一、高考真題匯編的意義。1、增強(qiáng)高考考生的復(fù)習(xí)動(dòng)力和信心；2、提高高考考生的復(fù)習(xí)效率；3、加深考生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的理解和掌握。
二、高考真題匯編的內(nèi)容。1、高考試題收錄，涵蓋了考試的各個(gè)學(xué)科；2、答案解析，加深知識(shí)點(diǎn)理解和掌握；3、復(fù)習(xí)指導(dǎo)，提高復(fù)習(xí)效率。
三、高考真題匯編的重要性。高考真題匯編不僅可以提高考生的復(fù)習(xí)動(dòng)力和信心，增強(qiáng)考生的復(fù)習(xí)效率，而且還可以加深考生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的理解和掌握，使考生更好地把握考試方向，為高考復(fù)習(xí)提供了有力的支持。
專(zhuān)題18 基因工程
(2024年1月浙江省)1. 關(guān)于生物技術(shù)的安全與倫理問(wèn)題在我國(guó)相關(guān)法規(guī)明令禁止的是（ ）
A. 試管動(dòng)物的培育B. 轉(zhuǎn)基因食品的生產(chǎn)
C. 治療性克隆的研究D. 生物武器的發(fā)展和生產(chǎn)
【答案】D
【解析】
【分析】1、我國(guó)政府一再重申 四不原則:不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實(shí)驗(yàn)。
2、2010年，在第65 屆聯(lián)合國(guó)大會(huì)上，我國(guó)政府重申支持《禁止生物武器公約》的宗旨和目標(biāo)，全面、嚴(yán)格履行公約義務(wù)，支持不斷加強(qiáng)公約的約束力，并主張全面禁止和徹底銷(xiāo)毀生物武器等各類(lèi)大規(guī)模殺傷性武器。
【詳解】A、試管動(dòng)物的培育屬于胚胎工程，沒(méi)有禁止，A正確；
B、我過(guò)目前不反對(duì)轉(zhuǎn)基因的食品的生產(chǎn)，B正確；
C、中國(guó)政府禁止生殖性克隆，支持治療性克隆，C正確；
D、生物武器致病能力強(qiáng)、攻擊范圍廣，世界范圍內(nèi)應(yīng)全面禁止生物武器，D錯(cuò)誤
故選D。
(2024年山東?。?3. 關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法正確的是（ ）
A. 整個(gè)提取過(guò)程中可以不使用離心機(jī)
B. 研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中
C. 鑒定過(guò)程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變
D. 僅設(shè)置一個(gè)對(duì)照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾
【答案】A
【解析】
【分析】DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同 濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同，利用這一特點(diǎn)可 以選擇適當(dāng)濃度的鹽溶液可以將DNA溶解或析出， 從而達(dá)到分離的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解于酒精，利用這一原理可以將蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)一步分離; ③在沸水浴的條件下DNA遇二苯胺會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。
【詳解】A、在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，可將獲得的研磨液用紗布過(guò)濾后，在4℃的冰箱中放置幾分鐘，再取上清液，也可以直接將研磨液用離心機(jī)進(jìn)行離心后取上清液，A正確；
B、研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，應(yīng)取上清液倒入燒杯中，B錯(cuò)誤；
C、鑒定過(guò)程中用沸水浴加熱，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，C錯(cuò)誤；
D、加入二苯胺試劑后沸水浴處理時(shí)間要在5分鐘以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應(yīng)，僅設(shè)置一個(gè)對(duì)照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾，D錯(cuò)誤。
故選A。
(2024年山東省）25. 研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過(guò)脫落酸信號(hào)途徑調(diào)控大豆的逆境響應(yīng)。利用基因工程技術(shù)編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaI切點(diǎn)處插入大豆基因L的向?qū)NA序列，將載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導(dǎo)核酸酶特異性結(jié)合基因組上的目標(biāo)序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標(biāo)基因L部分序列及相關(guān)結(jié)果等如圖所示。
（1）用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因L時(shí)，所用的引物越短，引物特異性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切開(kāi)DNA雙鏈時(shí)，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有______種。載體信息如圖甲所示，經(jīng)BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞，使用抗生素______篩選到具有該抗生素抗性的植株①∶④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點(diǎn)如圖乙所示，PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是______，其中純合的突變植株是______（填序號(hào)）。
（3）實(shí)驗(yàn)中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個(gè)植株的自交子代，其中突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株所占比例為_(kāi)_____，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。
【答案】（1） ①. 低 ②. 256 ③. GTTT ④. CAAT
（2） ①. 卡那霉素 ②. Sac Ⅰ ③. ④
（3）1/4
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的篩選與獲取，基因表達(dá)載體的構(gòu)建，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定。
2、PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)，利用PCR可以快速的獲取和擴(kuò)增目的基因。
【小問(wèn)1詳解】
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。由此可知，在利用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目的基因時(shí)，所用的引物越短，則引物的特異性就越低。根據(jù)題意可知，限制酶在切開(kāi)DNA雙鏈時(shí)，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，圖中給出的只是載體信息，大豆基因組無(wú)法從圖中看出。只能根據(jù)理論來(lái)推測(cè)，BsaI切割產(chǎn)生的黏性末端是NNNN，四個(gè)堿基最多可能有256種排列順序，故答案應(yīng)為 256。根據(jù)圖甲所示的載體信息，經(jīng)BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。
【小問(wèn)2詳解】
根據(jù)圖示信息可知，重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞當(dāng)中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過(guò)使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據(jù)圖甲可知，目標(biāo)基因L的目標(biāo)序列跟突變序列之間的差異只有在Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)上存在差異，BamH Ⅰ和EcR Ⅰ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)完全相同，根據(jù)圖丙及題意可知，所展示的電泳結(jié)果可知，要以上述抗性植株的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L，并對(duì)PCR產(chǎn)物完全酶切后進(jìn)行電泳從而判斷植株含有的是目標(biāo)序列還是突變序列，因此只能選用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突變序列存在酶切位點(diǎn)，但是目標(biāo)序列沒(méi)有，因此經(jīng)過(guò)該酶酶切后突變序列的電泳條帶會(huì)出現(xiàn)兩條，目標(biāo)序列是一條帶，根據(jù)圖丙結(jié)果可知，只有④為純和突變的植株。
【小問(wèn)3詳解】
根據(jù)題意可知，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中獲得了一株基因l成功突變的純合之中，已知該植株具有抗生素抗性，經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞中只有一條染色體含有T-DNA插入。根據(jù)圖示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素來(lái)篩選該植株進(jìn)行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含T-DNA（對(duì)抗生素敏感）的配子比例為1/2，因此突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株所占比例應(yīng)該為1/2×1/2=1/4，純突變位點(diǎn)純合且具有抗生素抗性的植株所占比例應(yīng)該為3/4，可以篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。
（2024年高考全國(guó)甲卷）12. 某同學(xué)采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白E。回答下列問(wèn)題。
（1）該同學(xué)利用PCR擴(kuò)增目的基因。PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個(gè)階段，其中DNA雙鏈打開(kāi)成為單鏈的階段是________________，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是________。
（2）質(zhì)粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點(diǎn)，限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在________（答出兩點(diǎn)即可）；使用酶c單酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)宜選用的連接酶是________。
（3）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌前，通常先將受體細(xì)胞處理成感受態(tài)，感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)是________；若要驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒，簡(jiǎn)要的實(shí)驗(yàn)思路和預(yù)期結(jié)果是________________。
（4）蛋白E基因中的一段DNA編碼序列（與模板鏈互補(bǔ)）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼從GGG開(kāi)始，部分密碼子見(jiàn)表。若第一個(gè)核苷酸G缺失，則突變后相應(yīng)肽鏈的序列是________________________。
【答案】（1） ①. 變性 ②. 氫鍵
（2） ①. 避免目的基因和質(zhì)粒的任意連接、防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化 ②. T4DNA連接酶
（3） ①. 細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài) ②. 利用DNA分子雜交技術(shù)，將大腸桿菌的基因組DNA提取出來(lái)，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，表明大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒
（4）甘氨酸-脯氨酸-絲氨酸
【解析】
【分析】1、基因工程基本工具：限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶、運(yùn)載體。
2、基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲取；②基因表達(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個(gè)階段，其中DNA雙鏈打開(kāi)成為單鏈的階段是變性，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是氫鍵。
【小問(wèn)2詳解】
構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，與單一酶酶切相比，采用的雙酶切方法，可以形成不同的黏性末端，雙酶切可以避免目的基因和質(zhì)粒的反向連接、目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化。酶c單酶切后形成平末端，需用T4DNA連接酶連接。
【小問(wèn)3詳解】
大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是：首先用Ca2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞。若要驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒，可利用DNA分子雜交技術(shù)，將大腸桿菌的基因組DNA提取出來(lái)，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，表明大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒
【小問(wèn)4詳解】
蛋白E基因中的一段DNA編碼序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼鏈與模板鏈互補(bǔ)，模板鏈與mRNA互補(bǔ)，因此mRNA上的序列為GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一個(gè)核苷酸G缺失，則mRNA上的序列變?yōu)镚GCCCAAGCUGAGAUGA，肽鏈序列是甘氨酸-脯氨酸-絲氨酸。
（2024年安徽省）14. 下列關(guān)于“DNA 粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是（ ）
A. 實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會(huì)降低
B. 利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C. DNA在不同濃度NaC1溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D. 將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測(cè)溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)
【答案】D
【解析】
【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性。
（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。
【詳解】A、研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會(huì)降低，A正確；
B、DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可分離DNA，B正確；
C、DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對(duì)DNA進(jìn)行粗提取，C正確；
D、在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，D錯(cuò)誤。
故選D。
（2024年廣東省）21. 駒形桿菌可合成細(xì)菌纖維素（BC）并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優(yōu)異的生物材料，BC膜應(yīng)用廣泛。研究者設(shè)計(jì)了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入駒形桿菌后構(gòu)建出一株能合成BC膜并可實(shí)現(xiàn)光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級(jí)提供了新思路（圖一）。
回答下列問(wèn)題：
（1）研究者優(yōu)化了培養(yǎng)基_______（答兩點(diǎn)）等營(yíng)養(yǎng)條件，并控制環(huán)境條件，大規(guī)模培養(yǎng)工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜（菌體和 BC膜的復(fù)合物）。
（2）研究者利用T7 噬菌體來(lái)源的RNA聚合酶（T7RNAP）及藍(lán)光光敏蛋白標(biāo)簽，構(gòu)建了一種可被藍(lán)光調(diào)控的基因表達(dá)載體（光控原理見(jiàn)圖二a，載體的部分結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖二b）。構(gòu)建載體時(shí)，選用了通用型啟動(dòng)子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶識(shí)別）和特異型啟動(dòng)子PT7（僅被T7RNAP識(shí)別）。為實(shí)現(xiàn)藍(lán)光控制染色，啟動(dòng)子①②及③依次為_(kāi)_______，理由是___________。
（3）光控表達(dá)載體攜帶大觀霉素（抗生素）抗性基因。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)液中加入大觀霉素，其作用為_(kāi)_______________________（答兩點(diǎn)）。
（4）根據(jù)預(yù)設(shè)的圖案用藍(lán)光照射已長(zhǎng)出的BC菌膜并繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，隨后將其轉(zhuǎn)至染色池處理，發(fā)現(xiàn)只有經(jīng)藍(lán)光照射的區(qū)域被染成黑色，其原因是_____。
（5）有企業(yè)希望生產(chǎn)其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構(gòu)建模式提出一個(gè)簡(jiǎn)單思路______。
【答案】（1）碳源、氮源
（2） ①. PT7、PBAD 和PBAD ②. 基因2和3正常表達(dá)無(wú)活性產(chǎn)物，被藍(lán)光激活后再啟動(dòng)基因1表達(dá)
（3）抑制雜菌；去除丟失質(zhì)粒的菌株
（4）該處細(xì)胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達(dá)并合成黑色素
（5）將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶(或?qū)⒗野彼崦柑鎿Q成不同顏色蛋白)
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源等，研究者培養(yǎng)工程菌，需要優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)條件，并控制環(huán)境條件。
【小問(wèn)2詳解】
題圖二a分析可知，藍(lán)光照射下，T7RNAP N端-nMag與T7RNAP C端結(jié)合，導(dǎo)致無(wú)活性的T7RNAP變成有活性的T7RNAP，結(jié)合圖一，藍(lán)光處理后，RNA聚合酶（T7RNAP）識(shí)別啟動(dòng)子①使基因1轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的mRNA，再以其為模板通過(guò)翻譯過(guò)程獲得酪氨酸酶，酪氨酸酶從而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可見(jiàn)基因2和3正常表達(dá)無(wú)活性產(chǎn)物，被藍(lán)光激活后再啟動(dòng)基因1表達(dá)，綜合上述分析可知，為實(shí)現(xiàn)藍(lán)光控制染色，啟動(dòng)子①②及③依次為PT7、PBAD 和PBAD。
【小問(wèn)3詳解】
光控表達(dá)載體攜帶大觀霉素（抗生素）抗性基因。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)液中加入大觀霉素，抗生素具有抑制雜菌；去除丟失質(zhì)粒的菌株的作用。
【小問(wèn)4詳解】
由小問(wèn)2分析可知，細(xì)胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達(dá)并合成黑色素，故用藍(lán)光照射已長(zhǎng)出的BC菌膜并繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，隨后將其轉(zhuǎn)至染色池處理，發(fā)現(xiàn)只有經(jīng)藍(lán)光照射的區(qū)域被染成黑色。
【小問(wèn)5詳解】
由小問(wèn)2分析可知，題干信息的設(shè)計(jì)思路最終BC膜被染成黑色，希望生產(chǎn)其他顏色圖案的BC膜，則需要將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶(或?qū)⒗野彼崦柑鎿Q成不同顏色蛋白)。
（2024年吉林省）7. 關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是（ ）
A. 瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B. 凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C. 在同一電場(chǎng)作用下，DNA片段越長(zhǎng)，向負(fù)極遷移速率越快
D. 瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測(cè)出來(lái)
【答案】A
【解析】
【分析】瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的原理主要基于DNA分子在電場(chǎng)作用下的遷移行為以及瓊脂糖凝膠的特性。
【詳解】A、瓊脂糖凝膠的濃度會(huì)影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據(jù)所需分離的DNA片段大小來(lái)選擇的。對(duì)于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質(zhì)粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因?yàn)樗鼈冃枰蟮目讖絹?lái)有效遷移。而對(duì)于較小的DNA片段，比如PCR產(chǎn)物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確；
B、 凝膠載樣緩沖液指示劑通常是一種顏色較深的染料，可以作為電泳進(jìn)度的指示分子， 當(dāng)溴酚藍(lán)到凝膠2/3處時(shí)(可看藍(lán)色條帶)，則停止電泳，B錯(cuò)誤；
C、在瓊脂糖凝膠電泳中，當(dāng)電場(chǎng)作用時(shí)，DNA片段實(shí)際上是向正極遷移的，而不是向負(fù)極遷移。同時(shí)，DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長(zhǎng)，遷移速率越慢，C錯(cuò)誤；
D、瓊脂糖凝膠中的DNA分子需染色后，才可在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)，D錯(cuò)誤。
故選A。
（2024年吉林?。?5. 將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒（輔助T-DNA轉(zhuǎn)移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可提高轉(zhuǎn)化效率。細(xì)菌和棉花對(duì)密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強(qiáng)棉花抗病蟲(chóng)害能力，進(jìn)行如下操作。回答下列問(wèn)題。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左邊界；T-DNA-RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是______。提取過(guò)程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中獲取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是______，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是______。
（4）根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用______基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。
（5）為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是______。
A. 通過(guò)含有雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞
B. 將蘇云金桿菌Bt基因?qū)朊藁?xì)胞中表達(dá)
C. 將1-1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列獲得改造的抗蟲(chóng)蛋白
【答案】（1） ①. 水解DNA酶，防止DNA被分解 ②. 溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA
（2） ①. PCR技術(shù)擴(kuò)增 ②. 人工合成
（3） ①. RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位 ②. 調(diào)控目的基因的表達(dá)
（4）HygBR （5） ①. F3 ②. R2 （6）D
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是水解DNA酶，防止DNA被分解。提取過(guò)程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA。
【小問(wèn)2詳解】
本操作中獲取目的基因的方法是人工合成和PCR技術(shù)擴(kuò)增。
【小問(wèn)3詳解】
穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是調(diào)控目的基因的表達(dá)。
【小問(wèn)4詳解】
結(jié)合基因表達(dá)載體的示意圖，根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用HygBR基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。
【小問(wèn)5詳解】
為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是F3和R2。
【小問(wèn)6詳解】
蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)改造或合成基因，來(lái)改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)生產(chǎn)和生活的需求，本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列獲得改造的抗蟲(chóng)蛋白，將1-1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列，未產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，不屬于蛋白質(zhì)工程。
ABC不符合題意，D符合題意。
故選D。
（2024年安徽?。?0. 丁二醇廣泛應(yīng)用于化妝品和食品等領(lǐng)域。興趣小組在已改造的大腸桿菌中引入合成丁二醇的關(guān)鍵基因X，以提高丁二醇的產(chǎn)量?；卮鹣铝袉?wèn)題。
（1）擴(kuò)增X基因時(shí)，PCR反應(yīng)中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________。
（2）使用BamH I和 SalI限制酶處理質(zhì)粒和X基因，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并涂布在無(wú)抗生素平板上（如圖）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選含目的基因菌株的實(shí)驗(yàn)思路是___________________________。
、
（3）研究表明，碳源和氮源的種類(lèi)、濃度及其比例會(huì)影響微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物積累。如果培養(yǎng)基中碳源相對(duì)過(guò)多，容易使其氧化不徹底，形成較多的____________________，引起發(fā)酵液pH值下降。興趣小組通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定了木薯淀粉和酵母粉的最適濃度分別為100g.L-1和15 g.L-1。在此基礎(chǔ)上，設(shè)置不同濃度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）篩選碳源和氮源濃度的最佳組合，以獲得較高發(fā)酵產(chǎn)量，理論上應(yīng)設(shè)置______（填數(shù)字）組實(shí)驗(yàn)（重復(fù)組不計(jì)算在內(nèi)）。
（4）大腸桿菌在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)，溫度會(huì)升高，其原因是__________________。
（5）發(fā)酵工業(yè)中通過(guò)菌種選育、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵后，再經(jīng)_____________________，最終獲得發(fā)酵產(chǎn)品。
【答案】（1）在 PCR 反應(yīng)中，需要利用高溫使 DNA 雙鏈解旋，普通的 DNA聚合酶在高溫下會(huì)變性失活，而 Tag DNA 聚合酶能夠耐高溫,在高溫條件下依然具有活性
（2）在平板中添加氯霉素，再將在含氯霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落利用影印法影印到添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能正常生長(zhǎng)的菌落由導(dǎo)入目的基因的菌株形成
（3） ①. 乳酸或有機(jī)酸 ②. 9
（4）大腸桿菌進(jìn)行細(xì)胞呼吸時(shí)會(huì)釋放大量熱量
（5）提取、分離、純化
【解析】
【分析】PCR反應(yīng)過(guò)程:變性→復(fù)性→延伸。變性:當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，復(fù)性:溫度下降到50℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，延伸:72℃左右時(shí)，Taq酶有最大活性，可使DNA新鏈由5'端向3'端延伸。
【小問(wèn)1詳解】
在 PCR 反應(yīng)中，變性的溫度需要90℃以上，需要利用高溫使 DNA 雙鏈解旋，普通的 DNA聚合酶在高溫下會(huì)變性失活，而 Tag DNA 聚合酶能夠耐高溫，在高溫條件下依然具有活性，因此擴(kuò)增X基因時(shí)，PCR反應(yīng)中需要使用Taq DNA聚合酶。
【小問(wèn)2詳解】
據(jù)圖可知，使用BamH I和 Sal I限制酶處理質(zhì)粒和X基因，四環(huán)素抗性基因被破壞，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培養(yǎng)基上生存，不能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生存的大腸桿菌即是含目的基因菌株，因此實(shí)驗(yàn)思路為：在平板中添加氯霉素，再將在含氯霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落利用影印法影印到添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能正常生長(zhǎng)的菌落由導(dǎo)入目的基因的菌株形成。
【小問(wèn)3詳解】
碳源是微生物生長(zhǎng)所需的主要能量來(lái)源，而氮源則是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和合成蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的基本原料。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源相對(duì)過(guò)多時(shí)，微生物可能會(huì)優(yōu)先利用碳源進(jìn)行能量代謝，而氮源的消耗相對(duì)較慢。這會(huì)導(dǎo)致碳源氧化不完全，形成較多的乳酸或有機(jī)酸。這些乳酸或有機(jī)酸會(huì)在溶液中解離，使發(fā)酵液的pH值下降。因?yàn)橐Y選碳源和氮源濃度的最佳組合，木薯淀粉濃度有3種，酵母粉濃度也有3種，因此理論上應(yīng)設(shè)置3×3=9組實(shí)驗(yàn)。
【小問(wèn)4詳解】
大腸桿菌進(jìn)行細(xì)胞呼吸時(shí)會(huì)釋放大量能量，絕大多數(shù)以熱能形式釋放，因此大腸桿菌在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)，溫度會(huì)升高。
【小問(wèn)5詳解】
發(fā)酵工程一般包括菌種的選育，擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基的配制、滅菌，接種，發(fā)酵，產(chǎn)品分離、提純等方面，因此發(fā)酵工業(yè)中通過(guò)菌種選育、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵后，再經(jīng)提取、分離、純化，最終獲得發(fā)酵產(chǎn)品。
(2024年1月浙江省)22. 鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境中Zn2+的功能。為研究該植物2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，并進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N克隆。以該植物______為材料提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR每個(gè)循環(huán)第一步是進(jìn)行熱變性處理，該處理的效果類(lèi)似于生物體內(nèi)______的作用效果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，DNA分子因?yàn)楹琠_____而帶負(fù)電荷，凝膠點(diǎn)樣孔端應(yīng)靠近電泳槽負(fù)極接口；當(dāng)2個(gè)PCR產(chǎn)物分子量接近時(shí)，若延長(zhǎng)電泳時(shí)間，凝膠中這2個(gè)條帶之間的距離會(huì)______?；厥誅NA片段，連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證。
（2）重組表達(dá)載體構(gòu)建。分別將含M、N基因的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切處理，然后利用______連接，將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功。此反應(yīng)可以用大腸桿菌懸液當(dāng)模板的原因是______。
（3）酵母菌轉(zhuǎn)化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，直接在固體培養(yǎng)基進(jìn)行______培養(yǎng)，活化后接種至液體培養(yǎng)基，采用______以擴(kuò)大菌體數(shù)量，用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母菌。檢測(cè)M、N基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)水平，無(wú)顯著差異。
（4）轉(zhuǎn)基因酵母功能鑒定。分別將轉(zhuǎn)化了M、N基因的酵母菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液用______法逐級(jí)稀釋至OD600為0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天，菌落生長(zhǎng)如圖。該實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照為_(kāi)_____。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步推測(cè)：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N中，轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)的是______，依據(jù)是______。
注：OD600為波長(zhǎng)600nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高；空載體為未插入M或N基因的表達(dá)載體。
【答案】（1） ①. 根 ②. 解旋酶 ③. 磷酸基團(tuán) ④. 變長(zhǎng)
（2） ①. DNA連接酶 ②. 熱變性使大腸桿菌內(nèi)的DNA外溢
（3） ①. 劃線分離 ②. 振蕩培養(yǎng)
（4） ①. 梯度稀釋 ②. 鋅吸收缺陷型酵母+空載體 ③. N ④. 轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量數(shù)量多
【解析】
【分析】由圖中光譜吸收值可知，鋅吸收缺陷型酵母+N基因表達(dá)載體組吸收值與野生型酵母+空載體組相近，轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量數(shù)量多，說(shuō)明N轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)。
【小問(wèn)1詳解】
由題意可知，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)膜，所以以該植物的根為材料提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熱變性處理的目的是使DNA解螺旋，相當(dāng)于生物體內(nèi)解旋酶的效果。DNA分子因?yàn)楹辛姿峄鶊F(tuán)而帶負(fù)電荷，所以其點(diǎn)樣孔端應(yīng)靠近電泳槽負(fù)極接口。隨著時(shí)間的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，時(shí)間越長(zhǎng)，距離差越大。
【小問(wèn)2詳解】
內(nèi)切酶處理后的質(zhì)粒和目的基因，用DNA連接酶進(jìn)行連接。由于RCR過(guò)程中熱變性使大腸桿菌內(nèi)的DNA外溢，所以可用大腸桿菌懸液當(dāng)模板，利用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功。
【小問(wèn)3詳解】
凍存酵母菌可直接在固體培養(yǎng)基上涂布或平板劃線接種后進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行活化，然后轉(zhuǎn)至液體培養(yǎng)基增殖，培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行震蕩，有利于增加培養(yǎng)液的溶氧量和使酵母菌和培養(yǎng)液充分接觸，從而快速增殖。
【小問(wèn)4詳解】
由題意可知，菌液稀釋后OD600為0.06、0.006和0.0006，說(shuō)明其進(jìn)行10指數(shù)的梯度稀釋。由圖可知，鋅吸收缺陷型酵母+空載體組不會(huì)吸收鋅，為陰性對(duì)照。由圖中光譜吸收值可知，轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量數(shù)量多，說(shuō)明N轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)。
(2024年1月浙江省)23. 小鼠毛囊中表達(dá)F蛋白。為研究F蛋白在毛發(fā)生長(zhǎng)中的作用，利用基因工程技術(shù)獲得了F基因敲除的突變型純合體小鼠，簡(jiǎn)稱(chēng)f小鼠，突變基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠長(zhǎng)50%，表現(xiàn)出毛絨絨的樣子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f雜合子基因型用+f表示）
回答下列問(wèn)題：
（1）F基因敲除方案如圖甲。在F基因的編碼區(qū)插入了一個(gè)DNA片段P，引起F基因產(chǎn)生______，導(dǎo)致mRNA提前出現(xiàn)終止密碼子，使得合成的蛋白質(zhì)因?yàn)槿笔Я薩_____而喪失活性。要達(dá)到此目的，還可以對(duì)該基因的特定堿基進(jìn)行______和______。
（2）從野生型、f雜合子和f小鼠組織中分別提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，進(jìn)行瓊脂糖電泳，用DNA探針檢測(cè)。探針的結(jié)合位置如圖甲，檢測(cè)結(jié)果如圖乙，則f小鼠和f雜合子對(duì)應(yīng)的DNA片段分別位于第______泳道和第______泳道。
（3）g小鼠是長(zhǎng)毛隱性突變體（gg），表型與f小鼠相同。f基因和g基因位于同一條常染色體上。f雜合子小鼠與g小鼠雜交，若雜交結(jié)果是______，則g和f是非等位基因；若雜交結(jié)果是______，則g和f是等位基因。（注：不考慮交叉互換；野生型基因用++表示；g雜合子基因型用+g表示）
（4）確定g和f為等位基因后，為進(jìn)一步鑒定g基因，分別提取野生型（++）、g雜合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用（2）小題同樣的DNA探針和方法檢測(cè)，結(jié)果如圖丙。g小鼠泳道沒(méi)有條帶的原因是______。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)野生型和g雜合子表達(dá)F蛋白，g小鼠不表達(dá)F蛋白，因此推測(cè)F蛋白具有的作用______。
【答案】（1） ①. 編碼序列錯(cuò)位 ②. 氨基酸序列 ③. 替換 ④. 缺失
（2） ①. 3 ②. 2
（3） ①. 子代全為野生型 ②. 野生型：突變型=1：1
（4） ①. 基因突變丟失了啟動(dòng)子，導(dǎo)致無(wú)法轉(zhuǎn)錄出 mRNA；反轉(zhuǎn)錄沒(méi)有產(chǎn)物，檢測(cè)不出結(jié)果 ②. 抑制毛發(fā)生長(zhǎng)
【解析】
【分析】基因分離定律實(shí)質(zhì)：在雜合子細(xì)胞中，位于一對(duì)同源染色體上的等位基因，具有一定的獨(dú)立性；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，等位基因會(huì)隨著同源染色體的分開(kāi)而分離，分別進(jìn)入兩個(gè)配子當(dāng)中，獨(dú)立地隨配子遺傳給后代。
【小問(wèn)1詳解】
依據(jù)題意，在F基因的編碼區(qū)插入了一個(gè)DNA片段P，引起F基因產(chǎn)生編碼序列錯(cuò)位，從而導(dǎo)致mRNA提前出現(xiàn)終止密碼子，使得合成的蛋白質(zhì)中氨基酸序列變短，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)決定功能，導(dǎo)致合成的蛋白質(zhì)喪失活性。該基因突變是插入一個(gè)DNA片段引起的，除此之外，還可以缺失或者替換基因中的堿基，從而導(dǎo)致基因突變。
【小問(wèn)2詳解】
從圖中看出，野生型基因和f基因都含有2個(gè)限制酶HindⅢ的識(shí)別序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出來(lái)能與探針結(jié)合的片段較短，f基因切出來(lái)能與探針結(jié)合的片段較長(zhǎng)，DNA分子越長(zhǎng)，分子質(zhì)量越大，在電泳時(shí)遷移速度越慢，因此推測(cè)第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f雜合子對(duì)應(yīng)的DNA片段分別位于第3泳道和第2泳道。
【小問(wèn)3詳解】
據(jù)題意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是長(zhǎng)毛隱性突變體，基因型用gg表示，f雜合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一條常染色體上，如果g和f是非等位基因，f雜合子小鼠（+f/++）與g小鼠（++/gg）雜交，后代為++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f雜合子小鼠（+f）與g小鼠（gg）雜交，后代為+g：fg=1：1，即野生型與突變型比例為1：1。
【小問(wèn)4詳解】
據(jù)圖可知，野生型基因突變成g基因以后，啟動(dòng)子隨著一部分DNA片段丟失，無(wú)法轉(zhuǎn)錄出 mRNA，也無(wú)法形成cDNA，PCR時(shí)缺少模板，反轉(zhuǎn)錄沒(méi)有產(chǎn)物，導(dǎo)致最終無(wú)結(jié)果，因此g小鼠泳道沒(méi)有條帶。g小鼠表型與f小鼠相同，表現(xiàn)出毛絨絨的樣子，野生型和g雜合子表達(dá)F蛋白，g小鼠不表達(dá)F蛋白，即沒(méi)有F蛋白，表現(xiàn)出長(zhǎng)毛，說(shuō)明F蛋白在毛發(fā)生長(zhǎng)中起抑制作用。
(河南省2024)11. 某研究小組將纖維素酶基因（N）插入某種細(xì)菌（B1）的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株（B2）。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5'→3'方向?；卮鹣铝袉?wèn)題。
（1）限制酶切割的化學(xué)鍵是________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G－C和________。
（3）用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是________；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是________。
（4）與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是________（答出2點(diǎn)即可）。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯鍵 ②. 不破壞N基因，且能保證N基因正常表達(dá)
（2）C-G、A-T、U-A
（3） ①. N基因的兩條鏈 ②. 不能擴(kuò)增出目的基因
（4）不污染環(huán)境、增加土壤養(yǎng)分
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打開(kāi)DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開(kāi)始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。
PCR反應(yīng)過(guò)程是：變性→復(fù)性→延伸。
【小問(wèn)1詳解】
限制酶切割化學(xué)鍵為磷酸二酯鍵。在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，不破壞N基因，且能保證N基因正常發(fā)表達(dá)。
【小問(wèn)2詳解】
RNA的堿基組成有A、U、G、C，DNA的堿基組成為A、T、G、C，向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G-C和C-G、A-T、U-A。
【小問(wèn)3詳解】
用引物P1和P2進(jìn)行PCR可擴(kuò)增N基因，驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是N基因的兩條鏈；用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，因?yàn)镻3不能與N基因模板鏈結(jié)合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不能擴(kuò)增出DNA片段。
【小問(wèn)4詳解】
與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是不污染環(huán)境、增加土壤養(yǎng)分。
(甘肅省2024)21. 源于細(xì)菌的纖維素酶是一種復(fù)合酶，能降解纖維素。為了提高纖維素酶的降解效率，某課題組通過(guò)篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株，克隆表達(dá)降解纖維素的三種酶（如下圖），研究了三種酶混合的協(xié)同降解作用，以提高生物質(zhì)資源的利用效率?；卮鹣铝袉?wèn)題。

（1）過(guò)程①②采用以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選菌株X，能起到篩選作用的原因是______。高產(chǎn)纖維素酶菌株篩選時(shí)，剛果紅培養(yǎng)基上的菌落周?chē)该魅Υ笮》从沉薩_____。
（2）過(guò)程④擴(kuò)增不同目的基因片段需要的關(guān)鍵酶是______。
（3）過(guò)程⑤在基因工程中稱(chēng)為_(kāi)_____，該過(guò)程需要的主要酶有______。
（4）過(guò)程⑥大腸桿菌作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)有______。該過(guò)程用Ca2+處理細(xì)胞，使其處于一種______的生理狀態(tài)。
（5）課題組用三種酶及酶混合物對(duì)不同生物質(zhì)原料進(jìn)行降解處理，結(jié)果如下表。表中協(xié)同系數(shù)存在差異的原因是______（答出兩點(diǎn)）。
注：混1和混2表示三種酶的混合物
【答案】（1） ①. 只有能利用羧甲基纖維素鈉的微生物才能生長(zhǎng)繁殖 ②. 菌落產(chǎn)生的纖維素酶的活性和量有關(guān)
（2）耐高溫的DNA聚合酶
（3） ①. 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ②. 限制酶、DNA連接酶
（4） ①. 繁殖能力強(qiáng)、生理結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境因素敏感、容易進(jìn)行遺傳操作等 ②. 能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子
（5）降解時(shí)的溫度不同、降解時(shí)的pH不同
【解析】
【分析】據(jù)圖可知，①②是利用選擇培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌株X，③是提取菌株X基因組，④為基因工程操作程序中“目的基因的篩選和獲取”，⑤為“基因表達(dá)載體的構(gòu)建”，⑥為“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”，⑦為從培養(yǎng)體系中分離得到重組酶。
【小問(wèn)1詳解】
選擇培養(yǎng)基是指一類(lèi)根據(jù)特定微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某理化因素抗性的原理而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。具有只允許特定的微生物生長(zhǎng)，而同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)的功能。在以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，只有能利用羧甲基纖維素鈉的微生物才能生長(zhǎng)繁殖。
剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物，使得含有纖維素的培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解時(shí)，剛果紅與纖維素的復(fù)合物無(wú)法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這個(gè)透明圈的大小直接反映了纖維素分解菌分解纖維素的能力。透明圈越大，說(shuō)明纖維素分解菌分解纖維素的能力越強(qiáng)，即菌落產(chǎn)生的纖維素酶的活性強(qiáng)、量多。
【小問(wèn)2詳解】
擴(kuò)增目的基因片段在PCR儀中進(jìn)行，因此需要耐高溫的DNA聚合酶。
【小問(wèn)3詳解】
根據(jù)圖示中酶基因與質(zhì)粒載體經(jīng)過(guò)過(guò)程⑤構(gòu)成重組質(zhì)粒，推導(dǎo)出過(guò)程⑤為基因表達(dá)載體的構(gòu)建，該過(guò)程需要限制酶和DNA連接酶。
【小問(wèn)4詳解】
大腸桿菌作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)繁殖能力強(qiáng)、生理結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境因素敏感、容易進(jìn)行遺傳操作等。
先用Ca2+ 處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，使其處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。將重組質(zhì)粒加于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。
【小問(wèn)5詳解】
不同酶的最適溫度、最適pH不同，當(dāng)溫度和pH改變時(shí)，酶促反應(yīng)速率也會(huì)受到影響。
2024 年黑龍江省普通高等學(xué)校招生選擇性考試臨考預(yù)測(cè)押題密卷-生物學(xué) A卷1. 吲哚胺-2，3-二氧酶（IDO）是一種含鐵血紅素單體蛋白，可催化色氨酸分解代謝，可能與免疫排斥反應(yīng)、病原體感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如抑郁）等有關(guān)。為研究IDO表達(dá)的相關(guān)特性，研究者構(gòu)建了一個(gè)能融合表達(dá)IDO和綠色熒光蛋白（EGFP）的質(zhì)粒IDO-EGFP-C1?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）利用PCR技術(shù)獲取IDOcDNA，過(guò)程如圖1所示，圖中①~③表示步驟，其中影響擴(kuò)增特異性的步驟是________。由圖可知，擴(kuò)增溫度設(shè)置存在差異，其中與酶無(wú)關(guān)的步驟是______。
（2）構(gòu)建融合IDO和EGFP的重組質(zhì)粒IDO-EGFP-C1（圖2中KpnI、NheI、AgeI、BglⅡ均為限制酶且指向其識(shí)別序列，KanR為卡那霉素抗性基因，ri為復(fù)制原點(diǎn)，233bp的片段為IDO基因的特有序列）。已知IDOcDNA的長(zhǎng)度為1200bp，而質(zhì)粒EGFP-C1的長(zhǎng)度為4700bp，其上EGFP的長(zhǎng)度為780bp。圖2為設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)流程（箭頭表示正確的插入方向），研究者甲認(rèn)為用引物a和引物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將產(chǎn)物用電泳鑒定，若產(chǎn)生______bp的DNA片段即可證明實(shí)驗(yàn)成功；但研究者乙認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)流程需修正，其最簡(jiǎn)單的方法是____________。
（3）重組質(zhì)粒IDO-EGFP-C1的測(cè)序。研究者乙根據(jù)其想法實(shí)施了實(shí)驗(yàn)并獲得預(yù)期的產(chǎn)物，通常還需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序?qū)Y(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，原因是_____________。
（4）轉(zhuǎn)染結(jié)果鑒定。轉(zhuǎn)染IDO-EGFP-C1質(zhì)粒的TC-1細(xì)胞中可見(jiàn)熒光蛋白表達(dá)，該過(guò)程需在培養(yǎng)基中添加______以便篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，然后提取被轉(zhuǎn)染的TC-1細(xì)胞的基因組DNA，用引物a和引物c對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3，則圖中1為含______的TC-1細(xì)胞，2、3為_(kāi)_____。
【答案】（1） ①. ② ②. ①②
（2） ①. 1013 ②. 在IDOcDNA左端插入KpnI識(shí)別序列，右端插入NheI（或AgeI、BglⅡ）的識(shí)別序列，以防止IDOcDNA反向插入質(zhì)粒
（3）電泳僅能檢測(cè)DNA片段的大小，無(wú)法確定DNA分子的堿基序列是否正確
（4） ①. 卡那霉素 ②. 重組質(zhì)粒IDO-EGFP-C1 ③. 含EGFP-C1質(zhì)粒（或空白質(zhì)粒）的TC-1細(xì)胞
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲?。虎诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測(cè)與表達(dá)。其中，基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。
2、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：
（1）原理：DNA雙鏈復(fù)制。
（2）過(guò)程：第一步：變性，加熱至90~95℃使DNA解旋；第二步：復(fù)性，降溫到55~60℃，使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA模板鏈上；第三步：延伸，加熱至70~75℃，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶從引物3'端起始互補(bǔ)鏈的合成。
【小問(wèn)1詳解】
分析圖1可知，圖中①~③表示步驟分別為變性、復(fù)性和延伸，其中影響擴(kuò)增特異性的步驟是步驟②復(fù)性，步驟②是引物與特異性擴(kuò)增的DNA模板鏈結(jié)合的過(guò)程，由圖可知，擴(kuò)增溫度設(shè)置存在差異，其中步驟①變性，加熱至90~95℃使DNA解旋，與酶無(wú)關(guān)，步驟②復(fù)性是引物與特異性擴(kuò)增的DNA模板鏈結(jié)合的過(guò)程，與酶無(wú)關(guān)。
【小問(wèn)2詳解】
根據(jù)題意和圖2可知，已知IDOcDNA的長(zhǎng)度為1200bp，而質(zhì)粒EGFP-C1的長(zhǎng)度為4700bp，其上EGPP的長(zhǎng)度為780bp。研究者甲認(rèn)為用引物a和引物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將產(chǎn)物用電泳鑒定，那么引物a和引物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的片段有IDOcDNA中長(zhǎng)度為233bp片段和EGFP的長(zhǎng)度為780bp的片段，因此產(chǎn)物用電泳鑒定后，若產(chǎn)生233+780=1013bp的DNA片段即可證明實(shí)驗(yàn)成功；但是該實(shí)驗(yàn)流程中插入的IDOcDNA兩端均為限制酶KpnI切割的序列，容易導(dǎo)致IDOcDNA反向插入，因此實(shí)驗(yàn)流程修正的方法為：在IDOcDNA左端插入KpnI識(shí)別序列，根據(jù)質(zhì)粒EGFP-C1上限制酶的識(shí)別序列，在IDOcDNA右端插入NheI（或AgeI、BglⅡ）的識(shí)別序列，這樣IDOcDNA序列左右兩端限制酶識(shí)別序列不同，可防止IDOcDNA反向插入質(zhì)粒。
【小問(wèn)3詳解】
根據(jù)題意，重組質(zhì)粒IDO-EGFP-C1的測(cè)序。根據(jù)題意，用電泳鑒定的結(jié)果僅能檢測(cè)DNA片段的大小，無(wú)法確定DNA分子的堿基序列是否正確，因此通常還需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序?qū)Y(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。
【小問(wèn)4詳解】
根據(jù)圖2可知，IDO-EGFP-C1質(zhì)粒上存在KanR為卡那霉素抗性基因，將IDO-EGFP-C1質(zhì)粒導(dǎo)入TC-1細(xì)胞中，可以利用標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，即在培養(yǎng)基中添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。然后提取被轉(zhuǎn)染的TC-1細(xì)胞的基因組DNA，用引物a和引物c對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3，引物a和引物c擴(kuò)增的產(chǎn)物為IDOcDNA中長(zhǎng)度為233bp片段，則圖3中1具有233bp的片段，233bp的片段為IDO基因的特有序列，說(shuō)明1為導(dǎo)入重組質(zhì)粒IDO-EGFP-C1的TC-1細(xì)胞，圖3中2、3不含有IDOcDNA中長(zhǎng)度為233bp片段，說(shuō)明導(dǎo)入TC-1細(xì)胞的為含EGFP-C1質(zhì)?；蚩瞻踪|(zhì)粒。
2024屆黑龍江省齊齊哈爾市三模生物試題2. 大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后，擬核DNA就會(huì)纏繞在細(xì)胞壁碎片上，靜置一段時(shí)間，質(zhì)粒分布在上清液中，利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA。用三種限制酶處理提取的產(chǎn)物，電泳結(jié)果如圖所示。下列關(guān)于質(zhì)粒的粗提取和鑒定的敘述，正確的是（ ）

A. DNA溶于酒精，可用二苯胺試劑在沸水加熱條件下鑒定DNA
B. 電泳鑒定DNA利用了DNA在電場(chǎng)中會(huì)向著它所帶電荷相同的電極移動(dòng)的原理
C. 根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒上沒(méi)有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位點(diǎn)，而有限制酶Ⅲ的切割位點(diǎn)
D. 用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒，被染色的質(zhì)粒還需要通過(guò)紫外燈照射才能看到結(jié)果
【答案】D
【解析】
【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性。 2、DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。DNA分子在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小、和構(gòu)象等有關(guān)。電泳技術(shù)可以根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小把不同的DNA分開(kāi)，雙鏈DNA分子片段長(zhǎng)度越大，在瓊脂糖凝膠電泳中移動(dòng)速率越慢。
【詳解】A、DNA不溶于酒精，可用二苯胺試劑在沸水加熱條件下鑒定DNA，A錯(cuò)誤；
B、DNA帶負(fù)電，DNA在電場(chǎng)中會(huì)向著它所帶電荷相反的電極移動(dòng)的原理，B錯(cuò)誤；
C、因?yàn)橘|(zhì)粒的本質(zhì)是環(huán)狀的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ處理后電泳只有一條條帶，可能是該質(zhì)粒上有一個(gè)切割位點(diǎn)，也可能沒(méi)有切割位點(diǎn)，C錯(cuò)誤；
D、用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒時(shí)，電泳結(jié)果中的這些條帶通常需要在紫外線下觀察和照射才能顯示出來(lái)，因此需要紫外燈照射，D正確。
故選D。
2024屆黑龍江省齊齊哈爾市三模生物試題3. 科研人員從某熱泉的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一種α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白質(zhì)工程對(duì)其進(jìn)行改造，獲得了具有更高熱穩(wěn)定性和催化效率的重組耐高溫α-淀粉酶（AmyS2）。獲取AmyS2基因后，構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程如圖所示。該過(guò)程中，將目的基因與原始質(zhì)粒A構(gòu)建成質(zhì)粒B,將質(zhì)粒B與信號(hào)肽（一段能夠引導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的肽鏈）基因構(gòu)建成質(zhì)粒C。下列分析正確的是（ ）
A. 對(duì)淀粉酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造最終要通過(guò)改造或合成基因來(lái)完成
B. 生產(chǎn)AmyS2是從預(yù)期AmyS2功能出發(fā)設(shè)計(jì)其氨基酸序列
C. 可以從導(dǎo)入質(zhì)粒C的工程菌的培養(yǎng)液中提取獲得AmyS2
D. 構(gòu)建質(zhì)粒B和C,選擇的限制酶分別是NdeI和EcRI、BamHI和Ec52 I
【答案】ABC
【解析】
【分析】1、蛋白質(zhì)工程的基本思路是：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸列→找到相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列（RNA)→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸序列（DNA)。
2、基因工程的基本操作步驟主要包括四步：目的基因的獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與表達(dá)。
【詳解】A、對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造最終要通過(guò)改造或合成基因來(lái)完成，A正確；
B、α—淀粉酶（AmyS1）的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)工程的基本思路是：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸序列（基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)，正確；
C、將質(zhì)粒B與信號(hào)肽（一段能夠引導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的肽鏈）基因構(gòu)建成質(zhì)粒C，可以從導(dǎo)入質(zhì)粒C的工程菌的培養(yǎng)液中提取獲得AmyS2，C正確；
D、若用BamH I酶進(jìn)行切割，會(huì)導(dǎo)致目的基因結(jié)構(gòu)破壞，因此選擇Nde I和EcR I，既不會(huì)破壞目的基因，也能防止目的基因片段反向連接與質(zhì)粒自身環(huán)化等問(wèn)題；根據(jù)質(zhì)粒C的結(jié)構(gòu)以及信號(hào)肽基因上的酶切位點(diǎn)可知，將質(zhì)粒B與信號(hào)肽基因構(gòu)建成質(zhì)粒C，應(yīng)選擇的限制酶是Mlu I和Ec 52Ⅰ，D錯(cuò)誤。
故選ABC。
2024屆黑龍江省齊齊哈爾市三模生物試題4. 人乳鐵蛋白廣泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量較高，對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒等有抑制作用。下圖表示利用基因工程技術(shù)構(gòu)建人乳鐵蛋白基因重組質(zhì)粒的過(guò)程（圖中Tetr表示四環(huán)素抗性基因， Ampr表示氨芐青霉素抗性基因），五種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如下表所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）要將人乳蛋白圖插入載體中，若只允許使用一種限制酶，應(yīng)選擇的限制酶是__________?；蚬こ碳夹g(shù)中通常選擇__________種限制酶進(jìn)行酶切。
（2）人乳鐵蛋白基因可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增需要引物__________（在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中選擇），連續(xù)擴(kuò)增5次后至少需要引物_________個(gè)。
（3）據(jù)圖分析，成功獲得含有人乳鐵蛋白基因的重組質(zhì)粒需要再含有____________（填“四環(huán)素”或“氨芐青霉素”）的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，然后將需要的重組質(zhì)粒導(dǎo)入牛的受精卵，再利用_________工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因小牛。
（4）檢測(cè)人乳鐵蛋白基因是否成功翻譯常采用___________技術(shù)，若___________，則表明目的基因已翻譯形成蛋白質(zhì)。
（5）對(duì)比大腸桿菌，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人乳鐵蛋白更具有優(yōu)勢(shì)，其理由是________________。
【答案】（1） ①. BamHⅠ ②. 2##兩
（2） ①. Ⅱ、Ⅲ ②. 62
（3） ①. 氨芐青霉素 ②. 胚胎
（4） ①. 抗原-抗體雜交 ②. 檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性
（5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，能夠?qū)θ巳殍F蛋白進(jìn)行加工，使人乳鐵蛋白具有生物活性
【解析】
【分析】基因表達(dá)載體的構(gòu)建使基因工程的核心步驟，表達(dá)載體元件包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。
【小問(wèn)1詳解】
要將人乳蛋白圖插入載體中，若只允許使用一種限制酶，根據(jù)人乳鐵蛋白兩端的識(shí)別序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切除相同的黏性末端，結(jié)合質(zhì)粒上的識(shí)別序列可知，只用一種酶且切除相同的黏性末端，則應(yīng)選擇的限制酶是BamHⅠ。為了避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和反向連接，基因工程技術(shù)中通常選擇2種限制酶進(jìn)行酶切，以形成不同的黏性末端。
【小問(wèn)2詳解】
引物的作用是使耐高溫DNA聚合酶從引物的3'端連接游離的脫氧核苷酸，所以引物5'端應(yīng)該于模板鏈的3'端配對(duì)，故引物應(yīng)選擇Ⅱ、Ⅲ，連續(xù)擴(kuò)增5次后至少需要引物為（25-1）×2=62個(gè)。
【小問(wèn)3詳解】
據(jù)圖分析，成功獲得含有人乳鐵蛋白基因的重組質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因，需要在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上篩選，然后將需要的重組質(zhì)粒導(dǎo)入牛的受精卵，再利用胚胎工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因小牛。
【小問(wèn)4詳解】
檢測(cè)人乳鐵蛋白基因是否成功翻譯常采用抗原-抗體雜交技術(shù)，若檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，則表明目的基因已翻譯形成蛋白質(zhì)。
【小問(wèn)5詳解】
對(duì)比大腸桿菌，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人乳鐵蛋白更具有優(yōu)勢(shì)，其理由是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，能夠?qū)θ巳殍F蛋白進(jìn)行加工，使人乳鐵蛋白具有生物活性。
2024屆東北三省四市教研聯(lián)合體高三模擬（二）生物試題5. 中國(guó)科學(xué)家領(lǐng)銜的國(guó)際團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，馴鹿能適應(yīng)極晝和極夜的環(huán)境而不會(huì)出現(xiàn)睡眠紊亂的原因是節(jié)律調(diào)控有關(guān)基因PER2發(fā)生突變，利用PCR 技術(shù)可獲取和擴(kuò)增PER2 基因，下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 研究該基因的表達(dá)及功能可為治療失眠提供方案
B. PCR 反應(yīng)每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性和延伸三步
C. DNA 聚合酶能夠從引物的5'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸
D. 一般采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來(lái)鑒定 PCR 的產(chǎn)物
【答案】C
【解析】
【分析】PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。
【詳解】A、題意顯示，馴鹿能適應(yīng)極晝和極夜的環(huán)境而不會(huì)出現(xiàn)睡眠紊亂的原因是節(jié)律調(diào)控有關(guān)基因PER2發(fā)生突變，因此研究該基因的表達(dá)及功能可為治療失眠提供方案，A正確；
B、PCR 反應(yīng)過(guò)程中的每一輪循環(huán)依次包括變性（高溫解旋）、復(fù)性（引物結(jié)合）、延伸（子鏈延伸）三步，B正確；
C、DNA 聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，C錯(cuò)誤；
D、一般采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物，按相對(duì)分子質(zhì)量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，D正確。
故選C。
2024屆東北三省四市教研聯(lián)合體高三模擬（二）生物試題6. 我國(guó)科研人員通過(guò)基因治療，成功治愈了全球首例β-地中海貧血癥患者。研究人員運(yùn)用高精準(zhǔn)變形式堿基編輯器(tBE)，對(duì)患者自體造血干細(xì)胞中的單個(gè)堿基進(jìn)行編輯，以重新激活γ-珠蛋白的表達(dá)，最終使患者血紅蛋白水平恢復(fù)正常，過(guò)程如圖1 所示。相較于圖2中基于 CRISPR 技術(shù)的β-地貧基因編輯療法，該方法見(jiàn)效更快、療效更好，且不引發(fā)患者基因組突變或片段缺失。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
（1）基因治療中通常用到AAV(腺病毒)等，AAV的作用為_(kāi)___________。
（2）據(jù)圖2分析CRISPR 技術(shù)中g(shù)RNA 起____________(填“導(dǎo)向”或“切割”)的作用。相比 CRISPR 技術(shù)(切斷雙鏈)，tBE 不需要破壞DNA 雙鏈就能對(duì)致病的堿基突變進(jìn)行校正，由此可知tBE 具有________優(yōu)點(diǎn)(寫(xiě)出1點(diǎn)即可)。
（3）為了檢測(cè)目的基因是否翻譯成γ-珠蛋白，可采用的技術(shù)為_(kāi)___________。采用自體造血干細(xì)胞編輯移植的優(yōu)點(diǎn)為_(kāi)_______________________________(寫(xiě)出1點(diǎn)即可)。
（4）欲驗(yàn)證圖1中基因治療方法對(duì)β-地中海貧血癥患者的療效，請(qǐng)寫(xiě)出大致實(shí)驗(yàn)思路。(注：使用的測(cè)量工具無(wú)需說(shuō)明，β-地中海貧血癥志愿者、健康志愿者多人)__________________
【答案】（1）作為載體將目的基因?qū)耄ㄊ荏w）細(xì)胞
（2） ①. 導(dǎo)向 ②. 高安全性、高特異性；針對(duì)單堿基進(jìn)行編輯，正常不發(fā)生錯(cuò)編或誤編的情況；見(jiàn)效更快、療效更好，且不引發(fā)患者基因組突變和片段缺失
（3） ①. 抗原-抗體雜交 ②. 不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，
（4）將生理狀態(tài)、性別、年齡等相同的β-地中海貧血癥志愿者隨機(jī)均分為甲、乙兩組，分別測(cè)量二者的血紅蛋白水平后，對(duì)甲組采用堿基編碼療法進(jìn)行治療，乙組不采用，適宜條件下生活一段時(shí)間后，分別再次測(cè)量二者的血紅蛋白水平，并與健康志愿者的血紅蛋白水平進(jìn)行比較。
【解析】
【分析】CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是由一條單鏈向?qū)NA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確切割的技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)向?qū)NA中的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割。
【小問(wèn)1詳解】
基因治療中通常用到AAV(腺病毒)等，該技術(shù)中用到轉(zhuǎn)基因技術(shù)，腺病毒AAV作為載體將目的基因?qū)耄ㄊ荏w）細(xì)胞。
【小問(wèn)2詳解】
圖2中CRISPR 技術(shù)中g(shù)RNA 起導(dǎo)向的作用，即能通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則實(shí)現(xiàn)基因中堿基的定點(diǎn)改變。相比 CRISPR 技術(shù)(切斷雙鏈)，tBE 不需要破壞DNA 雙鏈就能對(duì)致病的堿基突變進(jìn)行校正，由此可知tBE 具有高安全性、高特異性；針對(duì)單堿基進(jìn)行編輯，正常不發(fā)生錯(cuò)編或誤編的情況；見(jiàn)效更快、療效更好，且不引發(fā)患者基因組突變和片段缺失。
【小問(wèn)3詳解】
為了檢測(cè)目的基因是否翻譯成γ-珠蛋白，由于要檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在，因而可采用的技術(shù)為抗原-抗體雜交技術(shù)。
采用自體造血干細(xì)胞編輯移植的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為由于造血干細(xì)胞取自患者本身，因而在改造后的造血干細(xì)胞移植后不會(huì)發(fā)生免疫排斥，因而更安全，治療成功率高，且不需要在手術(shù)后服用免疫抑制劑。
【小問(wèn)4詳解】
本實(shí)驗(yàn)的目的是驗(yàn)證基因治療方法對(duì)β-地中海貧血癥患者的療效，自變量應(yīng)為是否進(jìn)行基因治療，因變量為血紅蛋白的含量，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為：將生理狀態(tài)、性別、年齡等相同的β-地中海貧血癥志愿者隨機(jī)均分為甲乙組，分別測(cè)量二者的血紅蛋白水平后，對(duì)甲組采用堿基編碼療法進(jìn)行治療，乙組不采用，適宜條件下生活一段時(shí)間后，分別再次測(cè)量二者的血紅蛋白水平，并與健康志愿者的血紅蛋白水平進(jìn)行比較。若甲組體內(nèi)血紅蛋白低含量高于對(duì)照組，則表明基因治療方法對(duì)β-地中海貧血癥患者的療效。
（2024屆貴州省黔東南苗族侗族自治州凱里市第一中學(xué)黃金二卷三模）7. 胰島素是治療人類(lèi)糖尿病的特效藥，傳統(tǒng)生產(chǎn)胰島素的方法是從動(dòng)物胰腺中提取。1978年，我國(guó)科學(xué)家將人胰島素基因（S）導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中，構(gòu)建基因工程菌并進(jìn)行篩選，使大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素，這是我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物，流程如圖所示。為防止目的基因與載體質(zhì)粒反向連接，選用圖中MunI和NheI兩種限制酶來(lái)切割目的基因和質(zhì)粒，但I(xiàn)NS基因的兩側(cè)無(wú)MunI和NheI兩種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)，可在PCR擴(kuò)增INS基因時(shí)增加MunI和NheI兩種限制酶的識(shí)別序列，以便構(gòu)建基因表達(dá)載體。回答下列問(wèn)題：
注：LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；否則菌落為白色。圖中限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)：EcRI：G↓AATTC、MunI：C↓AATTG、NheI：G↓CTAGC、XhI：C↓TCGAG
（1）設(shè)計(jì)引物時(shí)需要在引物的________（填“3'”或“5'”）端增加相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列。
（2）已知INS基因編碼區(qū)首端和末端（其中一條鏈）的序列為5'-AGCCCTCC…（中間核苷酸序列）…GAACCAGC-3'，下列可選用的一對(duì)引物是________（選填字母序號(hào)）。
A. 5'-GAATTCAGCCCTCC-3'
B. 5'-CAATTGAGCCCTCC-3'
C. 5'-GCTAGCGCTGGTTC-3'
D. 5'-CTCGAGGAACCAGC-3'
（3）流程中步驟③將目的基因?qū)氪竽c桿菌前，常用_________處理大腸桿菌細(xì)胞，以提高轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌，需要配制培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，配制的培養(yǎng)基采用___________法進(jìn)行滅菌。
（4）在經(jīng)步驟③處理后的大腸桿菌中進(jìn)一步分離篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒（含目的基因的質(zhì)粒）的大腸桿菌，從菌落特征的角度設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行篩選，要求寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路及預(yù)期結(jié)果______。
【答案】（1）5′ （2）BC
（3） ①. Ca2+ ②. 濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）
（4）實(shí)驗(yàn)思路：將步驟③處理后的大腸桿菌培養(yǎng)在含有氨芐青霉素和X?gal的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察平板上菌落的顏色。預(yù)期結(jié)果：若菌落呈白色，說(shuō)明大腸桿菌導(dǎo)入了重組質(zhì)粒；若菌落呈藍(lán)色，說(shuō)明大腸桿菌導(dǎo)入的是未含有目的基因的空質(zhì)粒。
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的篩選與獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增；（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等；（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣；（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要加入引物，引物與目的基因模板鏈的3′端結(jié)合，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，因此限制酶的識(shí)別序列只能添加在引物的5′端。
【小問(wèn)2詳解】
已知INS基因的編碼區(qū)的首段和末端（其中一條鏈）的序列為5′—AGCCCTCC…（中間核苷酸序列）…GAACCAGC—3′，則其互補(bǔ)鏈堿基序列為3′—TCGGGAGG…（中間核苷酸序列）…CTTGGTCG—5′。因?yàn)閮煞N引物結(jié)合在模板鏈的3′端，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在沒(méi)有添加識(shí)別序列時(shí)引物的序列為：5′—AGCCCTCC和5′—GCTGGTTC，且兩種限制酶識(shí)別序列添加在引物的5′端，所以將限制酶MunⅠ的識(shí)別序列CAATTG和限制酶NheⅠ的識(shí)別序列GCTAGC分別加在原引物的5′端，故可選用的一對(duì)引物是B：5′—CAATTGAGCCCTCC—3′和C：5′—GCTAGCGCTGGTTC—3′。
【小問(wèn)3詳解】
大腸桿菌等原核細(xì)胞一般用Ca2+處理，使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入其中。配置好的培養(yǎng)基采用濕熱滅菌法滅菌。
【小問(wèn)4詳解】
要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用菌落的特征從步驟③處理后的大腸桿菌中分離篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，分離純化微生物的方法可采用稀釋涂布平板法或平板劃線法進(jìn)行接種操作。將步驟③處理后的大腸桿菌培養(yǎng)在含有氨芐青霉素和X?gal的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察平板上菌落的顏色。由于氨芐青霉素具有殺菌作用，因此未含有目的基因的空質(zhì)粒和含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌均能在此培養(yǎng)基生存。但由于目的基因的插入質(zhì)粒，破壞了LacZ基因，導(dǎo)致LacZ基因不能編碼產(chǎn)生β?半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的X?gal物質(zhì)由于缺少β?半乳糖苷酶不能分解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，故導(dǎo)入重組質(zhì)粒（含目的基因的質(zhì)粒）的大腸桿菌菌落呈白色。
（2024屆廣西桂柳高三下學(xué)期名校聯(lián)考）8. 科研人員利用不同算法，可依據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其功能。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 將未知蛋白質(zhì)與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能
B. 通過(guò)三維結(jié)構(gòu)對(duì)比可以判斷兩個(gè)蛋白質(zhì)是否有相似的功能
C. 核苷酸序列發(fā)生突變，其編碼的蛋白質(zhì)功能就會(huì)發(fā)生改變
D. 可根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似程度判斷物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近
【答案】C
【解析】
【分析】1．蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)改造或合成基因，來(lái)改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)生產(chǎn)和生活的需求。
2．蛋白質(zhì)工程的基本思路是：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)
【詳解】A、蛋白質(zhì)的功能主要由其三維結(jié)構(gòu)決定，而其三維結(jié)構(gòu)與氨基酸序列有關(guān)。所以將未知蛋白質(zhì)與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能，A正確；
B、蛋白質(zhì)的功能主要由其三維結(jié)構(gòu)決定，所以通過(guò)三維結(jié)構(gòu)對(duì)比可以判斷兩個(gè)蛋白質(zhì)是否有相似的功能，B正確；
C、核苷酸序列發(fā)生突變，由于密碼子具有簡(jiǎn)并性，其編碼的蛋白質(zhì)功能不一定發(fā)生改變，C錯(cuò)誤；
D、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似程度越高，生物之間的相似性越大，親緣關(guān)系越近，因此可根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似程度判斷物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，D正確。
故選C。
（2024屆廣西桂柳高三下學(xué)期名校聯(lián)考）9. 基因工程中常采用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。某科研小組欲將某抗蟲(chóng)基因?qū)肽持参?，下列分析錯(cuò)誤的是（ ）
A. 應(yīng)該將抗蟲(chóng)基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA片段內(nèi)
B. 可以用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等單子葉植物
C. 目的基因與Ti質(zhì)粒的結(jié)合未涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
D. 轉(zhuǎn)基因是否成功，最簡(jiǎn)便的方法是觀察該植物有沒(méi)有抗蟲(chóng)性狀
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：目的基因的篩選和獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【詳解】A、農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，因此應(yīng)該將抗蟲(chóng)基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA片段內(nèi)，A正確；
B、若在單子葉植物的傷口處涂抹酚類(lèi)化合物，則可以用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等單子葉植物，B正確；
C、目的基因的黏性末端與質(zhì)粒的黏性末端依賴(lài)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則連接在一起，C錯(cuò)誤；
D、轉(zhuǎn)基因是否成功，最簡(jiǎn)便的方法是從個(gè)體水平上觀察該植物有沒(méi)有抗蟲(chóng)性狀，D正確。
故選C。
（2024屆貴州省貴陽(yáng)一中聯(lián)考模擬預(yù)測(cè)）10. 某科研團(tuán)隊(duì)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗除草劑基因?qū)敫仕{(lán)，過(guò)程如圖所示，①～④為操作步驟，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcRⅠ酶切位點(diǎn)唯一。其中BamHⅠ與EcRⅠ之間的距離為20kb，BamHⅠ與BglⅡ之間的距離為25kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcRⅠ識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖。請(qǐng)回答：
BamHⅠ：—G↓GATCC— BglⅡ：—A↓GATCT— EcRⅠ：—G↓AATTC—
（1）常用特異性地?cái)U(kuò)增抗除草劑基因的方法是PCR，每次循環(huán)一般分為“變性→__________”三步。
（2）啟動(dòng)子的功能是__________。
（3）步驟①應(yīng)選擇限制酶__________切割農(nóng)桿菌質(zhì)粒。步驟④的培養(yǎng)基中應(yīng)添加__________，以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)植株，原因是__________。
（4）經(jīng)檢測(cè)，部分轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株細(xì)胞中的目的基因不能表達(dá)，科研團(tuán)隊(duì)對(duì)此現(xiàn)象的觀點(diǎn)是：目的基因存在正向與反向兩種連接方式。用__________酶對(duì)步驟①獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行切割，通過(guò)凝膠電泳分析產(chǎn)物大小，若出現(xiàn)__________條電泳條帶，則說(shuō)明科研團(tuán)隊(duì)的觀點(diǎn)正確。
【答案】（1）復(fù)性→延伸
（2）RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
（3） ①. BamHⅠ ②. 潮霉素 ③. Ti質(zhì)粒T－DNA中含有潮霉素抗性基因
（4） ①. BamHⅠ和EcRⅠ ②. 四
【解析】
【分析】分析題圖：①為基因表達(dá)載體構(gòu)建，②為將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，③為農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，④為植物組織培養(yǎng)。
【小問(wèn)1詳解】
利用PCR擴(kuò)增目的基因，每次循環(huán)一般分為“變性→復(fù)性→延伸” 三步。
【小問(wèn)2詳解】
啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
【小問(wèn)3詳解】
由圖可知：目的基因的一側(cè)和質(zhì)粒中都含有BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，因此步驟①應(yīng)選擇限制酶BamHⅠ切割農(nóng)桿菌質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒的T－DNA中含有潮霉素抗性基因，因此在步驟④的培養(yǎng)基中需要添加潮霉素，以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)植株。
【小問(wèn)4詳解】
由圖可知：用BamHⅠ酶和BglⅡ酶切割得到的黏性末端相同，均為-GATC，因此剪切后的目的基因能與質(zhì)粒連接在一起。在構(gòu)建的重組質(zhì)粒中，不再有BglⅡ酶的識(shí)別位點(diǎn)，但含有BamHⅠ和EcRⅠ酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)與目的基因正向和反向連接方式有關(guān)（見(jiàn)圖）。

若只選一種酶切割基因表達(dá)載體，無(wú)論目的基因正向連接還是反向連接，均只得到長(zhǎng)度180＋25＋20＝225kb的DNA，無(wú)法區(qū)分目的基因正向連接還是反向連接。若選用BamHⅠ和EcRⅠ酶切割，目的基因正向連接的重組質(zhì)粒被切成180kb、45kb的兩種DNA片段，目的基因反向連接的重組質(zhì)粒被切成205kb、20kb兩種DNA片段，所以電泳應(yīng)出現(xiàn)四條條帶。
(廣東省汕頭市某校2023-2024學(xué)年高三下學(xué)期三模)11. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，以便于重組和篩選。已知限制酶I的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。據(jù)圖判斷，下列操作正確的是（ ）
A. 質(zhì)粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
C. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶I切割
D. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割
【答案】A
【解析】
【分析】分析題圖：限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-↓GATC-，因此限制酶Ⅱ也能作用于限制酶Ⅰ的識(shí)別序列。
【詳解】限制酶I的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-↓GATC-，可知限制酶Ⅱ能夠識(shí)別和切割限制酶Ⅰ的識(shí)別序列，目的基因的右端限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-↓GATC-，目的基因左端是限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅱ才能同時(shí)將目的基因切割下來(lái)；質(zhì)粒有GeneI和GeneⅡ表示兩種標(biāo)記基因，分別有限制酶I的識(shí)別序列和限制酶Ⅱ的識(shí)別序列，如果用限制酶Ⅱ切割，則GeneI 和GeneⅡ都被破壞，造成重組質(zhì)粒無(wú)標(biāo)記基因，用限制酶Ⅰ切割，則破壞GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以連接形成重組DNA，A正確，BCD錯(cuò)誤。
故選A。
(廣東省汕頭市某校2023-2024學(xué)年高三下學(xué)期三模)12. 下圖為DNA 分子的某一片段，其中①②③分別表示某種酶的作用部位，則相應(yīng)的酶依次為（ ）
A. DNA 連接酶、限制酶、解旋酶
B. 限制酶、解旋酶、DNA連接酶
C. 限制酶、DNA連接酶、解旋酶
D. 解旋酶、限制酶、DNA連接酶
【答案】D
【解析】
【分析】解旋酶：能使DNA分子兩條鏈之間的氫鍵斷裂，使DNA雙鏈打開(kāi)。
限制酶：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。
DNA連接酶：連接的是兩個(gè)DNA片段之間的磷酸二酯鍵。
【詳解】①處為氫鍵，是解旋酶的作用部位；②處為磷酸二酯鍵，是限制酶的作用部位；③處為兩個(gè)DNA片段的缺口，是DNA連接酶的作用部位，催化磷酸二酯鍵的形成，即D正確。
故選D。
(廣東省汕頭市某校2023-2024學(xué)年高三下學(xué)期三模)13. 目的基因和載體如果用同一種限制酶處理，連接時(shí)會(huì)出現(xiàn)正反接的情況，為鑒定篩選出的表達(dá)載體中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR后，結(jié)合電泳技術(shù)鑒定，圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，其中目的基因?yàn)殚L(zhǎng)度300bp的片段。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（ ）

A. PCR復(fù)性溫度不宜太低，避免引物錯(cuò)配和模板鏈形成雙鏈
B. 電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小、帶電量和構(gòu)象有關(guān)
C. 選取引物甲、丙，擴(kuò)增出450bp長(zhǎng)度片段時(shí)，可以說(shuō)明目的基因正接
D. 選取引物甲、乙，擴(kuò)增出400bp長(zhǎng)度片段時(shí)，可以說(shuō)明目的基因反接
【答案】C
【解析】
【分析】PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。
【詳解】A、退火是在高溫解旋后降低溫度讓引物與模板鏈結(jié)合，退火溫度不宜太低，避免引物錯(cuò)配和模板鏈形成雙鏈，A正確；
B、電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小、帶電量和構(gòu)象有關(guān)，如電泳一段時(shí)間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近，而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠(yuǎn)，B正確；
C、由于使用的引物是甲和丙，沒(méi)有與基因相應(yīng)位置配對(duì)，因此不管基因正接還是反接，均為450bp，C錯(cuò)誤；
D、選取引物甲乙，擴(kuò)增出400bp長(zhǎng)度片斷時(shí)，可以說(shuō)明目的基因反接，若正接，不能擴(kuò)增出100bp的片段，D正確。
故選C。
(廣東省汕頭市某校2023-2024學(xué)年高三下學(xué)期三模)14. 巢式PCR是指先后用外內(nèi)引物擴(kuò)增目的基因的方法。其原理為：先以比目的基因大的DNA片段為模板，用外引物（F1，R1）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量含目的基因的中間產(chǎn)物，再以擴(kuò)增后的中間產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物（F2，R2）擴(kuò)增目的基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段
B. 第二輪PCR反應(yīng)能否進(jìn)行，是對(duì)第一輪PCR反應(yīng)正確性的鑒定
C. 由于和兩套引物都互補(bǔ)的靶序列較少，該技術(shù)可大大提高擴(kuò)增的特異性
D. 如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物的復(fù)性溫度應(yīng)顯著低于內(nèi)引物
【答案】D
【解析】
【分析】PCR技術(shù)的原理是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制，需要模板、原料、能量、酶、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性、延伸三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)。引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。
【詳解】A、兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段，以便與模板互補(bǔ)配對(duì)，A正確；
B、第二輪PCR使內(nèi)側(cè)引物以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行再次擴(kuò)增，第二輪PCR反應(yīng)能否進(jìn)行，是對(duì)第一輪PCR反應(yīng)正確性的鑒定，B正確；
C、由于和兩套引物同時(shí)都互補(bǔ)的靶序列較少，該技術(shù)可大大提高擴(kuò)增的特異性 ，將需要的目的基因擴(kuò)增出來(lái)，C正確；
D、如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物復(fù)性溫度要明顯高于內(nèi)引物，使外引物先進(jìn)行反應(yīng)，D錯(cuò)誤。
故選D。
(廣東省汕頭市2024年高三二?？荚?15. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研發(fā)是加快農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的重要途徑，但轉(zhuǎn)基因食品的安全性備受關(guān)注。研究者將水稻抗蟲(chóng)基因（crylC）和雙T-DNA載體連接（圖示連接后雙T-DNA部分結(jié)構(gòu)），利用其中的“Cre/LxP”系統(tǒng)培育了安全可食用的轉(zhuǎn)基因水稻。在“Cre/LxP”系統(tǒng)中，Cre基因編碼的Cre酶可特異性識(shí)別同一DNA兩個(gè)同向的lxP序列并將兩個(gè)lxP間的序列刪除。
圖：P—啟動(dòng)子（P1為胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子；P2為綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子）
回答下列問(wèn)題：
（1）Cre酶與基因工程中的______（工具酶）作用類(lèi)似。
（2）載體中，T-DNA的作用是轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞后__________________，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表達(dá)產(chǎn)物使無(wú)色底物顯藍(lán)色）有助于雙T-DNA共轉(zhuǎn)化植株的篩選，起到基因表達(dá)載體中____________（填結(jié)構(gòu)）的作用。
（3）篩選得到雙T-DNA共轉(zhuǎn)化成功的植株T0中，hpt基因?qū)χ参锖铜h(huán)境具有潛在的危害，需設(shè)法將其刪除。先從T0植株中篩選T-DNA1和T-DNA2都是單拷貝（單個(gè)）插入的植株GH-1、GH-2和GH-3，自交后得到T1代植株進(jìn)行潮霉素抗性檢測(cè)，選擇抗性檢測(cè)為陰性植株的葉片的gus基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，產(chǎn)物的電泳結(jié)果如下圖a。（不考慮減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生互換）
①T0代中______（填編號(hào)）是T-DNA1和T-DNA2以連鎖形式在單一位點(diǎn)插入植株。
②在答題卡對(duì)應(yīng)圖b中畫(huà)出植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色體上的位置_____（注：用圓點(diǎn)·表示T-DNA1和T-DNA2在染色體上的位置）
③GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗蟲(chóng)特性但不含hpt基因的植株的比例為_(kāi)_____。這些植株自交后篩選即可獲得穩(wěn)定遺傳的種子Tx。
（4）水稻種子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。該“Cre/LxP”系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了______，培育了安全可食用的轉(zhuǎn)基因水稻。Tx種子播種后獲得的葉片______（填“具有”或“不具有”）抗蟲(chóng)的性狀。
【答案】（1）限制酶 （2） ①. 整合到染色體（細(xì)胞核）DNA ②. 標(biāo)記基因
（3） ①. GH-3 ②. ③. 3/16
（4） ①. 在胚乳中特異性刪除抗蟲(chóng)基因（外源基因/兩個(gè)lxP間的序列） ②. 具有
【解析】
【分析】基因工程又稱(chēng)基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ痰幕静僮鞑襟E主要包括四步：①目的基因的獲取；②基因表達(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測(cè)與表達(dá)。其中，基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。
【小問(wèn)1詳解】
由題干信息可知，在“Cre/LxP”系統(tǒng)中，Cre基因編碼的Cre酶可特異性識(shí)別同一DNA兩個(gè)同向的lxP序列并將兩個(gè)lxP間的序列刪除，所以Cre酶與基因工程中的限制酶作用類(lèi)似。
【小問(wèn)2詳解】
載體中，T-DNA的作用是轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞后整合到染色體（細(xì)胞核）DNA，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表達(dá)產(chǎn)物使無(wú)色底物顯藍(lán)色）有助于雙T-DNA共轉(zhuǎn)化植株的篩選，起到基因表達(dá)載體中標(biāo)記基因的作用。
【小問(wèn)3詳解】
①由題圖信息可知，對(duì)自交后得到T1代植株進(jìn)行潮霉素抗性檢測(cè)，而潮霉素抗性檢測(cè)為陰性植株，如果T-DNA1和T-DNA2以連鎖形式在單一位點(diǎn)插入植株，則對(duì)葉片的gus基因進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，電泳結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，符合GH-3植株的電泳結(jié)果。
②由題圖信息可知，先從T0植株中篩選T-DNA1和T-DNA2都是單拷貝（單個(gè)）插入的植株GH-2，再結(jié)合植株GH-2的T1代葉片gus基因電泳結(jié)果可知，抗性檢測(cè)為陰性，但植株的葉片中都含有g(shù)us基因，說(shuō)明T-DNA1和T-DNA2插入到了一對(duì)同源染色體的不同位點(diǎn)，如果插入到了兩對(duì)同源染色體的不同位置，符合自由組合定律，經(jīng)過(guò)自交后會(huì)出現(xiàn)有的葉片含有g(shù)us基因，有的葉片不含gus基因，符合GH-1的電泳結(jié)果，所以植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色體上的位置如圖：
③根據(jù)GH-1的T0代自交的后代T1植株的gus基因電泳結(jié)果可知，T-DNA1和T-DNA2插入到了兩對(duì)同源染色體的不同位置，符合自由組合定律，親本為雜合子，所以在T1植株中具有抗蟲(chóng)特性但不含hpt基因的植株的比例為3/4×1/4=3/16。
【小問(wèn)4詳解】
由題干信息可以，在“Cre/LxP”系統(tǒng)中，Cre基因編碼的Cre酶可特異性識(shí)別同一DNA兩個(gè)同向的lxP序列并將兩個(gè)lxP間的序列刪除，可以實(shí)現(xiàn)了在胚乳中特異性刪除抗蟲(chóng)基因（或外源基因或兩個(gè)lxP間的序列），培育了安全可食用的轉(zhuǎn)基因水稻。GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗蟲(chóng)特性但不含hpt基因的植株，這些植株自交后篩選即可獲得穩(wěn)定遺傳的種子Tx，所以Tx種子播種后獲得的葉片具有抗蟲(chóng)的性狀。
(2024年廣東省茂名市高三模擬測(cè)試)16. 不對(duì)稱(chēng)PCR是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法。加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱(chēng)為限制性引物，含量較多的被稱(chēng)為非限制性引物。PCR的最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。不對(duì)稱(chēng)PCR的簡(jiǎn)單過(guò)程如圖所示。假設(shè)模板DNA分子初始數(shù)量為a個(gè)，6次循環(huán)后開(kāi)始擴(kuò)增產(chǎn)生ssDNA。下列敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A. 限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)
B. 據(jù)圖可知，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列相同
C. 上述過(guò)程中子鏈分別沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸
D. 該不對(duì)稱(chēng)PCR過(guò)程中需要（26-1）a個(gè)限制性引物
【答案】C
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打開(kāi)DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開(kāi)始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。
【詳解】A、PCR擴(kuò)增時(shí)需要已知目的基因兩側(cè)的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)，A正確；
B、當(dāng)限制性引物的濃度降低，甚至基本耗盡，雙鏈 DNA 的合成速率顯著下降，此時(shí)非限制性引物將繼續(xù)引導(dǎo)單鏈 DNA 的合成，非限制性引物是與乙鏈結(jié)合，故反應(yīng)的最后階段只產(chǎn)生初始 DNA 中一條鏈的拷貝（非限制性引物引導(dǎo)合成的單鏈），最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，B正確；
C、擴(kuò)增時(shí)耐高溫DNA聚合酶將4種脫氧核苷酸連接至引物的3'端，C錯(cuò)誤；
D、PCR擴(kuò)增時(shí)引物是新子鏈的一部分，假設(shè)模板DNA分子初始數(shù)量為a個(gè)，6次循環(huán)后產(chǎn)生26個(gè)DNA分子，因此該不對(duì)稱(chēng)PCR過(guò)程中需要（26-1）a個(gè)限制性引物，D正確。
故選C。
(2024年廣東省茂名市高三模擬測(cè)試)17. 在DNA體外重組實(shí)驗(yàn)中，目的基因與載體連接形成基因表達(dá)載體時(shí)，基因表達(dá)載體是否構(gòu)建成功需要進(jìn)行篩選與鑒定?？顾幮院Y選法是一種常見(jiàn)的篩選方法，該方法實(shí)施的前提條件是載體DNA上攜帶特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，然后導(dǎo)入大腸桿菌中，并進(jìn)行篩選和鑒定，部分過(guò)程如圖1、2所示，其中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）已知限制酶PstI和BamHI識(shí)別序列和切點(diǎn)分別是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，為構(gòu)建重組質(zhì)粒，圖1中，若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，則切割pBR322應(yīng)該選擇限制酶___（填“PstI或”“BamHI”），不選擇另外一種限制酶的理由是___。
（2）在某次實(shí)際操作中，實(shí)驗(yàn)人員將外源DNA片段插入pBR322的BamHI切割位點(diǎn)處，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌中。為檢測(cè)重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行了圖2所示的實(shí)驗(yàn)。
①結(jié)合圖2階段一實(shí)驗(yàn)分析，將大腸桿菌接種到固體培養(yǎng)基上的方法是___。該培養(yǎng)基中添加了氨芐青霉素（Amp），但是能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌并不是一定導(dǎo)入了含外源DNA的重組質(zhì)粒，這是由于___。
②實(shí)驗(yàn)人員利用影印培養(yǎng)技術(shù)，將一塊無(wú)菌絲絨布接觸含有大腸桿菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印跡，然后平移并壓在含四環(huán)素（Tet）的培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)至菌落顯現(xiàn)，如圖2階段二實(shí)驗(yàn)所示。導(dǎo)入了成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落應(yīng)該從含___（填“Amp”或“Tet”）的培養(yǎng)基上獲取，理由是___。
【答案】（1） ①. PstI ②. PstI和BamHI切割DNA分子產(chǎn)生的末端不能互補(bǔ)，若選擇BamHI切割pBR322，則無(wú)法與PstI切割的外源DNA片段相互連接
（2） ①. 稀釋涂布平板法 ②. pBR322和外源DNA的重組質(zhì)粒上均含有AmpR，導(dǎo)入了pBR322或外源DNA的重組質(zhì)粒的大腸桿菌對(duì)Amp均有抗性 ③. Amp ④. 限制酶BamHI破壞了質(zhì)粒上的TetR（四環(huán)素抗性基因），因此含外源DNA的重組質(zhì)粒不能在添加了四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)
【解析】
【分析】基因工程的操作步驟：目的基因的獲??；基因表達(dá)載體的構(gòu)建；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，則切割pBR322應(yīng)該選擇限制酶PstI，不選擇另外一種限制酶的理由是PstI和BamHI切割DNA分子產(chǎn)生的末端不能互補(bǔ)，若選擇BamHI切割pBR322，則無(wú)法與PstI切割的外源DNA片段相互連接。
【小問(wèn)2詳解】
①圖示中培養(yǎng)基上菌落分布均勻，因此將大腸桿菌接種到固體培養(yǎng)基上的方法是稀釋涂布平板法。由于pBR322（空載質(zhì)粒）和含外源DNA的重組質(zhì)粒上均含有AmpR，導(dǎo)入了pBR322（空載質(zhì)粒）或含外源DNA的重組質(zhì)粒的大腸桿菌對(duì)Amp均有抗性，因此在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌并不是一定導(dǎo)入了含外源DNA的重組質(zhì)粒。
②由于限制酶BamHⅠ破壞了質(zhì)粒上的TetR（四環(huán)素抗性基因），因此含外源DNA的重組質(zhì)粒不能在添加了四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所以導(dǎo)入了成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落應(yīng)該從含Amp的培養(yǎng)基上獲取。
(甘肅省西北師范大學(xué)附屬中學(xué)2023-2024學(xué)年高三第五次診斷（三模）)18. 豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性腸道傳染病。PEDV是一種正鏈單股RNA病毒，PEDV基因組共編碼蛋白21種，這些蛋白共同協(xié)調(diào)著病毒的復(fù)制與增殖。其中Nsp10蛋白對(duì)基因組RNA合成以及病毒多聚蛋白的加工有著極其重要的作用。研究人員構(gòu)建了PEDV Nsp10基因真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探究PEDV Nsp10蛋白的生物學(xué)功能以及特性奠定一定的基礎(chǔ)。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：
（1）對(duì)于PEDV而言，基因指的是______。PEDV在細(xì)胞中的增殖過(guò)程如圖1所示。PEDV感染細(xì)胞后，其基因組既可作為_(kāi)_____翻譯出病毒特異的蛋白質(zhì)，又能夠作為模板經(jīng)過(guò)______次復(fù)制得到子代病毒的基因組。
（2）Nsp10基因不能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要經(jīng)______過(guò)程得到相應(yīng)的產(chǎn)物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了便于擴(kuò)增后的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的______（填“3'端”或“5'端”）加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是______。
（3）擴(kuò)增Nsp10基因的特異性引物分別為：
引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'，
引物Ⅱ序列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'
下表為幾種限制酶的識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖2質(zhì)粒上的，Ampr代表青霉素抗性基因，其作用是______，rl為復(fù)制原點(diǎn)，其余為限制酶切割位點(diǎn)，由此推斷切割質(zhì)粒選擇的限制酶是______。

【答案】（1） ①. 有遺傳效應(yīng)的RNA片段 ②. mRNA ③. 2
（2） ①. 逆轉(zhuǎn)錄 ②. 5'端 ③. 保證擴(kuò)增后的DNA片段與表達(dá)載體正向連接
（3） ①. 便于重組DNA分子的篩選 ②. EcRⅠ、XhⅠ
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1） 目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2） 基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子終止子和標(biāo)記基因等。（3） 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
基因是生物體遺傳的基本單位，通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，PEDV是一種正鏈單股RNA病毒，因此它的基因?yàn)橛羞z傳效應(yīng)的RNA片段，分析圖可知PEDV感染細(xì)胞后，其基因組既可作為mRNA翻譯出病毒特異的蛋白質(zhì)，又能夠作為模板經(jīng)過(guò)復(fù)制得到子代病毒的基因組，因?yàn)镻EDV是一種正鏈單股RNA病毒，因此需要2次復(fù)制才得到子代病毒的基因組。
【小問(wèn)2詳解】
Nsp10基因是RNA，不能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程得到相應(yīng)的產(chǎn)物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于DNA子鏈?zhǔn)菑囊锏?’端延伸，而且引物的3’端序列必須與模板鏈配對(duì)，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)，只能在兩條引物的5’端加上限制性酶切位點(diǎn)，常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，保證擴(kuò)增后的DNA片段與表達(dá)載體正向連接。
【小問(wèn)3詳解】
Ampr代表青霉素抗性基因，在基因表達(dá)載體中作為標(biāo)記基因存在，便于重組DNA分子的篩選。擴(kuò)增Nsp10基因的特異性引物分別為： 引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'， 引物Ⅱ序列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'，兩種引物上分別有EcRⅠ、XhⅠ的識(shí)別序列，由此推斷切割質(zhì)粒選擇的限制酶是EcRⅠ、XhⅠ。
2024屆黑龍江省部分學(xué)校高三沖刺卷（五）生物試題19. 尖孢鐮刀菌容易引起番茄枯萎癥，對(duì)農(nóng)業(yè)造成巨大損失。為研究F基因（目基因）的功能，科學(xué)家利用同源重組交換的原理對(duì)F基因敲除，分析其生物學(xué)功能及致病力。基因敲除過(guò)程是先構(gòu)建基因敲除載體，將基因敲除載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選找出基因敲除成功的受體細(xì)胞?；蚯贸砣缦聢D所示：
注：Hygr為潮霉素抗性基因；A、B為實(shí)現(xiàn)同源重組交換的序列，C、D、E、G為其他不同的基因片段；1～6為引物。
（1）選取限制酶____、____分別對(duì)F基因左右兩端A、B片段進(jìn)行酶切，并用____酶將A、B片段與潮霉素抗性基因連接，構(gòu)建目的基因敲除載體。同時(shí)需要在潮霉素抗性基因前添加啟動(dòng)子，啟動(dòng)子的作用是____。
（2）把構(gòu)建好的目的基因敲除載體導(dǎo)入尖孢鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)入成功后，將菌液放在含____的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使用的接種方法是____。在這一過(guò)程中，F(xiàn)基因與潮霉素抗性基因發(fā)生同源重組交換，與____（填減數(shù)分裂時(shí)期）的某些行為類(lèi)似。
（3）培養(yǎng)完畢，挑取單菌落提取其基因組DNA作為模板，選擇引物____進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物會(huì)結(jié)合在DNA片段的____（3'或5'）端，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)進(jìn)行電泳，如果沒(méi)有F基因條帶，則確定目的基因敲除成功。
（4）潮霉素抗性基因能夠在尖孢鐮刀菌中表達(dá)的原因是____。
【答案】（1） ①. KpnI/XhI ②. SmaI/XbaI ③. DNA連接 ④. RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，使潮霉素抗性基因能夠在尖孢鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)
（2） ①. 潮霉素 ②. 平板劃線法或稀釋涂布平板法 ③. 減數(shù)分裂Ⅰ前期
（3） ①. 引物1、2 ②. 3’
（4）生物界共用一套遺傳密碼子
【解析】
【分析】1、基因工程技術(shù)的基本步驟：①目的基因的獲?、诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測(cè)與鑒定。2、PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù) 。
【小問(wèn)1詳解】
選取限制酶KpnI/XhI對(duì)A片段進(jìn)行酶切，選取限制酶SmaI/XbaI對(duì)B片段進(jìn)行酶切。需要用DNA連接酶將A、B片段與潮霉素抗性基因連接。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，能夠使潮霉素抗性基因在尖孢鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
【小問(wèn)2詳解】
導(dǎo)入完成后，潮霉素抗性基因與F基因完成重組替換，受體細(xì)胞就具有抗潮霉素的特性，所以用潮霉素進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。得到單菌落的接種方法有平板劃線法或稀釋涂布平板法。減數(shù)分裂過(guò)程中，發(fā)生類(lèi)似于潮霉素抗性基因替換目的基因的過(guò)程，是減數(shù)分裂Ⅰ前期（或四分體時(shí)期）的互換。
【小問(wèn)3詳解】
用基因敲除成功的基因組DNA為模板，由于子鏈延伸方向是5’到3’，所以引物會(huì)結(jié)合在DNA片段的3’端。如果敲除成功，那么尖孢鐮刀菌無(wú)F基因，用引物1和2是無(wú)法擴(kuò)增出F基因的。
【小問(wèn)4詳解】
由于生物界共用一套遺傳密碼子，所以潮霉素抗性基因能夠在尖孢鐮刀菌中表達(dá)。
2024屆黑龍江省部分學(xué)校高三沖刺卷（五）生物試題20. 在鹽堿地種植的作物會(huì)受脅迫產(chǎn)生過(guò)量的有害物質(zhì)H2O2，PIP2s為某種水通道蛋白，其磷酸化水平影響H2O2的跨膜運(yùn)輸。我國(guó)的科研團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)了植物細(xì)胞中AT1基因編碼的AT1蛋白可以調(diào)節(jié)作物的耐堿性表型，其機(jī)理如圖一所示。圖二表示通過(guò)“PCR替換個(gè)別核苷酸獲得突變基因”的定點(diǎn)突變技術(shù)，且個(gè)別核苷酸差異不影響引物與模板鏈的結(jié)合?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）鹽堿環(huán)境可引起大多數(shù)作物細(xì)胞內(nèi)液滲透壓_______，吸水能力_______。圖一中植物細(xì)胞中AT1基因編碼的AT1蛋白可以調(diào)節(jié)作物的耐堿性表型，其機(jī)理為_(kāi)_____。
（2）通過(guò)PCR替換個(gè)別核苷酸誘導(dǎo)AT1基因突變時(shí)，引物_______中含有特定的突變，為防止引物相互雜交，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)反應(yīng)體系，分別加入引物對(duì)_____、______用于合成PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2；然后將PCR產(chǎn)物1和2加入無(wú)引物的PCR反應(yīng)體系得到含有點(diǎn)突變的目的基因。再用引物對(duì)________擴(kuò)增目的基因，得到大量的點(diǎn)突變目的基因。
（3）為了使擴(kuò)增的目的基因兩側(cè)能被某種限制酶酶切形成黏性末端，對(duì)引物1和引物4的要求是_____。
（4）若將點(diǎn)突變目基因?qū)朊藁?xì)胞，我國(guó)科學(xué)家自己獨(dú)創(chuàng)的方法是______。要檢測(cè)是否成功表達(dá)，可以從轉(zhuǎn)基因生物個(gè)體中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行_______雜交。
【答案】（1） ①. 上升 ②. 增強(qiáng) ③. PIP2s是一種水通道蛋白，AT1蛋白能夠抑制PIP2s蛋白的磷酸化，抑制H2O2外排
（2） ①. 2和3 ②. 1和2 ③. 3和4 ④. 1和4物種多樣性減少，群落優(yōu)勢(shì)度增大
（3）均帶有該限制酶識(shí)別序列
（4） ①. 花粉管通道法 ②. 抗原—抗體
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：(1) 目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。(2) 基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。(4) 目的基因的檢測(cè)與鑒定。
【小問(wèn)1詳解】
鹽堿環(huán)境可引起大多數(shù)作物細(xì)胞內(nèi)液滲透壓上升，吸水能力增強(qiáng)，圖一中植物細(xì)胞中PIP2s是水通道蛋白的一種，AT1蛋白能夠抑制PIP2s蛋白的磷酸化，抑制H2O2外排，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化脅迫減弱，最終死亡。
【小問(wèn)2詳解】
據(jù)圖二可知，引物2和引物3中含有特定的突變，由PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2的位置分析可知，為了防止引物相互雜交，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)反應(yīng)體系，分別加入引物對(duì)為1和2、3和4，要擴(kuò)增發(fā)生突變的目的基因，需要用能與目的基因兩側(cè)發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的引物，即引物1和4。
【小問(wèn)3詳解】
因?yàn)槟康幕騼蓚?cè)沒(méi)有某種限制酶的酶切位點(diǎn)，所以為了使擴(kuò)增的目的基因兩側(cè)能被某種限制酶酶切形成黏性末端，應(yīng)該在引物1和4均帶上該限制酶識(shí)別序列。
【小問(wèn)4詳解】
若將目的基因?qū)朊藁?xì)胞的方法很多，其中花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家自己獨(dú)創(chuàng)的。要檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)，即檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)是否合成，需要從轉(zhuǎn)基因生物個(gè)體中提取蛋白質(zhì)，可通過(guò)抗原-抗體雜交方法檢測(cè)目的基因是否表達(dá)成功。氨基酸
密碼子
賴(lài)氨酸
AAG
精氨酸
AGA
絲氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
終止
UGA
生物質(zhì)原料
降解率（%）
協(xié)同系數(shù)
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麥秸稈
7.08
603
8.19
861
26.98
74.33
114.64
玉米秸稈
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NtⅠ
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)





限制酶名稱(chēng)
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
BamHⅠ
5'-G↓GATCC-3'
EcRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
XhⅠ
5'-C↓TCGAG-3'

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