1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？
第一步目的基因的篩選與獲取
在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如與生物抗逆性、生產(chǎn)藥物、毒物降解、工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。
通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家通過實(shí)驗(yàn)，將該細(xì)菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。
Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因。
當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。
從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一
在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。研究表明，蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)?？茖W(xué)家不僅掌握了Br基因的序列信息，也對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。因此，Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。
隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及遺傳序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，這也為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會和可能。
在我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家人工合成了目的基因?，F(xiàn)在，常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。
獲取目的基因的方法有多種
利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
該技術(shù)由穆里斯等人于1985 年發(fā)明，為此，穆里斯于1993 年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。
DNA復(fù)制和PCR反應(yīng)的基本條件
真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20~30個(gè)核苷酸。
耐高溫的DNA 聚合酶
目的基因DNA受熱變性后解為單鏈
兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合
溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則加到引物的3’端，合成新的DNA 鏈。
第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。
第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。
循環(huán)多次。目的基因的量成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。
在PCR擴(kuò)增儀（PCR儀）中自動完成。
完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。
第二步基因表達(dá)載體的構(gòu)建
基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心工作）
讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
目的基因標(biāo)記基因啟動子本質(zhì)：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。位置：位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。作用：是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。
說明：有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。
目的基因標(biāo)記基因啟動子終止子本質(zhì)：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。位置：位于基因的下游作用：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。
用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口
用同一種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，形成了一個(gè)重組DNA分子。
基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖
第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞
我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)。應(yīng)用舉例：抗蟲棉的培育過程中，采用該法將Bt基因?qū)肓嗣藁?xì)胞。 操作方法：有多種，如：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。
轉(zhuǎn)化的含義：是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：是一種在土壤中生活的微生物。能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。
農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。
原理：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。方法：根據(jù)受體植物的不同，所用的具體轉(zhuǎn)化方法有所區(qū)別。例如：將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。成果：隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——動物細(xì)胞
常用受體細(xì)胞：動物受精卵最常用的方法：利用顯微注射直接將目的基因注入動物的受精卵中，這個(gè)受精卵將發(fā)育成為具有新性狀的動物。
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物
生物：在基因工程操作中，常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛。方法：一般先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。
第四步目的基因的檢測與鑒定
目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道，這也是檢查轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否培育成功的一步。
分子水平的檢測：通過PCR等技術(shù)檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白等。個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：例如，通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。
基因工程的基本操作流程圖
轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，有效控制了棉鈴蟲的種群數(shù)量，顯著減少了農(nóng)藥的用量。面對棉鈴蟲的危害，有了抗蟲棉是否就可以一勞永逸、高枕無憂呢？根據(jù)棉鈴蟲對傳統(tǒng)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的發(fā)展歷史，科研人員推測棉鈴蟲存在對Bt 抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的可能。請你查閱資料，了解以下問題。在實(shí)際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？
科研工作者在發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？
(2)田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%~30%面積的可使用化學(xué)殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花;在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場需設(shè)計(jì)專門的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個(gè)正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生了抗性，但是因?yàn)槠渑c敏感目標(biāo)害蟲交配，后代抗性基因會發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲的種群也不至于迅速增加。(3)國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測、進(jìn)行嚴(yán)格的安全性評價(jià)等。
【探究·實(shí)踐】DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
擴(kuò)增：利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。電泳鑒定：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個(gè)過程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
了解PCR和電泳鑒定的基本原理。嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。
PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）、4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。相關(guān)試劑的配方參見本書附錄 3。
移液：用微量移液器按照右欄中的配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。
注：模板DNA的用量為1gp～1μg
離心：待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10 s，使反應(yīng)液集中在管的底部。反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。
制備瓊脂糖溶液：根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%～1.2% 的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
制備凝膠：將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜。
加樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。
電泳：接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。觀察記錄：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
注意：為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。
你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？
你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。

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第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

版本： 人教版 (2019)

年級： 選擇性必修3

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