第34講　基因工程
[考綱明細]　1.基因工程的誕生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技術(含PCR技術)(Ⅱ)　3.基因工程的應用(Ⅱ)　4.蛋白質工程(Ⅰ)　5.實驗：DNA的粗提取與鑒定
考點1　基因工程的操作工具

1．基因工程概念
基因工程的別名
基因拼接技術或DNA重組技術
操作環(huán)境
生物體外
操作對象
基因
操作原理
基因重組
操作水平
DNA分子水平
基本過程
剪切→拼接→導入→表達
目的
創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品
優(yōu)點
克服遠緣雜交不親和障礙，定向改造生物的遺傳性狀

2．限制酶
(1)來源：主要是從原核生物中分離純化而來。
(2)作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
(3)形成末端類型
3．DNA連接酶
(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸間的磷酸二酯鍵。
(2)種類

種類
E·coliDNA連接酶
T4DNA連接酶
來源
大腸桿菌
T4噬菌體
特點
只“縫合”黏性末端
黏性末端和平末端都可“縫合”

(3)DNA連接酶和限制酶的關系

4．載體
(1)條件：能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存；具有一至多個限制酶切割位點；具有標記基因。
(2)種類
(3)作用：攜帶外源DNA片段進入受體細胞。
(4)特點：可在受體細胞中進行自我復制或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制。

1.(選修3 P6尋根問底)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用相同嗎？試簡要說明。
提示　不相同。DNA連接酶是將兩個DNA片段連接在一起，而DNA聚合酶是將單個的脫氧核苷酸連接到DNA片段上。
2．(選修3 P4尋根問底、P7思考與探究T2)限制酶主要來自于原核生物，為什么它不剪切自身的DNA？試推測其在原核生物中的作用。
提示　限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的堿基序列，并在特定的位點上進行切割；限制酶不切割原核生物自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是原核生物的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，原核生物會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起切割外源DNA、使之失效的作用，從而達到保護自身的目的。
3．(選修3 P7思考與探究T3)天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程載體？為什么？
提示　不可以。具有能自我復制、有一個或多個限制酶切割位點、有標記基因及對受體細胞無害等特點的DNA分子才可以直接用作基因工程的載體。實際上天然的DNA分子一般不完全具備上述條件，往往需要進行人工改造后才能用于基因工程操作。

題組一　基因工程工具酶分析
1．(2016·全國卷Ⅲ)圖a中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性核酸內切酶的識別序列與切割位點，圖b為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。

根據(jù)基因工程的有關知識，回答下列問題：
(1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產物連接，理由是____________________________________________。
(2)若某人利用圖b所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖c所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有________，不能表達的原因是________________________________
___________________________________________________________________。

圖c
(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是______________________。
答案　(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄(其他合理答案也可)
(3)E·coliDNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶
解析　(1)分析圖a可知，限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經這兩種酶切割得到的產物可以用DNA連接酶進行連接。
(2)構建基因表達載體時，為保證目的基因能在宿主細胞中成功表達，目的基因應插入在啟動子和終止子之間，據(jù)此可判斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表達。
(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。


歸納與DNA相關的六種酶

名稱
作用部位
作用底物
作用結果
限制酶
磷酸二酯鍵
DNA
將DNA切成兩個片段
DNA連
接酶
磷酸二
酯鍵
DNA片段
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合
酶或熱穩(wěn)定
DNA聚合酶
磷酸二
酯鍵
脫氧
核苷酸
將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA
(水解)酶
磷酸二
酯鍵
DNA
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶
堿基對之
間的氫鍵
DNA
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
RNA
聚合酶
磷酸二
酯鍵
核糖
核苷酸
將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端

題組二　載體的作用及特點
2．(2016·全國卷Ⅰ)某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：
(1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有__________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是_________________；并且_____________和______________________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是___________________________________。
在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________________________的固體培養(yǎng)基。
(3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于______________________。
答案　(1)能自我復制、具有標記基因(答出兩點即可)
(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素
(3)受體細胞
解析　(1)質粒作為載體，應具備的基本條件有：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細胞中能自我復制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制；有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等。
(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進行篩選，其中未被轉化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的質粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌進一步篩選出來，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。
(3)某些噬菌體經改造后作為載體，導入受體細胞后，其DNA復制所需的原料來自于受體細胞。
考點2　基因工程的基本程序

1．目的基因的獲取
(1)目的基因：主要指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。
(2)獲取方法

(3)幾種目的基因獲取方法的比較



方法
從基因文庫中獲取
人工合成
從基因組文
庫中獲取
從部分基因文
庫，如cDNA
文庫中獲取
化學
合成法
反轉
錄法
過程
供體細胞
中的全部
DNA
↓限制酶
許多DNA
片段
↓插入
載體
↓導入
受體菌群
(基因組文庫)
↓分離
目的基因
供體發(fā)育的
某個時期的
mRNA
↓反轉錄
單鏈DNA
↓合成
雙鏈DNA
↓插入
載體
↓導入
受體菌群
(cDNA文庫)
↓分離
目的基因
已知基因
核苷酸序
列且基因
較小，通
過DNA合
成儀直接
人工合成
目的基因
的mRNA
↓反轉錄
單鏈DNA
↓合成
雙鏈DNA
即目的基因

(4)PCR技術的原理和反應過程
①PCR原理：DNA雙鏈復制
②PCR反應過程

過程
說明
圖解
變性
當溫度上升到90～95_℃時，雙鏈DNA解鏈為單鏈

復性
溫度下降到50～60_℃，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合

延伸
70～75_℃時，Taq酶有最大活性，可使DNA新鏈由5′端向3′端延伸


③結果：上述三步反應完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式擴增。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。
2．基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
(2)基因表達載體的組成

(3)構建過程


(選修3 P11圖1－10)啟動子與起始密碼子、終止子與終止密碼子是一回事嗎？
提示　啟動子與起始密碼子、終止子與終止密碼子看起來差不多，實際上卻是兩組不同的概念。簡單地說，啟動子和終止子都是一段有特殊結構的DNA片段，屬于基因的非編碼序列，負責調控基因的轉錄。而起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上的三聯(lián)體密碼子，分別決定翻譯的起始和終止。
3．將目的基因導入受體細胞

生物種類
植物
動物
微生物
常用方法
農桿菌轉化法
顯微注射技術
感受態(tài)細胞法
受體細胞
體細胞或受精卵
受精卵
原核細胞
轉化過程
將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達
將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物
Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子

4．目的基因的檢測與鑒定
(1)分子水平的檢測
①利用DNA分子雜交技術檢測目的基因的有無。
②利用分子雜交技術檢測目的基因的轉錄。
③利用抗原—抗體雜交技術檢測目的基因的翻譯。
(2)個體生物學水平的鑒定，如抗蟲、抗病的接種實驗等。

1.(選修3 P12、P13生物技術資料卡)
①基因槍法(particle gun)又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。常用的金屬顆粒有鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4_μm。這是單子葉植物中常用的一種基因轉化方法，但是成本較高。
②花粉管通道法是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭；然后，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。我國的轉基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的，花粉管通道法是一種十分簡便經濟的方法。
2．(選修3 P11尋根問底)將生物所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結果會怎樣？
提示　有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射等方法導入受體植物，沒有進行基因表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣無法確定什么基因導入了受體植物。此法目前爭議頗多。
3．(選修3 P15思考與探究T3)利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯(lián)系細胞器知識，結合基因工程操作程序的基本思路，可以用大腸桿菌生產人的糖蛋白嗎？
提示　不可以。糖蛋白上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，內質網(wǎng)和高爾基體存在于真核細胞中，大腸桿菌中不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產這種糖蛋白是不可能的。
4．(選修3 P15思考與探究T4)利用基因工程的方法，使大腸桿菌生產出鼠的β－珠蛋白，應如何進行設計？
提示　基本操作如下。
(1)從小鼠中克隆出β－珠蛋白基因的編碼序列(cDNA)。
(2)將cDNA前后分別接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子和終止子，然后用限制酶和DNA連接酶將其整合到含四環(huán)素抗性基因的載體上，構建一個基因表達載體。
(3)將基因表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有四環(huán)素抗性基因而死亡；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β－珠蛋白基因已進入大腸桿菌。
(4)培養(yǎng)含有β－珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，從中提取β－珠蛋白。

　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　
題組一　基因表達載體構建時限制酶的選擇
1．(2016·江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題：

限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
識別序列及
切割位點






(1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，
通過________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入處于________態(tài)的大腸桿菌中。
(2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。
(4)若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。
答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受
(2)四環(huán)素　引物甲和引物丙
(3) 　都不能　(4)7
解析　(1)由題圖可知，質粒的兩個標記基因中都含有BamHⅠ的切點，因此不能用BamHⅠ進行切割，結合題干及表中信息可知BamHⅠ及Bcl Ⅰ的切割位點都能被Sau3AⅠ切割，所以也不能用Sau3AⅠ進行切割，所以只能用質粒和目的基因中都含有切點的BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶來切割目的基因和質粒。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質粒。要將重組質粒轉入大腸桿菌，要先用CaCl2處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。
(2)重組質粒中只含有四環(huán)素抗性基因這一個標記基因，所以為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，含有重組質粒的大腸桿菌能在該平板上長出菌落。要用PCR擴增目的基因，所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙，因為從圖2中可以看出，引物甲與引物丙與模板鏈結合后能完成目的基因的復制。
(3)BamHⅠ酶切的DNA末端是，BclⅠ酶切的DNA末端是，這兩個末端連接后的連接部位的6個堿基對序列為，由于連接后的6個堿基對序列不是BamHⅠ和BclⅠ的識別序列，故對于該部位BamHⅠ和BclⅠ都不能將其切開。
(4)因為質粒的BamHⅠ和BclⅠ識別序列中都有Sau3AⅠ的識別序列和切割位點，所以用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ切點及得到的7種大小不同的DNA片段情況如下：①切點在1或2或3的位置可以分別得到1種DNA分子，但其大小相同；②切點在1和2的位置可以得到2種DNA分子；③切點在1和3的位置可以得到2種DNA分子；④切點在2和3的位置可以得到2種DNA分子，故最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。


選擇限制酶的方法

(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類
①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。
(2)根據(jù)質粒的特點確定限制酶的種類
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。
②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復制。
題組二　PCR技術的原理及應用
2．(2017·江蘇高考節(jié)選)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題：

(1)從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴增。
(2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當?shù)腳___________________位點。設計引物時需要避免引物之間形成______________________，而造成引物自連。
(3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。
(4)如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有________(填序號：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O計引物)。
答案　(1)逆轉錄　cDNA
(2)限制性核酸內切酶　堿基互補配對
(3)變性　(4)②③
解析　(4)如果PCR反應得不到任何擴增產物，可能的原因是退火溫度過高，或者設計的引物不合適，不能與模板結合。因此可采取的改進措施有降低退火溫度、重新設計引物等。

生物體內DNA復制與PCR反應的區(qū)別
項目
PCR技術
體內DNA復制
相同點
原理
堿基互補配對原則
條件
均需要模板、引物、酶等
不同點

場所
細胞外(主要在PCR擴增儀內)
細胞內(主要在細胞核內)
解旋方式
DNA在高溫下變性解旋
解旋酶催化
酶
耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)
解旋酶、普通的
DNA聚合酶
溫度
條件
需控制溫度，在較高溫度下進行
細胞內溫和的條件
結果
短時間內可形成大量的DNA片段
形成完整的DNA分子



題組三　基因工程操作程序及實例
3．(2017·北京高考)為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質粒(圖2)重組，再借助農桿菌導入菊花中。

下列操作與實驗目的不符的是(　　)
A．用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和連接酶構建重組質粒
B．用含C基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因導入細胞
C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉化的菊花細胞
D．用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上
答案　C
解析　C基因兩端和質粒中啟動子和終止子之間都有EcoRⅠ酶切位點，可用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和(DNA)連接酶構建重組質粒，A正確；一般用農桿菌等作為媒介去侵染植物的愈傷組織等，將含有目的基因的質粒導入細胞，B正確；據(jù)圖可知，質粒中含有潮霉素抗性基因，不含卡那霉素抗性基因，故無法用卡那霉素來篩選被轉化的菊花細胞，C錯誤；檢測C基因是否整合到菊花染色體上，常采用DNA分子雜交技術，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作為標記，以此作為探針，使探針與C基因雜交，若顯示出雜交帶，則表明目的基因已插入染色體DNA中，D正確。
4．(2018·全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。

回答下列問題：
(1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是____________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證______________，也是為了保證__________________。
(2)將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和________過程。
(3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產生綠色熒光細胞的________移入牛的________________________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。
(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。
答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲與載體正確連接
(2)轉錄　翻譯
(3)細胞核　去核卵母細胞
(4)核DNA
解析　(1)甲是將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端而獲得的L1－GFP融合基因，據(jù)此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接。
(2)構建的真核表達載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達產物“某種熒光蛋白(GFP)”在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。若在導入P1的牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了表達，基因的表達過程包括轉錄和翻譯。
(3)若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經過胚胎移植等獲得含有甲的牛。
(4)PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片斷的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。
考點3　基因工程的應用及蛋白質工程

1．基因工程的應用
(1)動物基因工程：用于提高動物生長速率，從而提高產品產量；用于改善畜產品品質；用轉基因動物生產藥物；用轉基因動物作器官移植的供體等。
(2)植物基因工程：培育抗蟲轉基因植物(如抗蟲棉)、抗病轉基因植物(如抗煙草花葉病毒的轉基因煙草)和抗逆轉基因植物(如抗寒番茄)；利用轉基因改良植物的品質(如新花色矮牽牛)。
(3)比較基因治療與基因診斷


原理
操作過程
進展
基因
治療
基因表達
利用正?；驅胗谢蛉毕莸募毎?，以表達出正常性狀來治療(疾病)
臨床實驗
基因
診斷
堿基互補配對
制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況
臨床應用

2．蛋白質工程
(1)概念理解
①基礎：蛋白質分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系。
②操作：基因修飾或基因合成。
③結果：改造了現(xiàn)有蛋白質或制造出新的蛋白質。
④目的：根據(jù)人們對蛋白質功能的特定需求，對蛋白質結構進行分子設計。
(2)操作過程
從預期的蛋白質功能出發(fā)→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列(基因)。其流程圖如下：



1.(選修3 P24生物技術資料卡)用于基因治療的基因有三類。第一類是從健康人體上分離得到的功能正常的基因，用以取代病變基因，或依靠其表達產物，來彌補病變基因帶來的生理缺陷，如對血友病和地中海貧血病的治療。第二類是反義基因，即通過產生的mRNA分子，與病變基因產生的mRNA進行互補，來阻斷非正常蛋白質合成。第三類是編碼可以殺死癌變細胞的蛋白酶基因，又叫做自殺基因。
2．(選修3 P26旁欄思考)對天然蛋白質進行改造，你認為應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？
提示　毫無疑問應該通過對基因的操作來實現(xiàn)對天然蛋白質的改造，主要原因如下：①任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過的基因可以遺傳下去。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳的。②對基因進行改造比對蛋白質直接改造要容易操作，難度要小得多。
3．(選修3 P24拓展視野)基因芯片的原理、檢測方法、應用分別是什么？
提示　原理：DNA分子雜交技術。檢測方法：熒光標記法。應用：基因診斷、新藥篩選、臨床用藥指導等方面。
4．(選修3 P27討論T2)確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？
提示　確定目的基因的堿基序列后，可以根據(jù)人類的需要改造它，通過人工合成的方法或從基因文庫中獲取。
5．(選修3 P27異想天開)能否應用蛋白質工程，讓細菌生產人類所需要的蛋白質食品？
提示　理論上講可以，但目前還沒有真正成功的例子。一些報道利用細菌生產人類需要的蛋白質往往都是自然界已經存在的蛋白質，并非完全由人工設計出來而自然界不存在的。主要原因是蛋白質的高級結構非常復雜，人類對蛋白質的高級結構和蛋白質在生物體內如何行使功能知之甚少，很難設計出一個嶄新而又具有生命功能的蛋白質，而且一個嶄新的蛋白質會帶來什么危害也是人們所擔心的。
6．(選修3 P28思考探究T3)絕大多數(shù)酶是蛋白質，那么酶工程與蛋白質工程有什么區(qū)別？
提示　通常所說的酶工程是用工程菌生產酶制劑，而沒有經過由酶的功能來設計酶的分子結構，然后由酶的分子結構來確定相應基因的堿基序列等步驟。因此，酶工程的重點在于對已存在的酶的合理充分利用，而蛋白質工程的重點則在于對已存在的蛋白質分子的改造。當然，隨著蛋白質工程的發(fā)展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質工程的一部分。

辨析乳腺生物反應器與工程菌生產藥物
比較項目
乳腺生物反應器
工程菌
基因結構
動物基因的結構與人類基因的結構基本相同
細菌和酵母菌等生物基因的結構與人類基因的結構有較大差異
基因表達
合成的藥物蛋白與天然蛋白質相同
細菌細胞內沒有內質網(wǎng)、高爾基體等細胞器，產生的藥物蛋白可能沒有活性
受體細胞
動物的受精卵
微生物細胞
導入目的
基因的方式
顯微注射法
感受態(tài)細胞法
生產條件
不需嚴格滅菌，溫度等外界條件對其影響不大
需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養(yǎng)物質濃度等外界條件
藥物提取
從動物乳汁中提取
從微生物細胞中提取


題組一　基因工程應用及實例
1．(2018·天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉錄成對應DNA后，利用________技術擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的________，因此不能產生子代病毒。將該改造基因、表面抗原基因等其他基因分別構建重組質粒，并保存。
(2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因，其產物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。
(3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞，并在補加________的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起________免疫，增強免疫保護效果。
答案　(1)PCR　多肽(或蛋白質)
(2)載體　總RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa)　D
(4)細胞
解析　(1)PCR技術是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。因此以病毒RNA為模板，逆轉錄成對應DNA后，常利用PCR技術擴增。由于將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列，因此肽鏈合成提前終止，這樣與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的多肽(或蛋白質)，因此不能產生子代病毒。
(2)基因工程的核心步驟為基因表達載體的構建，即將該基因與載體連接后再導入宿主細胞。檢測目的基因是否成功表達上述tRNA時，利用核酸分子雜交技術，即用相應的DNA探針與宿主細胞的總RNA分子進行雜交鑒定，進而篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。
(3)因為設計的宿主細胞具有能合成一種特殊tRNA的基因，其產物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)，因此將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞，并在補加非天然氨基酸(Uaa)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞可翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產生大量子代病毒，用于制備疫苗。因為轉錄在宿主細胞內進行，且啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，因此需要使用宿主細胞的RNA聚合酶。故選D。
(4)不具侵染性的流感病毒滅活疫苗，不能侵入細胞內部，只能引起體液免疫，產生相應的抗體與記憶細胞，而該病毒活疫苗能夠侵入細胞，說明還可以引起細胞免疫。
題組二　蛋白質工程
2．(2015·全國卷Ⅱ)已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}：
(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________進行改造。
(2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：________________________________。
(3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)，通過__________________和__________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。
答案　(1)氨基酸序列(或結構)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯)
(3)設計蛋白質的結構　推測氨基酸序列　功能
解析　(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質的功能發(fā)生了改變，此過程是通過對構成蛋白質的氨基酸序列進行改造，進而改變了蛋白質的結構，從而改變了蛋白質的功能。
(2)在蛋白質工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎，對生物體內原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。所獲得的基因表達時遵循中心法則，中心法則的全部內容包括DNA和RNA復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白質。
(3)蛋白質工程的基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列。據(jù)此得到的蛋白質，還需要對其生物功能進行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。

蛋白質工程與基因工程的比較
(1)區(qū)別
項目
蛋白質工程
基因工程
過程
預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列
獲取目的基因→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定
實質
定向改造或生產人類所需的蛋白質
定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型和生物產品
結果
可生產自然界沒有的蛋白質
只能生產自然界已有的蛋白質
(2)聯(lián)系
①蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造。
實驗17　DNA的粗提取與鑒定

1．DNA粗提取和鑒定的原理
(1)提取思路：利用DNA和其他物質在理化性質方面的差異，提取DNA。
(2)DNA的性質：(提取和鑒定原理)
①DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同

②DNA不溶于酒精；
③對酶、高溫和洗滌劑的耐受性強；
④DNA＋二苯胺試劑藍色。
2．DNA粗提取和鑒定的操作流程


1．(2020·揚州江都中學段考)下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水
B．向雞血細胞液中加蒸餾水是為了釋放出DNA
C．向濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNA
D．用菜花替代雞血做實驗，其實驗操作步驟相同
答案　D
解析　向雞血細胞液中加蒸餾水是為了讓雞血細胞吸水漲破，從而釋放出DNA，B正確；向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了降低DNA的溶解度，進而析出DNA，C正確；用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟不完全相同，如植物細胞有細胞壁，破碎細胞時需要研磨并加入食鹽和洗滌劑，D錯誤。
2．實驗中對DNA進行鑒定時，做如下操作：

　　試管
序號　　
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA絲狀物并攪拌
3
加4 mL二苯胺，混勻
加4 mL二苯胺，混勻
4
沸水浴5分鐘
沸水浴5分鐘
實驗現(xiàn)象


實驗結論



(1)根據(jù)下圖，完成表格空白處的實驗內容。

(2)對于B試管，完成1、2、3的操作后溶液顏色如何變化？____________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加熱的目的是______________，同時說明DNA對高溫有較強的________。
(4)A試管在實驗中的作用是________。
(5)B試管中溶液顏色的變化程度主要與__________________________有關。
答案　(1)溶液不變藍色　溶液逐漸變藍色　DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色
(2)溶液顏色基本不變
(3)加快顏色反應速度　耐受性
(4)對照
(5)加入試管中的DNA(絲狀物)的多少
解析　A、B兩試管形成對照，B試管中含DNA絲狀物，A試管中不含，起對照作用，其他條件均完全相同。本實驗強調反應條件是沸水浴加熱5 min，這樣可加快顏色反應的速度。

DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4”
加蒸餾
水2次
①加到雞血細胞液中，使血細胞吸水漲破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質的量濃度稀釋到0.14 mol/L，使DNA析出
用紗布
過濾4次
①過濾血細胞破裂液，得到含細胞核物質的濾液；②過濾用2 mol/L的NaCl充分溶解的DNA，濾去溶液中的雜質；③濾取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④過濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl
溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細胞核物質；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA

高考熱點突破
1．(2019·全國卷Ⅰ)基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀╛_______和________。
(2)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(3)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________
____________________________________________________________。
答案　(1)基因組文庫　cDNA文庫
(2)解旋酶　加熱至90～95 ℃　氫鍵
(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
解析　(1)基因工程中的基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫(cDNA文庫)。
(2)生物體細胞內的DNA復制開始時，通過解旋酶解開DNA雙鏈。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，通過高溫(90～95 ℃)使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的氫鍵。
(3)大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會失活，而PCR反應體系中加入的聚合酶需耐高溫，故在PCR反應中要用能耐高溫的Taq酶。
2．(2018·全國卷Ⅰ)回答下列問題：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該研究除證明了質?？梢宰鳛檩d體外，還證明了____________________________________________(答出兩點即可)。
(2)體外重組的質?？赏ㄟ^Ca2＋參與的________方法導入大腸桿菌細胞，而體外重組的噬菌體DNA通常需與______________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是____________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用__________________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加________的抑制劑。
答案　(1)體外重組的質?？梢赃M入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達
(2)轉化　外殼蛋白(或噬菌體蛋白)　細菌
(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　(2)用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，可以增大細胞膜的通透性，使重組的質粒更容易導入到受體細胞內，因此體外重組的質粒可通過Ca2＋參與的轉化方法導入大腸桿菌細胞。體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質外殼組裝成完整的噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組噬菌體DNA導入受體細胞。噬菌體侵染的是細菌，而不能寄生在其他細胞中，因此可作為重組噬菌體宿主細胞的是細菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解，為防止蛋白質被降解，可以選用不能產生蛋白酶的缺陷細菌以及使用能夠抑制蛋白酶活性的藥物，因此為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加蛋白酶的抑制劑。
3．(2017·全國卷Ⅰ)真核生物基因中通常有內含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}：
(1)某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，其原因是_______________________________________
______________________________________________________________。
(2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用__________作為載體，其原因是__________________________。
(3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有________________________________________________
__________________________________________(答出兩點即可)等優(yōu)點。
(4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。
(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是_____________________________
___________________________________________________________。
答案　(1)基因A有內含子，在大腸桿菌中，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A
(2)噬菌體　噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶
(3)繁殖快、容易培養(yǎng)　(4)蛋白A的抗體
(5)DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體
解析　(1)人是真核生物，從人的基因組文庫中獲得的基因A有內含子，而受體細胞大腸桿菌是原核生物，原核生物基因中沒有內含子，相應的就沒有切除內含子對應的RNA序列的機制，故無法表達出蛋白A。
(2)噬菌體是專一性侵染細菌的病毒，以細菌為宿主細胞，而昆蟲病毒侵染的是昆蟲，以昆蟲為宿主細胞。家蠶屬于昆蟲，故應選用昆蟲病毒作為載體。
(3)與家蠶相比，大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，故要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。
(4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用抗原—抗體雜交法。
(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗中，S型細菌的DNA可以使R型細菌發(fā)生轉化，說明可調控多糖莢膜產生的基因整合到了R型細菌的DNA分子中并成功得以表達。也就是說DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體并進行表達，這就為基因工程理論的建立提供了啟示。
4．(2017·全國卷Ⅱ)幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題：
(1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是________________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是________________。
(2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是___________________
______________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是___________________________________
________________________________________________(答出兩點即可)。
(4)當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是________________________。
(5)若獲得的轉基因植株(幾丁質酶基因已經整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是___________________________________________________________________。
答案　(1)嫩葉比老葉生命活動旺盛，mRNA含量高，且易破碎　防止RNA降解
(2)在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA
(3)目的基因無復制原點；目的基因無表達所需啟動子
(4)磷酸二酯鍵
(5)目的基因的轉錄或翻譯異常
解析　(1)與老葉相比，嫩葉生命活動旺盛，mRNA含量高，且易破碎，容易提取到幾丁質酶的mRNA。提取RNA時，提取液中添加RNA酶抑制劑可防止RNA被RNA酶催化降解。
(3)因該目的基因是通過逆轉錄形成的，無表達所需的啟動子，也無在受體細胞內進行復制所需的復制原點等，所以在受體細胞內不能穩(wěn)定存在和表達，也不能遺傳下去。
(4)構建基因表達載體時，DNA連接酶能催化目的基因和質粒載體這兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。
(5)轉基因植株的基因組中含有幾丁質酶基因，但該植株抗真菌的能力并沒有提高，可能是由于轉錄或翻譯異常，即幾丁質酶基因未能正常表達。
5．(2017·全國卷Ⅲ)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成，編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成，如圖1所示。

回答下列問題：
(1)現(xiàn)要通過基因工程的方法獲得蛋白乙，若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，則所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙，原因是__________________________。
(2)某同學在用PCR技術獲取DNA片段B或D的過程中，在PCR反應體系中加入了DNA聚合酶、引物等，還加入了序列甲作為______________，加入了______________作為合成DNA的原料。
(3)現(xiàn)通過基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白，要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用，某同學做了如下實驗：將一定量的含T淋巴細胞的培養(yǎng)液平均分成四組，其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一組作為對照，培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細胞濃度，結果如圖2。
①由圖2可知：當細胞濃度達到a時，添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加，此時若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖，可采用的方法是__________________。細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度，CO2的作用是______________________。
②僅根據(jù)圖1、圖2可知，上述甲、乙、丙三種蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段，則會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。
答案　(1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG，轉錄出的mRNA無起始密碼子
(2)模板　dNTP
(3)①進行細胞傳代培養(yǎng)　維持培養(yǎng)液的pH　②C
解析　(1)若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，則基因表達載體中編碼乙的DNA序列起始端無ATG，無論以DNA的哪條鏈為模板，轉錄出的mRNA都無起始密碼子AUG，使所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙。
(3)①當細胞濃度達到a時，添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加，可能是由于發(fā)生了接觸抑制，可用胰蛋白酶處理貼壁生長的細胞，制成細胞懸液分瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)。動物細胞培養(yǎng)中，CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH。
②對照分析圖1和圖2可知，能刺激T淋巴細胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而對T淋巴細胞增殖促進作用很弱的丙中沒有C片段，據(jù)此可知，若缺少C片段所編碼的肽段，則會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。
6．(2018·江蘇高考)為生產具有特定性能的α－淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656個堿基對)，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，實驗流程見圖。請回答下列問題：

(1)利用PCR技術擴增α－淀粉酶基因前，需先獲得細菌的________。
(2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是________________________________________________。
(3)進行擴增時，反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設定，下列選項中________的設定與引物有關，________的設定與擴增片段的長度有關。(填序號)
①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r間
⑤退火時間　⑥延伸時間
(4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：
5′－AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……—3′
圖中虛線框內mRNA片段包含________個密碼子，如虛線框后的序列未知，預測虛線框后的第一個密碼子最多有________種。
(5)獲得工程菌表達的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結果如下：

緩沖液
50 mmol/L
Na2HPO4－KH2PO4
50 mmol/L
Tris－HCl
50 mmol/L
Gly－NaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相對
活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8

根據(jù)上述實驗結果，初步判斷該α－淀粉酶活性最高的條件為____________________________________________________。
答案　(1)基因組DNA
(2)5′　使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連
(3)②?、蕖?4)8　13
(5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris－HCl
解析　(1)α-淀粉酶基因來自于海洋細菌，因此為了利用PCR技術擴增α-淀粉酶基因，必須先獲得細菌的基因組DNA。
(2)目的基因與載體結合前需要用限制酶對兩者進行切割，延伸是在引物的3′端延伸，為了保證目的基因的完整性，因此需在引物的5′端加上限制性酶切位點，且為了使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連，常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點。
(3)進行擴增時，退火溫度的設定與引物有關，延伸時間的設定與擴增片段的長度有關。
(4)根據(jù)題意分析，虛線框內mRNA片段內含有24個堿基，每3個堿基構成一個密碼子，因此包含24÷3＝8個密碼子；構成mRNA的堿基有4種，因為虛線外第一個密碼子已固定為U，且三個終止密碼子皆為U開頭，所以預測虛線框后的第一個密碼子最多有4×4－3＝13種。
(5)根據(jù)表格數(shù)據(jù)分析可知，在pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris－HCl的條件下，α-淀粉酶相對活性為99.5%，活性最高。
課時作業(yè)
1．(2019·湖南衡陽一模)科學家利用PCR定點突變技術改造某基因，從而提高其生理功能效率。請據(jù)所學知識，回答下列問題：
(1)PCR過程所依據(jù)的原理是______________，擴增過程需要加入________酶。
(2)可利用定點突變的DNA構建基因表達載體，常用________將基因表達載體導入植物細胞，還需用到植物細胞工程中的____________技術，才能最終獲得轉基因植物。
(3)重組質粒中抗生素抗性基因的作用是____________________。
(4)基因文庫中cDNA文庫與基因組文庫相比，前者較小，原因是________________________________。
答案　(1)DNA雙鏈復制　耐高溫的DNA聚合(或Taq)
(2)農桿菌轉化法　植物組織培養(yǎng)
(3)鑒別和篩選含有目的基因的細胞
(4)cDNA文庫是通過生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉錄產生的，這個時期并不是每個基因都進行轉錄，而基因組文庫包含所有的基因
解析　(1)PCR的原理是DNA雙鏈復制；擴增過程是在較高溫度下進行的，因此需要加入耐高溫的DNA聚合酶(或Taq酶)。
(2)基因工程中，常用農桿菌轉化法將基因表達載體導入植物細胞；將轉基因植物細胞培育成轉基因植株還需要采用植物組織培養(yǎng)技術，原理是植物細胞具有全能性。
(3)重組質粒中抗生素抗性基因為標記基因，其作用是鑒別和篩選含有目的基因的細胞。
2．(2020·安徽“皖南八?！比?lián))科學家將人的生長激素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達。但在進行基因工程的操作過程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒，便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—，請據(jù)圖回答：

(1)過程①所需要的酶是________。一般采用PCR技術擴增目的基因，前提要有一段已知目的基因的核苷酸序列，原因是______________________。
(2)在構建基因表達載體的過程中，用________切割質粒，獲取目的基因時只能用一種限制酶，應用__________________切割目的基因所在的外源DNA。用限制酶切割目的基因和載體后形成的黏性末端在DNA連接酶的催化作用中通過________原則進行連接。人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進行重組，原因是____________________________________。
(3)在過程③中一般將受體大腸桿菌用CaCl2溶液(Ca2＋)進行處理，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細胞稱為____________。
答案　(1)逆轉錄酶　根據(jù)這一序列合成引物
(2)限制酶Ⅰ　限制酶Ⅱ　堿基互補配對　人的基因與大腸桿菌DNA分子的組成單位相同，結構相同，且具有相同的黏性末端
(3)感受態(tài)細胞
解析　(1)據(jù)圖可知，題圖中是通過逆轉錄法來獲取目的基因的，所以過程①所需要的酶應是逆轉錄酶；利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。
(2)根據(jù)限制酶Ⅰ的識別序列和切點為“—G↓GATCC—”、限制酶Ⅱ的識別序列和切點為“—↓GATC—”，可知限制酶Ⅱ也能識別并切割限制酶Ⅰ的識別序列，在構建基因表達載體過程中，應該用限制酶Ⅰ來切割質粒，因為如果用限制酶Ⅱ切割質粒，會使兩個標記基因都受到破壞；而目的基因兩端分別是限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ的切割位點，如果只能用一種限制酶，應用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的外源DNA。用限制酶切割目的基因和載體后形成的黏性末端在DNA連接酶的催化作用中通過堿基互補配對原則進行連接。人的基因與大腸桿菌DNA分子的組成單位、結構相同，且具有相同的黏性末端，所以人的基因能與大腸桿菌的DNA分子進行重組。
(3)圖中過程③表示將目的基因導入大腸桿菌，該過程中一般將受體大腸桿菌用CaCl2溶液(Ca2＋)進行處理，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。
3．(2020·廣東佛山市質檢)油菜籽中蛋白質和油脂的相對含量，與酶1和酶2對共同底物丙酮酸的競爭有關。酶1促進蛋白質的合成，酶2促進油脂的合成。通過生物工程技術對油菜進行改造，以得到含有基因A的油菜，流程圖如下。請據(jù)圖作答：

(1)上述改造過程中運用的生物工程技術是____________________。
(2)通過__________________、______________或人工化學合成等方法，都可獲取目的基因A。過程①中的處理方法為________。
(3)過程④中要防止雜菌污染的原因是____________________________。通過過程④得到的油菜植株中，所有細胞________(填“一定”“不一定”或“一定不”)含有基因A。
(4)已知轉錄時基因A的模板鏈與酶1基因的模板鏈互補。相對普通油菜，含基因A的油菜籽粒油脂含量顯著提高，請分析其機理：________________________。
答案　(1)基因工程、植物組織培養(yǎng)
(2)從基因文庫中獲取　利用PCR技術擴增　Ca2＋處理法
(3)雜菌會競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，還可能產生有毒有害物質　不一定
(4)基因A轉錄的mRNA與酶1基因轉錄的mRNA互補，阻礙了酶1基因的mRNA翻譯，降低了酶1含量，酶2對丙酮酸的競爭增強，促進了油脂合成
解析　(1)據(jù)圖可知，上述過程最終把外源基因A導入了油菜細胞，此過程用到了基因工程技術，上述過程還需要把油菜的下胚軸細胞培養(yǎng)成油菜植株，此過程需要植物組織培養(yǎng)技術。
(2)基因工程技術首先要獲取目的基因，目前最常用的方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增，此外如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以用化學方法直接人工合成。將基因導入微生物細胞時，需要用Ca2＋處理法，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這樣可以提高目的基因的導入率。
(3)過程④是植物組織培養(yǎng)過程，在此過程中，需要防止雜菌污染，否則雜菌會競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，還可能產生有毒有害物質，導致油菜幼苗的生長發(fā)育受到影響。將目的基因導入受體細胞時，不是所有的細胞都能成功導入目的基因，因此所有細胞不一定都含有基因A。
(4)已知轉錄時基因A的模板鏈與酶1基因的模板鏈互補，基因A轉錄的mRNA與酶1基因轉錄的mRNA會發(fā)生互補配對，阻礙了酶1基因的mRNA翻譯，降低了酶1含量，酶2對丙酮酸的競爭增強，促進了油脂合成。
4．(2019·貴州黔東南州一模)2017年8月2日，中華人民共和國農業(yè)部官網(wǎng)發(fā)布《2017年農業(yè)轉基因生物安全證書(進口)批準清單》包含耐除草劑大豆MON87705、耐除草劑油菜T45、耐除草劑玉米T25等10多個轉基因生物系列，回答下列問題：
(1)耐除草劑玉米T25植株的培育用到了基因工程技術，該過程以耐除草劑基因作為________(填“目的基因”或“標記基因”)。
(2)如果將耐除草劑基因插入到Ti質粒的________上，通過農桿菌的轉化作用，可使該基因轉移進入玉米細胞，并將其插入到玉米細胞中染色體的DNA上，這種將耐除草劑基因導入玉米細胞的方法叫做________。
(3)基因表達載體構建時，需用到________酶將耐除草劑基因和Ti質粒結合在一起，在基因表達載體中位于耐除草劑基因的首端和尾端分別具有________和________(填結構名稱)，以啟動和停止基因的轉錄。
(4)在耐除草劑玉米T25植株的培育過程中________(填“能”或“不能”)用動物病毒作為耐除草劑基因導入玉米細胞的載體，原因是________________。
答案　(1)目的基因　(2)T－DNA　農桿菌轉化法
(3)DNA連接　啟動子　終止子
(4)不能　病毒是專性寄生的，以動物病毒作為載體無法將目的基因導入到植物細胞(或農桿菌細胞)中
解析　(1)根據(jù)題意分析，利用基因工程技術培育了耐除草劑玉米T25植株，則耐除草劑基因為目的基因。
(2)將目的基因導入植物細胞(玉米細胞)應該用農桿菌轉化法，先將耐除草劑基因插入到Ti質粒的T－DNA上，通過農桿菌的轉化作用，將目的基因導入玉米細胞，并將其插入到玉米細胞中染色體的DNA上。
(3)構建基因表達載體時，需要利用DNA連接酶將目的基因(耐除草劑基因)與Ti質粒結合在一起，且目的基因必須插入啟動子與終止子之間，以啟動和停止基因的轉錄。
(4)病毒是專性寄生的，以動物病毒作為載體無法將目的基因導入到植物細胞中，因此在耐除草劑玉米T25植株的培育過程中不能用動物病毒作為耐除草劑基因導入玉米細胞的載體。
5．(2020·貴州適應性考試)人抗凝血酶Ⅲ是人體血液中一種重要的抗凝血因子，具有抑制血液中凝血酶活性的作用，利用人工合成的人抗凝血酶Ⅲ對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。下圖表示利用乳腺生物反應器生產人抗凝血酶Ⅲ的過程。

回答下列問題：
(1)乳腺生物反應器是指將目的基因與________的啟動子等調控組件重組在一起，通過顯微注射導入哺乳動物受精卵，最終獲得轉基因動物。轉基因動物進入哺乳期后，可以通過分泌乳汁來生產所需要的藥品。若將上述過程中受體細胞改為大腸桿菌，生產出來的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性，原因是____________________________________。
(2)人抗凝血酶Ⅲ基因導入受精卵需要“分子運輸車”(載體)。“分子運輸車”應具備的條件是___________________________________________。
(3)完成過程②所需的技術是________；早期胚胎能夠在代孕羊體內存活的原因是________________。
(4)為了能從乳汁中分離出人抗凝血酶Ⅲ，需要對轉基因羊進行性別鑒定，在胚胎移植前，最好取囊胚中________的細胞進行性別鑒定。轉基因羊只有乳腺細胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ，其根本原因是________________________。
答案　(1)乳腺蛋白基因　大腸桿菌不含內質網(wǎng)和高爾基體，不能對蛋白質進行加工和修飾
(2)自我復制的能力；有一個或多個限制酶的切割位點；帶有標記基因；分子大小適宜
(3)早期胚胎培養(yǎng)　受體對外來胚胎一般不發(fā)生免疫排斥反應
(4)滋養(yǎng)層　人抗凝血酶Ⅲ基因只能在乳腺細胞中選擇性表達
解析　動物乳腺生物反應器是基于轉基因技術平臺，使外源基因導入動物基因組中并定位表達于動物乳腺，利用動物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在動物的乳汁中生產一些具有重要價值產品的轉基因動物的總稱。據(jù)圖分析，圖中人抗凝血酶Ⅲ基因屬于目的基因，過程①表示將目的基因導入受體細胞(供體羊的受精卵)，常用的方法是顯微注射法；過程②表示早期胚胎培養(yǎng)；過程③表示胚胎移植技術。
(1)根據(jù)以上分析已知，該過程中目的基因是人抗凝血酶Ⅲ基因，利用基因工程技術最終通過分泌乳汁來生產所需要的人抗凝血酶，因此應該將該目的基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調控組件重組在一起，使目的基因可以在乳腺細胞中表達。若將受體細胞改為大腸桿菌，由于大腸桿菌沒有內質網(wǎng)和高爾基體，不能對蛋白質進行加工和修飾，因此生產出來的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性。
(3)根據(jù)以上分析已知，過程②表示早期胚胎培養(yǎng)技術；由于受體細胞對外來胚胎一般不發(fā)生免疫排斥反應，因此早期胚胎能夠在代孕羊體內存活。
(4)用囊胚期胚胎進行性別鑒定時，因為滋養(yǎng)層細胞將發(fā)育成胎膜、胎盤，內細胞團發(fā)育成各種組織器官，因此可用分割針分割部分滋養(yǎng)層細胞進行性別鑒定；由于人抗凝血酶Ⅲ基因只能在乳腺細胞中選擇性表達，所以轉基因羊只有乳腺細胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ。
6．材料一　人類可利用轉基因番茄作為生物反應器生產人胰島素。所用的人胰島素基因是依據(jù)植物“偏愛”的密碼子來設計所含的密碼子，通過人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在胰島素-COOH端加上KDEL內質網(wǎng)滯留序列，避免胰島素在植物細胞中的降解。將該基因置于果實專一性啟動子的驅動之下通過農桿菌介導的方法轉入番茄中，在番茄的果實中表達人胰島素。
材料二　T4溶菌酶在溫度較高時易失去活性，科學家對編碼T4溶菌酶的基因進行改造，使其表達的T4溶菌酶的第3位的異亮氨酸變?yōu)榘腚装彼幔谠摪腚装彼崤c第97位的半胱氨酸之間形成了一個二硫鍵，提高了T4溶菌酶的耐熱性。
(1)材料一中基因工程操作是采用________方法獲得目的基因的。獲得的人胰島素基因與人體細胞中胰島素基因中編碼氨基酸的堿基序列不同，但兩者所編碼的蛋白質中氨基酸序列相同，這是因為密碼子具有________。要想在體外獲得大量該目的基因的片段，可以采用________技術。
(2)根據(jù)上述描述，轉基因操作時所用的載體是______________，載體上的________可以轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。
(3)材料二屬于__________工程范疇。該工程是指以分子生物學相關理論為基礎，通過基因修飾或基因合成，對________進行改造，或制造一種________的技術。
答案　(1)人工合成　簡并性　PCR
(2)農桿菌的Ti質?！-DNA
(3)蛋白質　現(xiàn)有蛋白質　新蛋白質
解析　(1)根據(jù)題干信息可知材料一中基因工程操作是采用人工合成的方法獲得目的基因的。雖然獲得的人胰島素基因與人體細胞中胰島素基因中編碼氨基酸的堿基序列不同，但所編碼的蛋白質的氨基酸序列卻相同，是由于密碼子具有簡并性，目的基因可以采用PCR技術擴增產生大量的目的基因。
(2)根據(jù)“將該基因置于果實專一性啟動子的驅動之下通過農桿菌介導的方法轉入番茄中”可知該過程的載體是農桿菌的Ti質粒，質粒上的T-DNA可以轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。
7．(2020·安徽馬鞍山質檢)L－肉堿具有參與脂肪氧化、抗疲勞、延遲患阿爾茨海默綜合癥等功能。據(jù)報道大腸桿菌能將巴豆甜菜堿轉化成L－肉堿，但效率較低?？蒲腥藛T通過基因工程將BCD基因、F基因以及T基因導入到大腸桿菌細胞內以提高L－肉堿的轉化率。實驗過程及結果如下圖所示，分析并回答下列問題：

(1)實驗過程中用PCR技術獲得目的基因，PCR反應體系需要加入的有機物有DNA模板、dNTP、耐高溫DNA聚合酶和______________。實驗過程中不能將BCD基因、F基因以及T基因直接導入到大腸桿菌細胞內，而是構建重組質粒后再導入大腸桿菌，原因是________________，并能遺傳給下一代。圖中兩個重組質粒目的基因的首端都含有啟動子T7，T7是________識別和結合的部位，能驅動基因轉錄。
(2)將重組質粒1和重組質粒2導入大腸桿菌時，應用____________處理大腸桿菌，使細胞處于______________________的感受態(tài)。
(3)為了篩選出同時含有BCD基因、F基因以及T基因的大腸桿菌，實驗的思路是_________________________________________________。
(4)研究發(fā)現(xiàn)巴豆甜菜堿轉化成L－肉堿是一個可逆反應過程，得到的工程菌在含有巴豆甜菜堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后，L－肉堿的含量基本穩(wěn)定，此時可以____________________，以提高產量。
答案　(1)(兩種)引物　構建重組質粒后目的基因才能在受體細胞中穩(wěn)定存在，進行表達(使目的基因在受體細胞中完成轉化)　RNA聚合酶
(2)Ca2＋　易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子　
(3)在同時含有卡那霉素和氯霉素培養(yǎng)基上挑選單克隆大腸桿菌
(4)及時移除產物(更換培養(yǎng)液)，使反應向生成L－肉堿的方向進行
解析　(1)多聚酶鏈式反應(PCR)，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。PCR反應體系需要加入的有機物有DNA模板、dNTP、耐高溫DNA聚合酶和(兩種)引物。由于目的基因無法直接在受體細胞中穩(wěn)定存在，因此為了使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，能夠表達，并能遺傳給下一代，實驗過程中不能將BCD基因、F基因以及T基因直接導入到大腸桿菌細胞內，而是構建重組質粒后再導入大腸桿菌。圖中兩個重組質粒目的基因的首端都含有啟動子T7，T7是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄。
(2)使體外重組的DNA分子轉移到受體細胞內，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。一般將受體大腸桿菌用Ca2＋處理，使細胞處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)，使含有目的基因的重組質粒容易進入受體細胞。
(3)重組質粒1上含有BCD基因及卡那霉素抗性基因，重組質粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因，因此在同時含有卡那霉素和氯霉素培養(yǎng)基上挑選得到的單克隆大腸桿菌，就是同時含有BCD基因、F基因以及T基因的大腸桿菌。
(4)研究發(fā)現(xiàn)巴豆甜菜堿轉化成L－肉堿是一個可逆反應過程，在可逆反應中，減少生成物濃度，可使反應向正方向進行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后，L－肉堿的含量基本穩(wěn)定，此時可以及時移除產物(更換培養(yǎng)液)，使反應向生成L－肉堿的方向進行，以提高產量。
8．(2019·山東煙臺二模)干擾素是動物和人體細胞受到病毒感染后產生的一種糖蛋白，具有抗病毒、抑制細胞增殖及抗腫瘤作用。利用基因工程技術培育能生產干擾素的植物流程如圖所示。請回答下列問題：


限制酶
識別序列和切割位點
EcoRⅠ
G↓ATTC
BamHⅠ
G↓ATCC
SmaⅠ
CCC↓GGG
ApaⅠ
GGGCC↓C

(1)首先獲取的動物干擾素基因稱為________。利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是________________________。
(2)過程①中剪切質粒和目的基因時所需要的工具酶是________和________。酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列________。
(3)將目的基因導入植物細胞常用________________法，當植物受傷時，傷口處的細胞會分泌大量的__________吸引農桿菌移向這些細胞。除此之外還有__________法和__________法可以將目的基因轉入受體細胞。
(4)在培育愈傷組織的固體培養(yǎng)基中，除了無機鹽、有機營養(yǎng)物質、瓊脂、植物激素外，還需添加卡那霉素?？敲顾氐淖饔檬莀_____________________。在分子水平上通常采用________________技術檢測干擾素基因是否導入受體細胞。
答案　(1)目的基因　干擾素基因兩端的部分核苷酸序列
(2)BamHⅠ　EcoRⅠ　不相同
(3)農桿菌轉化　酚類化合物　基因槍　花粉管通道
(4)篩選出導入重組質粒的植物細胞　DNA分子雜交
解析　(1)在基因工程中，獲取的動物干擾素基因稱為目的基因。利用PCR技術擴增干擾素基因時，需要依據(jù)干擾素基因兩端的部分核苷酸序列設計引物序列。
(2)題圖顯示：干擾素基因中存在SmaⅠ的識別位點，若使用SmaⅠ切割質粒和外源DNA，則會破壞干擾素基因，因此過程①所示的構建重組質粒時不能使用SmaⅠ切割。BamHⅠ和EcoRⅠ的識別位點位于目的基因的兩側，質粒上也有BamHⅠ和EcoRⅠ的識別位點，因此，過程①中剪切質粒和目的基因時所需要的工具酶是BamHⅠ和EcoRⅠ。因BamHⅠ和EcoRⅠ的識別位點不同，所以酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同。
(4)重組質粒中含有的抗卡那霉素基因屬于標記基因，其作用是鑒別受體細胞是否含有目的基因，便于篩選?？梢姡谂嘤鷤M織的固體培養(yǎng)基中添加卡那霉素的作用是篩選出導入重組質粒的植物細胞。在分子水平上檢測干擾素基因是否導入受體細胞，通常采用DNA分子雜交技術。

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