄病毒將Oct4等4 個關鍵基因導入已分化的體細胞中并表達,可使這個細胞成為類似干細胞的誘導多能干細胞(iPS 細胞)。上圖為相關實驗示意圖。下列相關敘述錯誤的是(　　)A.由iPS 細胞產生其他種類細胞的過程稱為細胞分化B.利用患者的iPS 細胞對其自身受損器官進行修復,與傳統(tǒng)器官移植相比成功率更高C.目前iPS 細胞在實際應用中還存在許多問題,例如有研究發(fā)現 iPS 細胞的增殖難以控制,即iPS 細胞具有衰老細胞的特征D.培養(yǎng)iPS 細胞的培養(yǎng)液中應添加動物血清答案:C
解析:由iPS 細胞產生其他種類細胞的過程稱為細胞分化,圖中過程①②③表示細胞分化,其實質是基因的選擇性表達。用該技術得到的新生器官替換供體病變器官,屬于自體移植,不發(fā)生免疫排斥反應,這可以大大提高器官移植成功率。iPS細胞擁有與胚胎干細胞相似的分化潛力,說明iPS細胞分化程度低,不易衰老。iPS 細胞是體細胞經過體外培養(yǎng)形成的,培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)液應在合成培養(yǎng)基的基礎上添加動物血清。
2.前幾年,兩個不同國家的研究小組幾乎同時宣布成功將人體皮膚細胞改造成了幾乎可以和胚胎干細胞相媲美的多功能干細胞——iPS細胞。人類iPS 細胞可以形成神經元等人體多種組織細胞。下列有關iPS 細胞的說法,正確的是(　　)A.iPS 細胞分化為人體多種組織細胞的過程遺傳物質發(fā)生了變化B.iPS 細胞是人體皮膚細胞在體外培養(yǎng)并經誘導形成的C.iPS 細胞既可分化形成神經元,也可分化形成心肌細胞,說明iPS 細胞在分裂時很容易發(fā)生突變D.iPS 細胞只能分化成人體多種組織細胞,是因為它不具有人體的完整基因組答案:B
解析:iPS細胞分化為多種組織細胞,是基因選擇性表達的過程,遺傳物質未發(fā)生變化。iPS細胞分化成不同的細胞是基因選擇性表達的結果,不能說明在分裂時容易發(fā)生突變。iPS細胞是多功能干細胞,含有人體生長發(fā)育的完整基因組。

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第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

版本： 人教版 (2019)

年級： 選擇性必修3

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