考點(diǎn)1 重組DNA技術(shù)的基本工具
1.(2023新課標(biāo),6,6分)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具,將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接,以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是( )
A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割,用E.cli DNA連接酶連接
B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA連接酶連接
C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA連接酶連接
D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.cli DNA連接酶連接
答案 C
2.(2021湖北,7,2分)限制性內(nèi)切酶EcRⅠ識別并切割雙鏈DNA,用EcRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA,理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C
3.(2021全國乙,38,15分)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶,其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
回答下列問題:
(1)常用的DNA連接酶有E.cli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中 酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA連接酶連接。上圖中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是 。
(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn),可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能 ;質(zhì)粒DNA分子上有 ,便于外源DNA插入;質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因),利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞,方法是
。
(4)表達(dá)載體含有啟動子,啟動子是指
。
答案 (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcRⅤ (2)磷酸二酯鍵 (3)自我復(fù)制 限制酶切割位點(diǎn) 將待篩選的宿主細(xì)胞接種到含該抗生素的培養(yǎng)基中,能夠生長的是含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞 (4)RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的DNA片段
考點(diǎn)2 DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
4.(2022山東,13,2分)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn),下列說法錯誤的是( )
A.過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解
B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C.在一定溫度下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
答案 B
5.【新思維】(2021山東,13,2分)粗提取DNA時,向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌,過濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過濾,在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是( )
A.加入適量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保溫10~15分鐘
C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精
D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2 ml/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14 ml/L
答案 A
6.(2023福建,4,2分)關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”(實(shí)驗(yàn)Ⅰ)和“DNA的粗提取與鑒定”(實(shí)驗(yàn)Ⅱ)的實(shí)驗(yàn)操作,下列相關(guān)敘述正確的是( )
A.實(shí)驗(yàn)Ⅰ中,PCR實(shí)驗(yàn)所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進(jìn)行高壓滅菌處理
B.實(shí)驗(yàn)Ⅰ中,將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,加樣前應(yīng)先接通電源
C.實(shí)驗(yàn)Ⅱ中,取洋蔥研磨液的上清液,加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNA
D.實(shí)驗(yàn)Ⅱ中,將白色絲狀物直接加入二苯胺試劑中并進(jìn)行沸水浴,用于鑒定DNA
答案 C
7.(2023遼寧,19,3分)(不定項(xiàng))基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶。MMP2和MMP9可以降解明膠,明膠可被某染液染成藍(lán)色,因此可以利用含有明膠的凝膠電泳檢測這兩種酶在不同條件下的活性。據(jù)圖分析,下列敘述正確的是( )
A.SDS可以提高M(jìn)MP2和MMP9活性
B.10 ℃保溫降低了MMP2和MMP9活性
C.緩沖液用于維持MMP2和MMP9活性
D.MMP2和MMP9降解明膠不具有專一性
答案 B
8.【新思維】(2022遼寧,12,2分)抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù),采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測,反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是( )
A.預(yù)變性過程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制
B.后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分
C.延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制
D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因后即可上市
答案 B
考點(diǎn)3 基因工程的基本操作程序
9.(2023湖北,4,2分)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒),并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否
D.若用SphⅠ酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
答案 D
10.(2021湖北,16,2分)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外,還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生,以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延長熱變性的時間
C.延長延伸的時間
D.提高復(fù)性的溫度
答案 D
11.【新思維】(2023山東,25,10分)科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測,該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示。其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是 。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外,作為載體,質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有 (答出2個結(jié)構(gòu)即可)。
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后,為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確,需進(jìn)行PCR檢測,若僅用一對引物,應(yīng)選擇圖甲中的引物 。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈,由此可知引物F1與圖甲中J基因的 (填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。
(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后,用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平,結(jié)果如圖乙所示。其中,出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了 ,條帶2所檢出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。
答案 (1)RNA聚合酶 標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)(或限制性酶切位點(diǎn)) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a鏈 (3)J-V5融合蛋白 不是
12.【新思維】(2022山東,25,2分)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā),蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解,藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理,需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一種短肽,連接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合,但不影響P或PΔ的功能。
(1)為構(gòu)建重組載體,需先設(shè)計引物,通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是 。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割,需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列,該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后,與編碼FLAG的序列形成一個融合基因,如圖甲所示,其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后,融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確,翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確,但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析,出現(xiàn)該問題的原因是
。修改擴(kuò)增P基因時使用的帶有EcRⅠ識別序列的引物來解決該問題,具體修改方案是 。
圖甲
(3)融合蛋白表達(dá)成功后,將FLAG-P、FLAG-PΔ、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì),分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測,檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③組結(jié)果的差異推測,藥物A的作用是 ;由②④組或③⑤組的差異推測,PΔ中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根據(jù)以上結(jié)果推測,藥物A治療該病的機(jī)理是
。
答案 (1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對、短單鏈核酸(2分) 5'端(2分) (2)P基因編碼鏈的第一個堿基與EcRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸,導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯位讀取(2分) 在引物中的EcRⅠ識別序列3'端添加1個堿基(2分) (3)增強(qiáng)FLAG-P與UBC的結(jié)合(1分) 參與P與UBC的結(jié)合(1分) (4)藥物A通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合促進(jìn)P降解(2分)
13.【新思維】(2021山東,25,12分)人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后,γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列,解除對γ基因表達(dá)的抑制,可對某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療。科研人員擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。
(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá),需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知,在F1~F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是 ,在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是 。本實(shí)驗(yàn)中,從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要 種酶。
(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白,受體細(xì)胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是 。
(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列,據(jù)此結(jié)果可推測,BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于 ,理由是
。
答案 (1)SalⅠ(2分) EcRⅠ(2分) 6(3分) (2)F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(dá)(2分) (3)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上(1分) 根據(jù)有無熒光情況判斷,F1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn),因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè));F5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點(diǎn),可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè)),所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上(2分)
14.(2023全國乙,38,15分)GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因?yàn)椴牧?利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白,豐富了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉栴}。
(1)構(gòu)建突變基因文庫?？蒲腥藛T將GFP基因的不同突變基因分別插入載體,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。通常,基因文庫是指 。
(2)構(gòu)建目的基因表達(dá)載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構(gòu)建表達(dá)載體,其模式圖如下所示(箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向)。圖中①為 ;②為 ,其作用是 ;圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因,其作用是 。
(3)目的基因的表達(dá)?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光,有的發(fā)黃色熒光,有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點(diǎn)的角度分析,發(fā)綠色熒光的可能原因是 (答出1點(diǎn)即可)。
(4)新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后,對其所含的GFP突變基因進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同,將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá),實(shí)驗(yàn)思路是 。
答案 (1)將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因 (2)終止子 啟動子 RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來 (3)密碼子的簡并性 (4)獲取YFP基因并構(gòu)建表達(dá)載體,并將其導(dǎo)入真核細(xì)胞,檢驗(yàn)其能否發(fā)出黃色熒光
15.(2023河北,22,15分)單細(xì)胞硅藻具有生產(chǎn)生物柴油的潛在價值。研究者將硅藻脂質(zhì)合成相關(guān)的蘋果酸酶(ME)基因構(gòu)建到超表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入硅藻細(xì)胞,以期獲得高產(chǎn)生物柴油的硅藻品系。
回答下列問題:
(1)根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)在特定濃度乙醇溶液中的 差異獲得硅藻粗提DNA,PCR擴(kuò)增得到目的基因。
(2)超表達(dá)載體的基本組件包括復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因、 和 等。本研究中目的基因?yàn)? 。
(3)PCR擴(kuò)增時引物通過 原則與模板特異性結(jié)合。根據(jù)表達(dá)載體序列設(shè)計了圖1所示的兩條引物,對非轉(zhuǎn)基因硅藻品系A(chǔ)和轉(zhuǎn)ME基因硅藻候選品系B進(jìn)行PCR檢測,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。其中,樣品1為本實(shí)驗(yàn)的 組,樣品2有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果表明 。
(4)利用單細(xì)胞硅藻生產(chǎn)生物柴油的影響因素包括胞內(nèi)脂質(zhì)含量和繁殖速率等。圖3為硅藻胞內(nèi)脂質(zhì)含量檢測結(jié)果。據(jù)圖分析,相對于品系A(chǔ),品系B的胞內(nèi)脂質(zhì)含量平均水平明顯 。同時,還需測定 以比較在相同發(fā)酵條件下品系A(chǔ)與B的繁殖速率。
(5)胞內(nèi)脂質(zhì)合成需要大量ATP。ME催化蘋果酸氧化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生NADH。研究表明,品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A(chǔ)。據(jù)此分析,ME基因超表達(dá)使線粒體中NADH水平升高, ,最終促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。
(6)相對于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻進(jìn)行生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)勢之處為 。(答出兩點(diǎn)即可)
答案 (1)溶解度 (2)啟動子 終止子(答案“啟動子”和“終止子”不分順序) 蘋果酸酶基因(或“ME基因”) (3)堿基互補(bǔ)配對 對照 引物間的載體序列整合到硅藻細(xì)胞基因組中(或“ME基因序列整合到硅藻細(xì)胞基因組中”) (4)增加 細(xì)胞數(shù)量 (5)有氧呼吸生成的ATP增多 (6)節(jié)約土地資源、不受季節(jié)和氣候限制(或“節(jié)約糧食資源”或“節(jié)約淡水”或“能夠通過發(fā)酵大量生產(chǎn)”)
16.(2022江蘇,24,12分)纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu),功能異常可引發(fā)多種疾病。因此,研究纖毛形成的作用機(jī)制具有重要意義。請回答下列問題。
(1)纖毛結(jié)構(gòu)如圖Ⅰ所示,由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由 組成。基體由中心體轉(zhuǎn)變而來,中心體在有絲分裂中的功能是 。
圖Ⅰ
(2)某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常,為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異,對基因X進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時,可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來,溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是 。PCR擴(kuò)增時,需在 催化下,在引物的 端進(jìn)行DNA鏈的延伸,獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測序。
(3)為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位,構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白,融合蛋白具有綠色熒光,可指示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X-GFP基因融合片段M導(dǎo)入如圖Ⅱ所示載體質(zhì)粒Y,構(gòu)建Y-M重組質(zhì)粒(在EcRⅤ位點(diǎn)插入片段)。請完成下表。
(4)為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化,采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA,經(jīng) 形成cDNA作為模板,PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,在總cDNA模板量相等的條件下,健康人Ct值為15,而病人Ct值為20(Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時的PCR循環(huán)數(shù))。從理論上估算,在PCR擴(kuò)增20個循環(huán)的產(chǎn)物中,健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的 倍。
答案 (1)脂質(zhì)和蛋白質(zhì) 發(fā)出星射線,形成紡錘體 (2)溶解DNA 耐高溫的DNA聚合酶 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④纖毛基部可能含有與X蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)(受體) (4)逆轉(zhuǎn)錄 32
考點(diǎn)4 基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程
17.(2023遼寧,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受體。為實(shí)時監(jiān)控CD163蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程,將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起(如圖),使其表達(dá)成一條多肽。該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去( )
A.CD163基因中編碼起始密碼子的序列
B.CD163基因中編碼終止密碼子的序列
C.RFP基因中編碼起始密碼子的序列
D.RFP基因中編碼終止密碼子的序列
答案 B
18.(2021遼寧,14,2分)腈水合酶(N0)廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)和醫(yī)藥原料生產(chǎn)等領(lǐng)域,但不耐高溫,利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽,可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關(guān)敘述錯誤的是( )
A.N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩(wěn)定性的原因之一
B.加入連接肽需要通過改造基因?qū)崿F(xiàn)
C.獲得N1的過程需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯
D.檢測N1的活性時先將N1與底物充分混合,再置于高溫環(huán)境
答案 D
19.(2020山東,25,11分)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉,直鏈淀粉所占比例越小糯性越強(qiáng)。科研人員將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻,實(shí)現(xiàn)了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點(diǎn)編輯,從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時,所需的酶是 ,重組載體進(jìn)入水稻細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為 。
(2)根據(jù)啟動子的作用推測,Wx基因啟動子序列的改變影響了
,從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比,3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列 (填:“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變,原因是 。
(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達(dá)的影響,科研人員需要檢測Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA,經(jīng) 過程獲得總cDNA。通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地擴(kuò)增出Wx基因的cDNA,原因是 。
(4)各品系Wx mRNA量的檢測結(jié)果如圖所示,據(jù)圖推測糯性最強(qiáng)的品系為 ,原因是 。
答案 (除注明外,每空1分)(1)限制性核酸內(nèi)切酶(限制性內(nèi)切核酸酶)和DNA連接酶 轉(zhuǎn)化 (2)RNA聚合酶與啟動子的識別和結(jié)合 不發(fā)生 編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子 (3)逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄) 引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)(2分) (4)品系3 品系3的Wx mRNA量最少,控制合成的直鏈淀粉合成酶最少,直鏈淀粉合成量最少,糯性最強(qiáng)(2分)
20.【新情境】(2023海南,20,13分)基因遞送是植物遺傳改良的重要技術(shù)之一,我國多個實(shí)驗(yàn)室合作開發(fā)了一種新型基因遞送系統(tǒng)(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,簡稱CDB法)。圖1與圖2分別是利用常規(guī)轉(zhuǎn)化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。
回答下列問題。
(1)圖1中,從外植體轉(zhuǎn)變成愈傷組織的過程屬于 ;從愈傷組織到幼苗的培養(yǎng)過程需要的激素有生長素和 ,該過程還需要光照,其作用是
。
(2)圖1中的愈傷組織,若不經(jīng)過共培養(yǎng)環(huán)節(jié),直接誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的植株可以保持植株A的 。圖1中,含有外源基因的轉(zhuǎn)化植株A若用于生產(chǎn)種子,其包裝需標(biāo)注 。
(3)圖1與圖2中,農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時,可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失會導(dǎo)致植株白化。某團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因),利用圖2中的CDB法將該重組載體導(dǎo)入植株B,長出毛狀根,成功獲得轉(zhuǎn)化植株B。據(jù)此分析,從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是 ,圖2中,鑒定導(dǎo)入幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法是 ,依據(jù)是 。
(5)與常規(guī)轉(zhuǎn)化法相比,采用CDB法進(jìn)行基因遞送的優(yōu)點(diǎn)是 (答出2點(diǎn)即可)。
答案 (1)脫分化 細(xì)胞分裂素 誘導(dǎo)葉綠素的形成,使幼苗能夠進(jìn)行光合作用 (2)遺傳特性 轉(zhuǎn)基因種子 (3)農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含Ti質(zhì)粒,當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后,能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞染色體DNA上 (4)檢測毛狀根段是否有綠色熒光 植物PDS中靶區(qū)域測序(或根據(jù)PDS基因的堿基序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增) 若導(dǎo)入幼苗的基因編輯載體成功發(fā)揮作用,則PDS基因被敲除,靶區(qū)域的測序就會出現(xiàn)序列缺失(或PCR無法擴(kuò)增出條帶) (5)不需要無菌操作、不需要進(jìn)行植物組織培養(yǎng)、操作簡便
21.(2023湖南,21,13分)某些植物根際促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用?；卮鹣铝袉栴}:
(1)若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細(xì)菌,培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)物質(zhì)包括水和 。
(2)現(xiàn)從植物根際土壤中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌H,其產(chǎn)生的抗菌肽抑菌效果見表。據(jù)表推測該抗菌肽對 的抑制效果較好,若要確定其有抑菌效果的最低濃度,需在 μg·mL-1濃度區(qū)間進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
注:“+”表示長菌,“-”表示未長菌
(3)研究人員利用解淀粉芽孢桿菌H的淀粉酶編碼基因M構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌成功構(gòu)建基因工程菌A。在利用A菌株發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶M過程中,傳代多次后,生產(chǎn)條件未變,但某子代菌株不再產(chǎn)生淀粉酶M。分析可能的原因是
(答出兩點(diǎn)即可)。
(4)研究人員通過肺上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)生成肺類器官,可自組裝或與成熟細(xì)胞組裝成肺類裝配體,如圖所示。肺類裝配體培養(yǎng)需要滿足適宜的營養(yǎng)、溫度、滲透壓、pH以及
(答出兩點(diǎn))等基本條件。肺類裝配體形成過程中是否運(yùn)用了動物細(xì)胞融合技術(shù)? (填“是”或“否”)。
(5)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是一種耐藥菌,嚴(yán)重危害人類健康?？蒲腥藛T擬用MRSA感染肺類裝配體建立感染模型,來探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力。以下實(shí)驗(yàn)材料中必備的是 。
①金黃色葡萄球菌感染的肺類裝配體
②MRSA感染的肺類裝配體
③解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽
④生理鹽水
⑤青霉素(抗金黃色葡萄球菌的藥物)
⑥萬古霉素(抗MRSA的藥物)
答案 (1)淀粉、無機(jī)鹽 (2)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 1.73~3.45 (3)M基因突變;質(zhì)粒丟失;啟動子、復(fù)制原點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵元件突變或被修飾 (4)適宜的氣體環(huán)境和無菌、無毒的環(huán)境 否 (5)②③④⑥
22.(2023廣東,20,14分)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n=10)進(jìn)行誘變,篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序,發(fā)現(xiàn)野生型DA1基因發(fā)生一個堿基G到A的替換,突變后的基因?yàn)殡[性基因,據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān),開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
回答下列問題:
(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株,若突變體表型確由該突變造成,則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與 植株的種子大小相近。
(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DA1基因,用限制性核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和 進(jìn)行切割,用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達(dá),其上下游序列需具備 。
(3)轉(zhuǎn)化后,T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時插入多個位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下,選出單一位點(diǎn)插入的植株,并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(圖1),用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。
圖1
①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交,將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上,能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了 。
②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,選擇陽性率約 %的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。
③將②中選出的T2代陽性植株 (填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,陽性率達(dá)到 %的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。
為便于在后續(xù)研究中檢測該突變,研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段,再使用限制性核酸內(nèi)切酶X切割產(chǎn)物,通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測,相關(guān)信息見圖2,在電泳圖3中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。
圖2
圖3
答案 (1)野生型 (2)基因表達(dá)載體(或質(zhì)粒,或載體) 啟動子、終止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交 100 核酸電泳圖
23.(2022湖南,22,12分)水蛭是我國的傳統(tǒng)中藥材,主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu),提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}:
(1)蛋白質(zhì)工程流程如圖所示,物質(zhì)a是 ,物質(zhì)b是 。在生產(chǎn)過程中,物質(zhì)b可能不同,合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同,原因是
。
(2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸,基因工程中獲取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增。PCR技術(shù)遵循的基本原理是 。
(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后,分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性,結(jié)果如圖所示。推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的 (填“種類”或“含量”)有關(guān),導(dǎo)致其活性不同的原因是 。
(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異,簡要寫出實(shí)驗(yàn)設(shè)計思路: 。
答案 (1)多肽鏈 mRNA mRNA上決定氨基酸的密碼子具有簡并性 (2)從基因文庫中獲取 人工合成 DNA半保留復(fù)制 (3)種類 酶處理后形成的肽中氨基酸的種類、數(shù)目和排列順序不同 (4)在相同條件下,將蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素分別進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn),比較三組血液凝固所需時間長短,所需時間越長說明其抗凝血活性越大
三年模擬
限時拔高練1
時間:25 min
一、選擇題(每題只有一個選項(xiàng)符合題意)
1.(2023師大附中模擬預(yù)測,15)下列關(guān)于基因工程及其應(yīng)用的敘述,錯誤的是( )
A.花粉管通道法可以用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
B.只要從轉(zhuǎn)基因棉花中檢測到Bt抗蟲蛋白,就代表轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育成功
C.Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔
D.干擾素是一種糖蛋白,科學(xué)家用基因工程方法從大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干擾素
答案 B
2.(2023青島三模,15)大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變進(jìn)行兩輪PCR即可獲得,第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物,第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物,如圖表示利用大引物PCR對基因M進(jìn)行定點(diǎn)誘變。下列說法錯誤的是( )
A.第一輪PCR中,至少需要2個循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板
B.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈
C.擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需具備啟動子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯
D.為了使兩輪PCR在同一支試管中進(jìn)行,設(shè)計引物時應(yīng)考慮不同的退火溫度
答案 B
3.【新情境】(2023德州三模,15)科研人員利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)和DNA芯片(chip)技術(shù)形成ChIP—n—chip技術(shù),該技術(shù)能夠根據(jù)DNA芯片中已知序列,通過DNA分子雜交快速讀取與已知蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段的堿基序列,其原理如圖所示。下列分析錯誤的是( )
A.結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段可被同一種抗體沉淀
B.熒光標(biāo)記的DNA片段變性后才能與芯片雜交
C.抗體沉淀物放入冷酒精中可沉淀分離出DNA片段
D.利用該技術(shù)能測定RNA聚合酶結(jié)合的啟動子的序列
答案 A
4.【新情境】(2024屆青島二中階段檢測,13)果蠅F基因在成體頭部細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時存在可變剪接的現(xiàn)象,即相同的mRNA前體可通過剪接將不同外顯子對應(yīng)的mRNA序列組合成不同的成熟mRNA。如圖是雌雄成體頭部細(xì)胞中剪接形成的五種成熟mRNA的序列示意圖。為驗(yàn)證F基因的轉(zhuǎn)錄存在性別差異,研究者分別提取分離成體果蠅頭部細(xì)胞的基因組DNA(gDNA)和成熟mRNA,后者逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。選取不同模板和引物的組合,雌雄個體擴(kuò)增結(jié)果不同的一組是( )
A.gDNA c2+c5 B.cDNA c1+c3
C.gDNA c1+c3 D.cDNA c2+c4
答案 D
二、選擇題(每題有一個或多個選項(xiàng)符合題意)
5.(2023山東省實(shí)驗(yàn)中學(xué)一模,20)自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花,天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖),通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中,在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。下列相關(guān)敘述錯誤的是( )
注:PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ為不同限制酶
A.上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因
B.將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.sfp和idgS基因表達(dá)時以DNA的同一條鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄
D.農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上
答案 BC
三、非選擇題
6.(2023濟(jì)南三模,25)研究發(fā)現(xiàn),MZF1-AS1是一種長鏈非編碼RNA,可以和核蛋白PARP1結(jié)合參與基因的調(diào)控,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。科研人員通過PCR技術(shù)得到PARP1基因全長序列(圖1),其編碼的蛋白質(zhì)含1 014個氨基酸、三個功能區(qū)(圖2),圖中數(shù)字代表氨基酸對應(yīng)的位置。構(gòu)建含GST標(biāo)簽的重組載體以獲得不同長度的融合蛋白。
(1)欲PCR擴(kuò)增PARP1基因的編碼區(qū),需設(shè)計一對引物F1和R1,在圖1中選出兩引物與模板結(jié)合的位置 (填圖中序號),PCR的反應(yīng)體系中需要加 酶,PCR產(chǎn)物一般通過 法鑒定。
(2)為了得到GST-PARP1融合蛋白,需構(gòu)建不同長度的帶有GST標(biāo)簽序列的PARP1基因表達(dá)載體,GST序列尾端不能含有 的序列(不考慮移碼突變);純化得到6種融合蛋白,分別與體外轉(zhuǎn)錄得到的生物素標(biāo)記的MZF1-AS1進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn),形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,該復(fù)合物可通過一定技術(shù)分離出來,將分離純化獲得的結(jié)合在復(fù)合物上的RNA,經(jīng)RT-PCR后鑒定結(jié)果如圖3所示,據(jù)圖2、3可知 。
(3)研究發(fā)現(xiàn),MZF1-AS1能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1與靶基因啟動子結(jié)合,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,MZF1-AS1和E2F1無直接相互作用,PARP1和E2F1有相互作用;將PARP1載體和E2F1載體共同轉(zhuǎn)染5組細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)E2F1含量相同。1、4組不進(jìn)行處理,2、5組MZF1-AS1基因過量表達(dá),3組MZF1-AS1基因敲除處理。將5組細(xì)胞裂解,在4、5組細(xì)胞裂解液中加入RNA酶,處理一段時間,然后分別在5組細(xì)胞裂解液中加入PARP1抗體得到沉淀,再分別利用E2F1抗體對上述沉淀中圖4的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示,據(jù)圖可知 。
(4)綜上所述,MZF1-AS1對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理是 。
答案 (1)②③ 耐高溫的DNA聚合 瓊脂糖凝膠電泳 (2)終止子和控制終止密碼子 MZF1-AS1可以與PARP1蛋白質(zhì)BRCT功能區(qū)結(jié)合 (3)過表達(dá)MZF1-AS1能促進(jìn)PARP1和E2F1兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合,敲除MZF1-AS1或者給予RNA酶處理后兩蛋白質(zhì)相互作用減弱 (4)MZF-AS1通過促進(jìn)PARP1和E2F1兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖
限時拔高練2
時間:25 min
一、選擇題(每題只有一個選項(xiàng)符合題意)
1.(2024屆江蘇揚(yáng)州中學(xué)月考,14)DNA瓊脂糖凝膠電泳是一種分離、純化或分析PCR擴(kuò)增后的待檢DNA片段的技術(shù)。下列關(guān)于核酸片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的相關(guān)敘述,正確的是( )
A.mRNA也是核酸,因此可直接用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增
B.PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加ATP,以激活耐高溫的DNA聚合酶
C.帶電量相同的情況下,相對分子質(zhì)量越大的DNA片段距離加樣孔越近
D.瓊脂糖凝膠電泳中的緩沖液中含指示劑,其可以在紫外燈下被檢測出來
答案 C
2.【新思維】(2023聊城三模,15)Cre-lxP系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)。把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識別并切割的序列(lxP1和lxP2)串在一起,構(gòu)建表達(dá)載體T(如圖2)。部分熒光蛋白基因會被Cre酶隨機(jī)“剪掉”,且兩個lxP1之間或兩個lxP2之間的基因,最多會被Cre酶敲除一次,剩下的部分得以表達(dá),隨機(jī)呈現(xiàn)不同的顏色。下列說法錯誤的是( )
A.構(gòu)建表達(dá)載體T時用到的工具酶包括限制酶、DNA連接酶
B.若小鼠細(xì)胞含一個表達(dá)載體T(不含Cre酶),其肌肉組織細(xì)胞呈無色
C.若小鼠細(xì)胞含一個表達(dá)載體T(含Cre酶),其腦組織細(xì)胞只能呈紅色或黃色
D.若小鼠細(xì)胞含兩個表達(dá)載體T(含Cre酶),其腦組織細(xì)胞可能出現(xiàn)兩種顏色
答案 C
二、選擇題(每題有一個或多個選項(xiàng)符合題意)
3.(2023青島三模,20)20世紀(jì)70年代,Frederick Sanger發(fā)明了雙脫氧終止法對DNA進(jìn)行測序。其原理如圖,在4支試管中分別加入4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)和1種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP);ddNTP可以與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點(diǎn),并終止DNA片段的延伸。在4支試管中DNA鏈將會分別在A、G、C及T位置中止,并形成不同長度的DNA片段。這些片段隨后可被電泳分開并顯示出來。下列說法中錯誤的是( )
A.這種測序方法需要引物和耐高溫的DNA聚合酶
B.電泳圖譜中的箭頭所指的DNA片段以鳥嘌呤結(jié)尾
C.題圖中測得的未知DNA的序列為5'-GATTCGAGCTGA-3'
D.ddNTP與dNTP競爭的延長位點(diǎn)是核苷酸鏈的3'末端
答案 C
4.(2024屆章丘一中階段測試,20)大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后,擬核DNA就會纏繞在細(xì)胞壁碎片上,靜置一段時間,質(zhì)粒分布在上清液中。利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA。下列關(guān)于質(zhì)粒的粗提取和鑒定的分析錯誤的是( )
A.提取DNA時可加入酒精,使不溶于酒精的蛋白質(zhì)等物質(zhì)析出
B.將提取的DNA溶于0.14 ml/L NaCl溶液后,可用二苯胺試劑在沸水浴條件下鑒定
C.溶菌酶能溶解大腸桿菌細(xì)胞壁,洗滌劑能瓦解其細(xì)胞膜,但對DNA沒有影響
D.用限制酶Ⅰ和Ⅱ分別處理提取的產(chǎn)物,電泳出現(xiàn)如圖結(jié)果,說明未提取到質(zhì)粒
答案 ABD
三、非選擇題
5.(2023山東省實(shí)驗(yàn)中學(xué)二模,25)抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的推廣可有效減輕除草勞動強(qiáng)度,提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。圖1為抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的技術(shù)流程。
(1)構(gòu)建含除草劑抗性基因的表達(dá)載體,傳統(tǒng)的方法是目的基因通過 酶與載體進(jìn)行重組。另外,可通過 技術(shù)在目的基因兩側(cè)添加相應(yīng)限制酶識別序列,以便構(gòu)建表達(dá)載體。
(2)科研人員研發(fā)了新的DNA重組方法——無縫克隆In-Fusin技術(shù),如圖2所示。In-Fusin酶能夠識別任何具有相同15 bp末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端,據(jù)此實(shí)現(xiàn)目的基因和載體的連接。和傳統(tǒng)方法比,無縫克隆In-Fusin技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是 。
①應(yīng)用以上方法構(gòu)建含有A基因和GUS基因的重組DNA分子時,首先獲得了圖3中的3種DNA分子,然后混合進(jìn)行In-Fusin反應(yīng)。
圖3 利用In-Fusin技術(shù)構(gòu)建含A和GUS的表達(dá)載體
如果引物2上額外添加的片段與GUS基因e片段(圖中加粗表示)序列相同,那么引物1和引物4上額外增加的片段分別與載體中的片段(圖中加粗表示) 、 相同。完成重組反應(yīng)后,將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。
②為篩選成功轉(zhuǎn)入目標(biāo)重組DNA分子的菌落,可以選取引物 擴(kuò)增目的基因并電泳檢測。
(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織時,常用含除草劑的選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織。但愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌,導(dǎo)致未成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長。針對上述現(xiàn)象,可以在選擇培養(yǎng)基中同時加入 進(jìn)行篩選,其中周圍的培養(yǎng)基 (填“顯”或“不顯”)藍(lán)色的愈傷組織是轉(zhuǎn)化成功的,原因是 。
答案 (1)限制酶、DNA連接 PCR (2)插入位點(diǎn)不受限制酶識別序列限制,實(shí)現(xiàn)了目的基因在載體任意位點(diǎn)上的插入 ①a(或d) d(或a) ②1、4 (3)無色物質(zhì)K 顯 轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織中,GUS基因正確表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物能催化培養(yǎng)基中的無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色;農(nóng)桿菌中的GUS含有內(nèi)含子,其轉(zhuǎn)錄后序列不能被切除,不能正確表達(dá),不能催化培養(yǎng)基中的無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色
考法綜合練
1.【新思維】(2024屆浙江百校起點(diǎn)開學(xué)考試,12)鐮狀細(xì)胞貧血是一種單基因遺傳病,由正常血紅蛋白基因(HbA)突變?yōu)殓牋罴?xì)胞貧血基因(Hbs)引起,HbA和Hbs的某片段如圖甲。對胎兒基因檢測的主要原理是:MstⅡ限制酶處理擴(kuò)增后的DNA;加熱使酶切片段解旋,用熒光標(biāo)記的CTGACTCCT序列與其雜交;凝膠電泳分離。圖乙是凝膠電泳后熒光出現(xiàn)的三種可能性。下列敘述錯誤的是( )
A.提取胎兒DNA樣品后,擴(kuò)增DNA需要添加dNTP和特定的引物
B.用MstⅡ限制酶處理DNA不充分,可能把正常人誤判為攜帶者
C.若某胎兒檢測結(jié)果為圖乙b,則該胎兒為鐮狀細(xì)胞貧血患者
D.熒光標(biāo)記序列越長,圖乙c中兩個DNA條帶間的距離越大
答案 D
2.(2024屆齊魯名校聯(lián)合質(zhì)量檢測,15)研究人員通過PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pDNR-LIB中的sacB基因,該基因的產(chǎn)物對蔗糖敏感,是一種常見的反選擇標(biāo)記基因。TetR是四環(huán)素抗性基因,利用基因工程將sacB基因插入質(zhì)粒pAH162上,構(gòu)建含有TetR-sacB雙重選擇系統(tǒng)的重組質(zhì)粒,即pAH162-sacB,具體過程如圖所示。將pAH162-sacB導(dǎo)入大腸桿菌驗(yàn)證其雙重選擇作用。下列分析錯誤的是( )
A.將sacB基因插入pAH162上需要的限制酶是BamHⅠ、EcRⅠ
B.需用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞使其能主動吸收周圍環(huán)境中的DNA分子
C.為保證正向連接,PCR時應(yīng)在sacB基因上游引物的5'端添加BamHⅠ識別序列
D.大腸桿菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長說明雙重選擇系統(tǒng)的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功
答案 D
3.【新情境】(2023日照三模,25)原核生物和真核生物基因組中大片段DNA的定向整合擁有廣闊的應(yīng)用前景。但目前細(xì)菌中的定向整合系統(tǒng)存在諸多不足,如整合效率偏低,缺乏有效的篩選標(biāo)記物,可整合的片段大小有限等。研究者在原有細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)基礎(chǔ)上嘗試構(gòu)建了CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng),以期改善上述缺陷。
(1)Cas蛋白是一種crRNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶,可催化 (化學(xué)鍵名稱)水解,剪切特定雙鏈DNA片段。crRNA是一種短鏈RNA,它一端可與Cas蛋白結(jié)合,另一端通過 原則與目標(biāo)DNA序列結(jié)合。
(2)轉(zhuǎn)座子(Tn)是一段特殊的DNA片段。轉(zhuǎn)座酶A和轉(zhuǎn)座酶B相互結(jié)合后可將Tn從原有的DNA鏈上切下,并將其整合到其他DNA片段上。為了使轉(zhuǎn)座子定向整合到特定位點(diǎn),將PCR擴(kuò)增得到的Cas基因和轉(zhuǎn)座酶A基因形成融合基因,并進(jìn)一步構(gòu)建圖1所示的CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)。
為構(gòu)建圖示的CRISPR RNA-guided系統(tǒng),需要先設(shè)計引物,通過PCR特異性擴(kuò)增Cas基因、轉(zhuǎn)座酶基因等。用于擴(kuò)增Cas基因的引物需滿足的條件是 。構(gòu)建時,應(yīng)將翻譯終止序列設(shè)置在Cas基因和轉(zhuǎn)座酶A基因之后而不是設(shè)置在兩者之間,目的是 。
(3)研究人員利用一定的方法將獲得的CRISPR RNA-guided系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌,統(tǒng)計并計算轉(zhuǎn)座子定向整合的效率,結(jié)果如圖2所示。
圖2
①該結(jié)果表明,轉(zhuǎn)座子的定向整合效率高低與轉(zhuǎn)座子整合方向密切相關(guān)。為保證轉(zhuǎn)座子連接方向與預(yù)期相同,構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程中,對切割轉(zhuǎn)座子和切割載體的限制酶的要求是 。
②該結(jié)果還可表明,CRISPR RNA-guided系統(tǒng)能夠有效解決篩選標(biāo)記物缺乏的問題,依據(jù)是 。
答案 (1)磷酸二酯鍵 堿基互補(bǔ)配對 (2)兩種引物分別與Cas基因兩條鏈3'端的堿基序列互補(bǔ)配對 讓Cas蛋白和轉(zhuǎn)座酶A形成融合蛋白,便于Cas蛋白引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶定位到crRNA所結(jié)合的DNA附近,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的定向整合 (3)①利用兩種不同的限制酶切割轉(zhuǎn)座子和載體,且保證黏性末端的連接方向與預(yù)期相同 ②RL方向的定向整合效率接近100%,無需再用標(biāo)記物進(jìn)行篩選
4.(2023煙臺模擬,25)血凝素基因(HA)編碼的血凝素是構(gòu)成流感病毒囊膜纖突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2兩個亞單位,其中HA1含有病毒與受體相互作用的位點(diǎn)。IgGFc基因片段(長度為717 bp)編碼人IgG抗體中的一段小肽,常作為融合蛋白標(biāo)簽。蛋白質(zhì)分泌依賴于信號肽的引導(dǎo),本研究中用信號肽IL-2SS代替HA自身信號肽,科研人員嘗試構(gòu)建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表達(dá)載體,并導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)和分泌。
(1)本實(shí)驗(yàn)中信號肽IL-2SS的作用是 ,PCR擴(kuò)增目的基因時應(yīng)該選擇圖中引物 。設(shè)計引物時,不能包含HA1的終止密碼子的編碼序列,原因是 。
(2)應(yīng)選擇限制酶 來切割質(zhì)粒A,然后直接將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒A混合,同時加入 酶,使得目的基因與質(zhì)粒A相連。
(3)若目的基因與質(zhì)粒A正向連接,HA1基因轉(zhuǎn)錄時的模板鏈?zhǔn)怯蓤D中的引物 (填“a”“b”“c”或“d”)在PCR時延伸而成的;若目的基因與質(zhì)粒A反向連接,用BamHⅠ和SacⅠ同時切割重組質(zhì)粒,完全酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,其中最靠近加樣孔的條帶長度約為 bp。
(4)融合蛋白中的標(biāo)簽蛋白有利于目的蛋白的分離和純化,基因工程生產(chǎn)HA1作為疫苗時,選擇人IgGFc作為標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)還有 。
答案 (1)使融合蛋白分泌到大腸桿菌細(xì)胞外 b、c 防止IgGFc基因不能表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生的HA1上不含IgGFc標(biāo)簽 (2)EcRⅤ T4 DNA連接 (3)c 5 181 (4)降低免疫排斥反應(yīng)
分步實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)
簡易操作、結(jié)果、分析
PCR鑒定正向重組質(zhì)粒Y-M
①選擇圖Ⅱ引物 ;②PCR目的產(chǎn)物約為 bp
確保M及連接處序列正確
③質(zhì)粒測序,圖Ⅲ中正確的是 (選填序列編號)
檢測融合蛋白定位
④對照質(zhì)粒Y-GFP(僅表達(dá)GFP)與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y-M分別導(dǎo)入細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)對照組整個細(xì)胞均有綠色熒光而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部,說明
測試菌
抗菌肽濃度(μg·mL-1)
55.20
27.60
13.80
6.90
3.45
1.73
0.86
金黃色葡
萄球菌
-
-
-
-
-
+
+
枯草芽
孢桿菌
-
-
-
-
-
+
+
禾谷鐮
孢菌
-
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假絲酵母
-
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