（第Ⅰ卷）
一、單項(xiàng)選擇題：本題共19個(gè)小題，每小題2分，共38分。在每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中，只有一項(xiàng)是符合題目要求的。
1. 下圖表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建中的作用，下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A. 限制酶沿識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA兩條鏈切開
B. 在圖1和圖2中將分別產(chǎn)生4個(gè)和2個(gè)粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之間的磷酸二酯鍵和氫鍵
D. 圖示中酶1、酶2和酶3可以為不同種類的限制酶
2. 下圖是幾種限制酶的切割位點(diǎn)，下列說法正確的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通過E．cliDNA連接酶相互連接
B. DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成
C. 所有限制酶識別序列均由6個(gè)核苷酸組成
D. SmaI切割后產(chǎn)生的是黏性末端
3. T4 DNA連接酶可將任意2個(gè)具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應(yīng)過程需消耗ATP，其水解產(chǎn)生的腺苷一磷酸（AMP）通過共價(jià)鍵與酶相連，隨后AMP轉(zhuǎn)移至DNA片段，進(jìn)而完成連接反應(yīng)。下列敘述正確的是（ ）
A. T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無專一性
B. T4 DNA連接酶催化反應(yīng)后，其組成成分已改變
C. ATP在該反應(yīng)過程中可能打開兩個(gè)特殊的化學(xué)鍵
D. T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
4. 科研人員以抗四環(huán)素基因?yàn)闃?biāo)記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細(xì)胞貧血癥。下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、啟動子、終止子、抗四環(huán)素基因等元件來構(gòu)建基因表達(dá)載體
B. 利用正常小鼠DNA分子通過PCR克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列
C. 用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β-珠蛋白編碼序列的大腸桿菌
D. 將β-珠蛋白基因表達(dá)載體導(dǎo)入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中
5. 如圖表示利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)制備山羊乳腺生物反應(yīng)器的流程圖，目的是從轉(zhuǎn)基因山羊的乳汁中獲得人乳鐵蛋白。已知細(xì)胞甲是來自雌山羊的胚胎成纖維細(xì)胞，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）

A. 完成圖中①過程用到了質(zhì)粒、限制酶和DNA連接酶等
B. 篩選出的細(xì)胞乙是含有目的基因的胚胎成纖維細(xì)胞
C. 該重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚時(shí)需要進(jìn)行DNA分析以鑒定性別
D. 圖示流程中，②④⑤過程都用到了顯微操作技術(shù)
6. 噬菌體展示技術(shù)是將編碼某蛋白質(zhì)的基因?qū)胧删w的DNA中，使該外源基因隨噬菌體外殼蛋白表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。以下對該技術(shù)分析正確的是（ ）
A. 噬菌體展示技術(shù)的遺傳學(xué)原理是基因突變
B. 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時(shí)需使用限制酶和DNA酶
C. 需用營養(yǎng)成分齊全的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)噬菌體
D. 可利用抗原—抗體雜交技術(shù)篩選目標(biāo)蛋白
7. 將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導(dǎo)入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿海水稻新品種。下圖PCR擴(kuò)增OsMYB56時(shí)需要添加引物，應(yīng)選用引物組合為（ ）

A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
8. 下圖為采用“實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(即將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增)”技術(shù)檢測2019nCV核酸的基本流程，1～2h內(nèi)即可得到檢測結(jié)果。有關(guān)說法正確的是（ ）

A. 過程①是逆轉(zhuǎn)錄過程，不屬于中心法則的內(nèi)容
B. 過程②表示擴(kuò)增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 熒光標(biāo)記法還可以用于探究DNA的復(fù)制方式
D. RT-PCR反應(yīng)體系中加入的原料是脫氧核苷酸
9. 食物中的生物胺會引起胃腸道不適和過敏等不良反應(yīng)，微生物來源的多銅氧化酶(MCO)能高效分解生物胺?？蒲腥藛T采用PCR技術(shù)獲得發(fā)酵乳酸桿菌的MCO基因，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。若目的基因MCO經(jīng)限制酶切開后的末端如圖甲，要MCO片段能與載體質(zhì)粒pCLY15(圖乙)高效連接，需用于切割的酶組合為（ ）

A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
10. 霍亂是因感染霍亂弧菌引起的一種傳染性非常強(qiáng)的消化道疾病，患者往往上吐下瀉，甚至死亡。研究人員通過基因工程改變大米的蛋白質(zhì)構(gòu)成，使其攜帶一種叫“霍亂毒素B”的物質(zhì)，該物質(zhì)進(jìn)入人體后，能促進(jìn)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有效預(yù)防霍亂的感染。下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 大米中攜帶的霍亂毒素B相當(dāng)于抗原，能激發(fā)人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)
B. 該項(xiàng)研究成功的標(biāo)志是人體產(chǎn)生相應(yīng)的記憶細(xì)胞和針對霍亂毒素B的特異性抗體
C. 當(dāng)接種者再次接觸抗原時(shí)，體內(nèi)記憶細(xì)胞會迅速分泌大量抗體，與抗原特異性結(jié)合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重組的原理，效果明顯，可造福世界人民
11. 科學(xué)家利用基因工程培育出了能產(chǎn)生乙肝病毒蛋白質(zhì)的西紅柿，被稱之為“西紅柿乙肝疫苗”。具體操作是：將乙肝抗原基因M導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后利用農(nóng)桿菌將M導(dǎo)入西紅柿細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)顯示小白鼠連續(xù)五周吃這樣的西紅柿，體內(nèi)產(chǎn)生了抗乙肝病毒的抗體，下列敘述錯(cuò)誤的（ ）
A. 實(shí)驗(yàn)用PCR技術(shù)對M基因進(jìn)行擴(kuò)增，需要兩種引物
B. 含M的重組Ti質(zhì)粒必須插入到西紅柿染色體DNA上
C. 即使M在西紅柿中成功表達(dá)，也要做個(gè)體生物學(xué)水平鑒定
D. 西紅柿乙肝疫苗成本相對較低且易于儲存
12. PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5'端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP是DNA合成的原料，還可供能。下列相關(guān)說法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個(gè)環(huán)節(jié)的低
B. 引物的設(shè)計(jì)要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高溫Taq酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈
D. 1個(gè)循環(huán)后，子代DNA雙鏈的脫氧核苷酸數(shù)量相同
13. 幽門螺桿菌（Hp）感染會引發(fā)胃炎、消化性潰瘍等多種疾病。研究人員將Hp的Ipp20基因作為目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通過基因工程制備相應(yīng)的疫苗，質(zhì)粒及操作步驟如圖所示。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）

A. Ipp20基因整合到大腸桿菌的DNA中屬于基因重組
B. 基因表達(dá)載體導(dǎo)入之前，可用Ca2+處理大腸桿菌
C. 培養(yǎng)基A中添加了氯霉素，培養(yǎng)基B中添加了潮霉素
D. 能用來生產(chǎn)Hp疫苗的大腸桿菌在菌落3和5中
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實(shí)時(shí)監(jiān)控CD163蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起（如下圖），使其表達(dá)成一條多肽。該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去（ ）

A. CD163基因中編碼起始密碼子的序列
B. CD163基因中編碼終止密碼子序列
C. RFP基因中編碼起始密碼子的序列
D. RFP基因中編碼終止密碼子的序列
二、多項(xiàng)選擇題：本題共4小題，每小題3分，共12分。在每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中，有兩個(gè)或兩個(gè)以上選項(xiàng)符合題目要求。全部選對得3分，選對但不全的得1分，有選錯(cuò)的得0分。
15. 限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（ ）
A. DNA連接酶能將單個(gè)核苷酸加到已有核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
B. 限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
C. E.cliDNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端
D. 限制酶主要從原核生物中分離純化而來，不能剪切自身的DNA
16. 人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補(bǔ)作用。干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程。①?④表示相關(guān)的操作， EcR I 、BamHI為限制酶，它們的識別序列及切割位點(diǎn)如 下表所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A. 過程①所需的兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列有利于后續(xù)操作
B. 構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制
C. 過程③利用的是T-DNA的特性將目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中
D. 過程④需控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細(xì)胞發(fā)生再分化
17. RT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。下圖是RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉(zhuǎn)錄過程，③是PCR過程。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是（ ）

A. 該技術(shù)可用來檢測新冠病毒等RNA病毒
B. 該技術(shù)可用來檢測組織細(xì)胞中基因是否轉(zhuǎn)錄
C. ①過程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，③過程需要的酶是耐高溫的DNA聚合酶
D. ③過程中DNA解鏈后，應(yīng)升高反應(yīng)體系溫度使引物與模板結(jié)合
18. 科研人員將釀酒酵母質(zhì)粒上的丙酮酸脫氫酶基因（PD）替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因（LPG），可獲得乳酸乙酯（白酒香味的主要來源）高產(chǎn)菌株，過程如圖。下列分析合理的是（ ）

A. 轉(zhuǎn)入的LPG基因表達(dá)產(chǎn)物不能影響釀酒酵母的活性
B. LPG基因替換質(zhì)粒上的PD基因需要兩端攜帶相同基因片段
C. 標(biāo)記基因Ampr可檢測是否成功構(gòu)建乳酸乙酯高產(chǎn)菌株
D. 可以利用PCR技術(shù)篩選含有LPG基因的受體細(xì)胞
（第Ⅱ卷）
三、綜合題：共4題，每題15分，共60分。
19. 葉用萵苣（如生菜）是大眾喜愛蔬菜，夏季高溫極易引起先期抽苔造成減產(chǎn)，泛素連接酶（LsE3）是研究人員在萵苣高溫抽苔植株中篩選得到的。LsE3基因受溫度調(diào)控，影響萵苣抽苔，但是LsE3基因作用機(jī)制尚不清楚。研究人員用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建萵苣LsE3基因的表達(dá)載體用于研究其分子機(jī)理。無縫克隆技術(shù)是構(gòu)建表達(dá)載體的一種技術(shù)如圖2。

（1）目的基因獲取，在_____條件下，提取先期抽苔萵苣細(xì)胞中_____，經(jīng)_____獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LsE3基因。PCR擴(kuò)增除了圖1標(biāo)出的物質(zhì)以外，還需加入_____（至少寫兩種）。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中需要兩種引物F（左側(cè)）、R（右側(cè)）選用_____（選項(xiàng)中為引物部分序列，方向?yàn)?'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表達(dá)載體構(gòu)建，近年來新一代無縫克隆技術(shù)發(fā)展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成為目前研究的熱點(diǎn)。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技術(shù)（如圖2）。 T4 DNA 聚合酶在反應(yīng)體系中沒有添加dNTP情況下具有 3'→5'外切酶活性；在反應(yīng)體系中添加dNTP情況下具有5'→3'聚合酶活性；在反應(yīng)體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時(shí)，外切酶活性和聚合酶活性同時(shí)發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應(yīng)，產(chǎn)生指定長度的單鏈黏性末端。請結(jié)合圖1和圖2回答下列問題：
①LIC技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，圖1中利用PCR擴(kuò)增LsE3基因，反應(yīng)液中加入T4 DNA聚合酶和_____處理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質(zhì)粒獲得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____處理質(zhì)粒。處理后將兩者混合、退火并導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)完成重組克隆。
②LIC技術(shù)依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術(shù)，后經(jīng)過多次改進(jìn)，Qi等建立了RQ-SLIC技術(shù)，用EcRⅤ酶切割質(zhì)粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當(dāng)時(shí)間，將混合物加熱到72℃，目的是_____，緩慢降溫（退火）后移入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)形成完整重組質(zhì)粒，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)過程中用到_____酶。
（3）導(dǎo)入受體細(xì)胞，取葉用萵苣幼芽經(jīng)_____（過程）形成愈傷組織備用，用_____處理農(nóng)桿菌后導(dǎo)入重組質(zhì)粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入_____植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出成功導(dǎo)入質(zhì)粒的植物細(xì)胞。
20. CD3D嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突變引起的，該突變阻止了T細(xì)胞生長發(fā)育所需的CD3D蛋白的合成?？蒲腥藛T對第3代CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行改造，獲得一種超精確的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），該系統(tǒng)主要由向?qū)gRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶組成，作用機(jī)制如圖1。利用該系統(tǒng)在CD3D-SCID患者的造血干細(xì)胞中可以更正約71.2%的致病突變。

（1）研究發(fā)現(xiàn)，Cas9切口酶催化雙鏈DNA___鍵水解，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸堿基互補(bǔ)配對，據(jù)此推測，至少通過___次DNA復(fù)制可以完成修復(fù)。
（2）sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補(bǔ)配對的特殊序列，由23個(gè)連續(xù)堿基組成。sgRNA設(shè)計(jì)是否合理，對于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的切割有重要影響，否則會導(dǎo)致sgRNA脫靶，試分析其原因是___。
（3）為了對改造后的CD3D基因進(jìn)行研究，把CD3D基因和His標(biāo)簽基因（His標(biāo)簽由6個(gè)組氨酸組成）連接起來構(gòu)建融合基因，并構(gòu)建重組基因表達(dá)載體，圖2為載體、CD3D基因的結(jié)構(gòu)、不同限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)，欲將標(biāo)簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，已知組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG。

①PCR的一般過程為___，在變性之前通常有預(yù)變性，其目的是___。判斷是否擴(kuò)增出DNA片段，判斷的依據(jù)是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及___來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。如果電泳鑒定的結(jié)果不止一條條帶分析可能的原因有___（至少答兩點(diǎn)）。
②寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5′___3′。
③為構(gòu)建融合基因并將其插入載體，科研人員設(shè)計(jì)了一對與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補(bǔ)配對的引物，設(shè)計(jì)時(shí)需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的識別序列和His基因的編碼序列，請寫出該引物開頭的12個(gè)堿基序列：5′___3′。
21. 畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時(shí)需要大量表達(dá)醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的長度為2200bp?？蒲腥藛T將蜂毒肽（MEL）與石斑魚c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA質(zhì)粒上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母以獲得高效低毒的廣譜抑菌融合蛋白，實(shí)驗(yàn)的主要流程如下，請回答：
注：重組質(zhì)粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜帶石斑魚c型溶菌酶屬于免疫系統(tǒng)的_______。相對于原核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)翻譯出的蛋白可以經(jīng)過_______加工修飾，表達(dá)的蛋白具有天然生物學(xué)活性。
（2）為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同時(shí)兩端帶有pPICZαA的同源序列，過程①PCR反應(yīng)體系中加入的模板是_______，引物應(yīng)該選擇以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）過程②將PCR產(chǎn)物片段與線性化的pPICZαA混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，這一過程與傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒相比不需要_______酶。
（4）為了驗(yàn)證構(gòu)建是否成功，利用限制性內(nèi)切酶EcRI和SalI對提取出重組質(zhì)粒2進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示分別得到大小約為_______（限制酶識別序列不計(jì)）的片段。過程③將重組質(zhì)粒2導(dǎo)入大腸桿菌的目的是_______。
（5）過程⑤培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)加入_______作為唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因與宿主基因組染色體的交換方式包括單交換和雙交換。含有目的基因的載體插入宿主染色體的AOX1基因的上游或下游，不影響AOX1基因的正常表達(dá)，屬于單交換；當(dāng)發(fā)生基因取代時(shí)，含目的基因的載體與宿主染色體中AOX1基因區(qū)域發(fā)生交換，宿主AOX1基因編碼區(qū)域被全部取代，屬于雙交換。以AOX1基因兩端序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，對三株重組酵母（編號1、2、3）進(jìn)行菌液PCR、電泳后得到下圖，根據(jù)結(jié)果推斷目的基因與宿主基因組染色體發(fā)生單交換的酵母菌株有_______。
22. 結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的人畜共患病。結(jié)核桿菌通常以氣溶膠形式傳播，氣溶膠顆粒被肺泡吞噬細(xì)胞吞噬，吞噬細(xì)胞破裂導(dǎo)致結(jié)核桿菌在機(jī)體內(nèi)進(jìn)一步傳播。羊癢病是由正常細(xì)胞的非致病性朊蛋白異構(gòu)化為癢病朊蛋白所致。為研制既能抗結(jié)核病又能抗羊癢病的雙抗羊，科學(xué)家進(jìn)行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前發(fā)現(xiàn)的具有抗結(jié)核桿菌感染功能的基因。研究人員為了驗(yàn)證SP110基因的功能，同時(shí)也為了驗(yàn)證山羊吞噬細(xì)胞特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成融合基因，設(shè)計(jì)了下表所示的三組實(shí)驗(yàn)。
取三組實(shí)驗(yàn)等量的細(xì)胞裂解液，用_____法培養(yǎng)，結(jié)果如下圖1所示。由圖可知小鼠SP110基因可用于雙抗羊的研制，依據(jù)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，PRNP基因的結(jié)構(gòu)如圖2．研究人員用新型基因敲除技術(shù)對體外培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞PRNP基因的外顯子3序列實(shí)施定點(diǎn)敲除。請根據(jù)上述信息，設(shè)計(jì)一個(gè)檢測敲除是否成功的思路：提取山羊成纖維細(xì)胞的DNA，根據(jù)_____設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，并用_____作用于PCR產(chǎn)物后進(jìn)行凝膠電泳，若僅獲得一條電泳條帶，說明定點(diǎn)敲除成功。
（3）用TALEN敲除載體與供體DNA表達(dá)載體（圖4）共同轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的幼羊成纖維細(xì)胞，可將融合基因定點(diǎn)敲入PRNP基因的外顯子3部位，原理如圖3．請指出圖4中數(shù)字1和2的分別代表的結(jié)構(gòu)：1．_____、2．_____。經(jīng)用_____法檢測，山羊成纖維細(xì)胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表達(dá)情況是_____（填“兩者均增加”或“兩者均減少或不表達(dá)”或“前者減少、后者增加”或“前者增加、后者減少”）。
（4）欲用上述細(xì)胞獲得雙抗羊，需要用到的技術(shù)有_____（至少寫出兩項(xiàng)）。限制酶
識別序列及切割位點(diǎn)
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
組別
主要操作
培養(yǎng)細(xì)胞后，使之破裂
對照組1
空質(zhì)粒導(dǎo)入山羊肺泡吞噬細(xì)胞，接種適量結(jié)核桿菌
細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，加入③_____，使吞噬細(xì)胞破裂，釋放結(jié)核桿菌
對照組2
含有能廣泛表達(dá)SP110基因的山羊肺泡吞噬細(xì)胞，①_____
實(shí)驗(yàn)組
②_____，接種等量的結(jié)核桿菌
江蘇省靖江高級中學(xué)2023-2024學(xué)年第二學(xué)期階段測試
高二生物試卷
（第Ⅰ卷）
一、單項(xiàng)選擇題：本題共19個(gè)小題，每小題2分，共38分。在每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中，只有一項(xiàng)是符合題目要求的。
1. 下圖表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建中的作用，下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A. 限制酶沿識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA兩條鏈切開
B. 在圖1和圖2中將分別產(chǎn)生4個(gè)和2個(gè)粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之間的磷酸二酯鍵和氫鍵
D. 圖示中酶1、酶2和酶3可以為不同種類的限制酶
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程:目的基因的篩選與獲取、構(gòu)建基因表達(dá)載體、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:取Ti質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體、將基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌、將農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞、將植物細(xì)胞培育為新性狀植株。
【詳解】A、由圖可知，產(chǎn)生的是黏性末端，所以可知限制酶在它識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開的，A正確；
B、由圖可知，圖1中含有酶1和酶2，能產(chǎn)生4個(gè)黏性末端，圖2中含有酶2，能產(chǎn)生2個(gè)黏性末端，B正確；
C、限制酶切割的是特定核苷酸序列之間的磷酸二酯鍵，不會切割氫鍵，C錯(cuò)誤；
D、限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，圖示中酶1、酶2和酶3可以為不同種類的限制酶，D正確。
故選C。
2. 下圖是幾種限制酶的切割位點(diǎn)，下列說法正確的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通過E．cliDNA連接酶相互連接
B. DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成
C. 所有限制酶的識別序列均由6個(gè)核苷酸組成
D. SmaI切割后產(chǎn)生的是黏性末端
【答案】B
【解析】
【分析】1、限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。
2、DNA連接酶：連接的是兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
【詳解】A、限制酶Sma I和EcR V切割形成的是平末端，E.cliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，但連接效率較低，A錯(cuò)誤；
B、DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵；RNA聚合酶將單個(gè)核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵，B正確；
C、并不是所有的限制酶的識別序列都是由6個(gè)核苷酸組成，有些限制酶的識別序列有4個(gè)或8個(gè)核苷酸組成，C錯(cuò)誤；
D、SmaI切割后產(chǎn)生的是平末端，D錯(cuò)誤。
故選B。
3. T4 DNA連接酶可將任意2個(gè)具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應(yīng)過程需消耗ATP，其水解產(chǎn)生的腺苷一磷酸（AMP）通過共價(jià)鍵與酶相連，隨后AMP轉(zhuǎn)移至DNA片段，進(jìn)而完成連接反應(yīng)。下列敘述正確的是（ ）
A. T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無專一性
B. T4 DNA連接酶催化反應(yīng)后，其組成成分已改變
C. ATP在該反應(yīng)過程中可能打開兩個(gè)特殊的化學(xué)鍵
D. T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
【答案】C
【解析】
【分析】1、DNA連接酶分為E. cliDNA連接酶和T4DNA連接酶。DNA連接酶連接的是兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。這二者都能連接黏性末端，此外T4DNA連接酶還可以連接平末端，但連接平末端時(shí)的效率比較低。
2、酶的特性：專一性、高效性和作用條件溫和。
3、酶是催化劑，在催化反應(yīng)前后性質(zhì)不變。
【詳解】A、T4DNA連接酶有專一性，A錯(cuò)誤；
B、酶在催化反應(yīng)前后性質(zhì)不變，故T4DNA連接酶催化反應(yīng)后，其組成成分不變，B錯(cuò)誤；
C、ATP水解產(chǎn)生AMP需要打開兩個(gè)特殊的化學(xué)鍵，結(jié)合題干“該反應(yīng)過程需消耗ATP，其水解產(chǎn)生的腺苷一磷酸（AMP）通過共價(jià)鍵與酶相連”可推測ATP在該反應(yīng)過程中可能打開兩個(gè)特殊的化學(xué)鍵，C正確；
D、T4DNA連接酶需在低溫和最適pH條件下保存，D錯(cuò)誤。
故選C。
4. 科研人員以抗四環(huán)素基因?yàn)闃?biāo)記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細(xì)胞貧血癥。下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、啟動子、終止子、抗四環(huán)素基因等元件來構(gòu)建基因表達(dá)載體
B. 利用正常小鼠DNA分子通過PCR克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列
C. 用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β-珠蛋白編碼序列的大腸桿菌
D. 將β-珠蛋白基因表達(dá)載體導(dǎo)入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中
【答案】D
【解析】
【分析】基因表達(dá)載體包括啟動子、目的基因（β珠蛋白基因）、標(biāo)記基因（抗四環(huán)素基因）、終止子等。抗四環(huán)素基因是標(biāo)記基因，用于篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，因此受體細(xì)胞（大腸桿菌）不含有四環(huán)素抗性基因。導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，因此可以用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β珠蛋白編碼序列的大腸桿菌。
【詳解】A、基因表達(dá)載體包括啟動子、目的基因（β珠蛋白基因）、標(biāo)記基因（抗四環(huán)素基因）、終止子等，A正確；
B、β珠蛋白基因?qū)儆谀康幕?，可以利用正常小鼠DNA分子為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增，B正確；
C、標(biāo)記基因是四環(huán)素抗性基因，因此用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β-珠蛋白編碼序列的大腸桿菌，C正確；
D、標(biāo)記基因是四環(huán)素抗性基因，說明受體細(xì)胞大腸桿菌本身不具有四環(huán)素抗性，D錯(cuò)誤。
故選D。
5. 如圖表示利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)制備山羊乳腺生物反應(yīng)器的流程圖，目的是從轉(zhuǎn)基因山羊的乳汁中獲得人乳鐵蛋白。已知細(xì)胞甲是來自雌山羊的胚胎成纖維細(xì)胞，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）

A. 完成圖中①過程用到了質(zhì)粒、限制酶和DNA連接酶等
B. 篩選出的細(xì)胞乙是含有目的基因的胚胎成纖維細(xì)胞
C. 該重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚時(shí)需要進(jìn)行DNA分析以鑒定性別
D. 圖示流程中，②④⑤過程都用到了顯微操作技術(shù)
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的步驟：目的基因的獲取，主要有三種方法：基因文庫、PCR技術(shù)擴(kuò)增、人工合成；基因表達(dá)載體構(gòu)建，表達(dá)載體組成：啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因；目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，動物細(xì)胞（受體）采用顯微注射技術(shù)導(dǎo)入，植物細(xì)胞（受體）采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法導(dǎo)入，微生物細(xì)胞（受體）采用感受態(tài)細(xì)胞法導(dǎo)入；目的基因檢測與鑒定，采用分子檢測、個(gè)體生物學(xué)水平鑒定。
【詳解】A、完成圖中①過程需要構(gòu)建基因表達(dá)載體，用到了質(zhì)粒、限制酶和DNA連接酶等，A正確；
B、將目的基因?qū)氪粕窖虻呐咛コ衫w維細(xì)胞，再篩選出含有目的基因的胚胎成纖維細(xì)胞，B正確；
C、圖中的供體細(xì)胞細(xì)胞核來自雌性山羊，則胚胎移植后生出的小羊性別為雌性，因此并不需要進(jìn)行性別鑒別，C錯(cuò)誤；
D、圖示流程中，②將重組質(zhì)粒導(dǎo)入動物細(xì)胞用顯微操作技術(shù)，④需要在顯微鏡下去核，⑤需要在顯微鏡下進(jìn)行注入操作技術(shù)，D正確。
故選C。
6. 噬菌體展示技術(shù)是將編碼某蛋白質(zhì)的基因?qū)胧删w的DNA中，使該外源基因隨噬菌體外殼蛋白表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。以下對該技術(shù)分析正確的是（ ）
A. 噬菌體展示技術(shù)的遺傳學(xué)原理是基因突變
B. 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時(shí)需使用限制酶和DNA酶
C. 需用營養(yǎng)成分齊全的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)噬菌體
D. 可利用抗原—抗體雜交技術(shù)篩選目標(biāo)蛋白
【答案】D
【解析】
【分析】題意分析，噬菌體展示技術(shù)離不開基因工程的支持?；蚬こ痰牟僮鞑襟E是：目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】A、題中技術(shù)的原理是將目標(biāo)基因與噬菌體DNA重組，屬于基因工程的范疇，其遺傳學(xué)原理是基因重組，A錯(cuò)誤；
B、構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時(shí)需使用限制酶和DNA連接酶，而DNA酶會水解DNA，B錯(cuò)誤；
C、噬菌體沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不能獨(dú)立生活，必須用含有活細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)噬菌體，C錯(cuò)誤；
D、抗原-抗體雜交可以檢測特定的蛋白質(zhì)，因此可利用抗原—抗體雜交技術(shù)篩選目標(biāo)蛋白，D正確。
故選D。
7. 將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導(dǎo)入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿海水稻新品種。下圖PCR擴(kuò)增OsMYB56時(shí)需要添加引物，應(yīng)選用的引物組合為（ ）

A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
【答案】A
【解析】
【分析】PCR技術(shù)可特異性的擴(kuò)增DNA片段，關(guān)鍵在于引物可以和特定DNA片段的3'端特異性結(jié)合，使Taq酶沿引物的3'端延伸子鏈。
【詳解】―端為DNA鏈的5'端，―OH端為DNA鏈的3'端。進(jìn)行PCR時(shí)，引物與模板鏈的3'端結(jié)合，因此在擴(kuò)增OsMYB56時(shí)需要添加的引物是5'-CTTGCATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'，A項(xiàng)符合題意，BCD不符合題意。
故選A。
8. 下圖為采用“實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(即將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增)”技術(shù)檢測2019nCV核酸的基本流程，1～2h內(nèi)即可得到檢測結(jié)果。有關(guān)說法正確的是（ ）

A. 過程①是逆轉(zhuǎn)錄過程，不屬于中心法則的內(nèi)容
B. 過程②表示擴(kuò)增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 熒光標(biāo)記法還可以用于探究DNA的復(fù)制方式
D. RT-PCR反應(yīng)體系中加入的原料是脫氧核苷酸
【答案】D
【解析】
【分析】圖中過程①表示以RNA為模板合成DNA為逆轉(zhuǎn)錄，過程②表示利用PCR擴(kuò)增DNA片段。
【詳解】A、過程①表示以RNA為模板合成DNA，表示逆轉(zhuǎn)錄過程，屬于中心法則內(nèi)容之一，A錯(cuò)誤；
B、過程②表示利用PCR擴(kuò)增DNA片段，需要用到的酶有TaqDNA聚合酶，B錯(cuò)誤；
C、探究DNA的復(fù)制方式采用同位素標(biāo)記法，不是熒光標(biāo)記法，C錯(cuò)誤；
D、逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程，PCR是體外模擬DNA復(fù)制的技術(shù)，所以應(yīng)加入的原料是4種脫氧核苷酸，D正確。
故選D
9. 食物中的生物胺會引起胃腸道不適和過敏等不良反應(yīng)，微生物來源的多銅氧化酶(MCO)能高效分解生物胺。科研人員采用PCR技術(shù)獲得發(fā)酵乳酸桿菌的MCO基因，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。若目的基因MCO經(jīng)限制酶切開后的末端如圖甲，要MCO片段能與載體質(zhì)粒pCLY15(圖乙)高效連接，需用于切割的酶組合為（ ）

A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
【答案】C
【解析】
【分析】題意分析，根據(jù)酶切位點(diǎn)分析，目的基因應(yīng)位于啟動子和終止子之間，為高效連接應(yīng)選用黏性末端相同的酶，而不能選用平末端，故目的基因應(yīng)使用Kpnl和Xmal切割。
【詳解】KpnⅠ酶切后產(chǎn)生 5′?GTAC?3′的末端，XmaⅠ酶切后產(chǎn)生 5′?CCGG?3′的末端，剛好與目的基因的游離末端配對，因此，切割pCLY15的酶組合為KpnⅠ和XmaⅠ，C正確。
故選C。
10. 霍亂是因感染霍亂弧菌引起的一種傳染性非常強(qiáng)的消化道疾病，患者往往上吐下瀉，甚至死亡。研究人員通過基因工程改變大米的蛋白質(zhì)構(gòu)成，使其攜帶一種叫“霍亂毒素B”的物質(zhì)，該物質(zhì)進(jìn)入人體后，能促進(jìn)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有效預(yù)防霍亂的感染。下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 大米中攜帶的霍亂毒素B相當(dāng)于抗原，能激發(fā)人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)
B. 該項(xiàng)研究成功的標(biāo)志是人體產(chǎn)生相應(yīng)的記憶細(xì)胞和針對霍亂毒素B的特異性抗體
C. 當(dāng)接種者再次接觸抗原時(shí)，體內(nèi)記憶細(xì)胞會迅速分泌大量抗體，與抗原特異性結(jié)合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重組的原理，效果明顯，可造福世界人民
【答案】C
【解析】
【分析】通過基因工程技術(shù)可使大米合成“霍亂毒素B”的物質(zhì)，該物質(zhì)進(jìn)入人體可引起人體產(chǎn)生特異性免疫，使機(jī)體產(chǎn)生針對相應(yīng)抗原的記憶細(xì)胞和抗體。
【詳解】A、大米中攜帶的霍亂毒素B相當(dāng)于抗原，能激發(fā)人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生記憶細(xì)胞，A正確；
B、該項(xiàng)研究成功標(biāo)志是人體產(chǎn)生相應(yīng)的記憶細(xì)胞和針對霍亂毒素B的特異性抗體，當(dāng)相應(yīng)抗原進(jìn)入機(jī)體后，記憶細(xì)胞可增殖分化形成漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量抗體，抗體與霍亂毒素結(jié)合，B正確；
C、抗體是漿細(xì)胞分泌的，C錯(cuò)誤；
D、“大米疫苗”的研制主要利用了基因重組的原理，該“大米疫苗”生產(chǎn)簡單、成本低廉且效果明顯，可造福世界人民，D正確。
故選C。
11. 科學(xué)家利用基因工程培育出了能產(chǎn)生乙肝病毒蛋白質(zhì)的西紅柿，被稱之為“西紅柿乙肝疫苗”。具體操作是：將乙肝抗原基因M導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后利用農(nóng)桿菌將M導(dǎo)入西紅柿細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)顯示小白鼠連續(xù)五周吃這樣的西紅柿，體內(nèi)產(chǎn)生了抗乙肝病毒的抗體，下列敘述錯(cuò)誤的（ ）
A. 實(shí)驗(yàn)用PCR技術(shù)對M基因進(jìn)行擴(kuò)增，需要兩種引物
B. 含M的重組Ti質(zhì)粒必須插入到西紅柿染色體DNA上
C. 即使M在西紅柿中成功表達(dá)，也要做個(gè)體生物學(xué)水平鑒定
D. 西紅柿乙肝疫苗成本相對較低且易于儲存
【答案】B
【解析】
【分析】基因工程的基本操作步驟主要包括：①目的基因的獲?。虎诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測與表達(dá)。
【詳解】A、導(dǎo)入前目的基因需要對M基因擴(kuò)增，PCR需要兩種引物結(jié)合M基因的兩條鏈合成相應(yīng)子鏈，A正確；
B、含M的T-DNA插入到西紅柿染色體DNA上，才能穩(wěn)定存在和表達(dá)，而不是整個(gè)Ti質(zhì)粒，B錯(cuò)誤；
C、即使M在西紅柿中成功表達(dá)，也必須在個(gè)體生物學(xué)水平鑒定，來確定實(shí)際效果，C正確；
D、西紅柿種植容易，成本低且易儲存，D正確。
故選B。
12. PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5'端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP是DNA合成的原料，還可供能。下列相關(guān)說法錯(cuò)誤的是（ ）
A. 圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個(gè)環(huán)節(jié)的低
B. 引物的設(shè)計(jì)要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高溫Taq酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈
D. 1個(gè)循環(huán)后，子代DNA雙鏈的脫氧核苷酸數(shù)量相同
【答案】D
【解析】
【分析】1、PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在體外復(fù)制特定的DNA的核酸合成技術(shù)。
2、原理：DNA復(fù)制。
3、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Tag 酶）。
【詳解】A、圖示環(huán)節(jié)為引物與模板堿基互補(bǔ)配對，表示的是復(fù)性環(huán)節(jié)，復(fù)性的上一環(huán)節(jié)為變性，復(fù)性的溫度比變性的溫度低，A正確；
B、引物的設(shè)計(jì)要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保證其與已知模板能堿基配對，在后續(xù)擴(kuò)增的過程中才能進(jìn)行子鏈的延伸，B正確；
C、子鏈?zhǔn)菑?'-3'端延伸的，耐高溫Tag 酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈，C正確；
D、由于兩個(gè)引物均不在該片段的端點(diǎn)，因此一個(gè)循環(huán)后，子代DNA雙鏈的脫氧核苷酸數(shù)量不相同，D錯(cuò)誤。
故選D。
13. 幽門螺桿菌（Hp）感染會引發(fā)胃炎、消化性潰瘍等多種疾病。研究人員將Hp的Ipp20基因作為目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通過基因工程制備相應(yīng)的疫苗，質(zhì)粒及操作步驟如圖所示。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）

A. Ipp20基因整合到大腸桿菌的DNA中屬于基因重組
B. 基因表達(dá)載體導(dǎo)入之前，可用Ca2+處理大腸桿菌
C. 培養(yǎng)基A中添加了氯霉素，培養(yǎng)基B中添加了潮霉素
D. 能用來生產(chǎn)Hp疫苗的大腸桿菌在菌落3和5中
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：
1.目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
【詳解】A、基因重組是指控制不同性狀基因發(fā)生重新組合，主要發(fā)生在有性生殖過程中，但通過基因工程將不同來源的 DNA 拼接，可以賦予生物新的遺傳特性，也屬于基因重組的范疇，故利用基因工程將Ipp20基因整合到大腸桿菌的DNA中屬于基因重組，A正確；
B、原核細(xì)胞作為受體細(xì)胞時(shí)，可用Ca2+處理受體細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，更容易將基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中，B正確；
CD、該過程使用了限制酶 Xh I和Xba I切割質(zhì)粒和Ipp20基因，結(jié)合圖示可知，在構(gòu)建目的基因表達(dá)載體的過程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常質(zhì)粒還是重組質(zhì)粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常質(zhì)粒才同時(shí)含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培養(yǎng)基A篩選出導(dǎo)入正常質(zhì)粒、重組質(zhì)粒的大腸桿菌，再采用同位影印接種到含有氯霉素的培養(yǎng)基B和含有潮霉素的培養(yǎng)基A中，此時(shí)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含有氯霉素的培養(yǎng)基 B上生長，從而與培養(yǎng)基A（對照）相比會消失一些菌落，對照兩個(gè)平板上減少的菌落就是符合要求的大腸桿菌菌落，結(jié)合圖示可知，符合要求的大腸桿菌菌落是3和5，C錯(cuò)誤，D正確。
故選C。
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實(shí)時(shí)監(jiān)控CD163蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起（如下圖），使其表達(dá)成一條多肽。該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去（ ）

A. CD163基因中編碼起始密碼子的序列
B. CD163基因中編碼終止密碼子的序列
C. RFP基因中編碼起始密碼子的序列
D. RFP基因中編碼終止密碼子的序列
【答案】B
【解析】
【分析】基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因啟動子終止子和標(biāo)記基因等。
【詳解】為實(shí)時(shí)監(jiān)控CD163蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，則拼接在一起的紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因都得轉(zhuǎn)錄和翻譯，使其表達(dá)成一條多肽，因此拼接在一起的CD163基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中不能出現(xiàn)終止密碼子，否則紅色熒光蛋白RFP基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA不能進(jìn)行翻譯，無法合成紅色熒光蛋白，因此該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去CD163基因中編碼終止密碼子的序列，B符合題意，ACD不符合題意。
故選B。
二、多項(xiàng)選擇題：本題共4小題，每小題3分，共12分。在每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中，有兩個(gè)或兩個(gè)以上選項(xiàng)符合題目要求。全部選對得3分，選對但不全的得1分，有選錯(cuò)的得0分。
15. 限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（ ）
A. DNA連接酶能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
B. 限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
C. E.cliDNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端
D. 限制酶主要從原核生物中分離純化而來，不能剪切自身的DNA
【答案】BD
【解析】
【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制酶；②基因的 “針線”---DNA連接酶；③基因的運(yùn)載體---質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等。
【詳解】A、DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，A錯(cuò)誤；
B、限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能切割，B正確；
C、E·cli DNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端，C錯(cuò)誤；
D、限制酶主要從原核生物中分離純化而來，但是因?yàn)樵松顳NA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D正確。
故選BD。
16. 人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補(bǔ)作用。干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程。①?④表示相關(guān)的操作， EcR I 、BamHI為限制酶，它們的識別序列及切割位點(diǎn)如 下表所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A. 過程①所需的兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列有利于后續(xù)操作
B. 構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制
C. 過程③利用的是T-DNA的特性將目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中
D. 過程④需控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細(xì)胞發(fā)生再分化
【答案】BC
【解析】
【分析】Ti質(zhì)粒是在根瘤土壤桿菌細(xì)胞中存在的一種核區(qū)DNA外的自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。是一種存在于根癌土壤桿菌中可引起雙子葉植物根部致癌的質(zhì)粒。細(xì)菌從雙子葉植物的受傷根部侵入根部細(xì)胞后，最后在其中裂解，釋放出Ti質(zhì)粒，其上的T-DNA片段會與植物細(xì)胞的核基因組整合。
【詳解】A、結(jié)合圖示可知，PCR的產(chǎn)物用EcR I和BamHI來酶切，因此在基因的引物兩側(cè)加上酶切位點(diǎn)G↓AATTC和G↓GATCC，A正確；
B、啟動子負(fù)責(zé)與RNA聚合酶結(jié)合啟動表達(dá)，終止子負(fù)責(zé)終止表達(dá)，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進(jìn)行表達(dá)，B錯(cuò)誤；
C、過程③是利用T-DNA的特性將目的基因?qū)氲睫r(nóng)桿菌中，農(nóng)桿根瘤菌是原核生物，無染色體，C錯(cuò)誤；
D、整個(gè)過程最終需要利用愈傷組織細(xì)胞生成干擾素，因此應(yīng)控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細(xì)胞發(fā)生再分化，D正確。
故選BC。
17. RT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。下圖是RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉(zhuǎn)錄過程，③是PCR過程。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是（ ）

A. 該技術(shù)可用來檢測新冠病毒等RNA病毒
B. 該技術(shù)可用來檢測組織細(xì)胞中基因否轉(zhuǎn)錄
C. ①過程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，③過程需要的酶是耐高溫的DNA聚合酶
D. ③過程中DNA解鏈后，應(yīng)升高反應(yīng)體系溫度使引物與模板結(jié)合
【答案】ABC
【解析】
【分析】PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。PCR每次循環(huán)一般分為：變性（溫度超過90°C）、復(fù)性（溫度降至50°C左右）、延伸（溫度上升到72°C左右）。
【詳解】A、由圖可知，RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增原理都是堿基互補(bǔ)配對原則，故該技術(shù)可用來檢測新冠病毒等RNA病毒，A正確；
B、基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是RNA，使用RT-PCR技術(shù)可用于檢測細(xì)胞中的基因是否轉(zhuǎn)錄，B正確；
C、①和②為逆轉(zhuǎn)錄過程，需要逆轉(zhuǎn)錄酶參與；③過程為DNA的復(fù)制，需要耐高溫的DNA聚合酶，C正確；
D、③過程中DNA解鏈后，進(jìn)行復(fù)性，溫度降至50°C左右，兩種引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，D錯(cuò)誤。
故選ABC。
18. 科研人員將釀酒酵母質(zhì)粒上的丙酮酸脫氫酶基因（PD）替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因（LPG），可獲得乳酸乙酯（白酒香味的主要來源）高產(chǎn)菌株，過程如圖。下列分析合理的是（ ）

A. 轉(zhuǎn)入的LPG基因表達(dá)產(chǎn)物不能影響釀酒酵母的活性
B. LPG基因替換質(zhì)粒上的PD基因需要兩端攜帶相同基因片段
C. 標(biāo)記基因Ampr可檢測是否成功構(gòu)建乳酸乙酯高產(chǎn)菌株
D. 可以利用PCR技術(shù)篩選含有LPG基因的受體細(xì)胞
【答案】ABD
【解析】
【分析】分析題圖：圖示是采用基因工程技術(shù)將釀酒酵母質(zhì)粒上的丙酮酸脫氫酶基因(PD)替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因(L-PG)，從而獲得乳酸乙酯高產(chǎn)菌株。
【詳解】A、目的基因表達(dá)產(chǎn)物不能影響受體細(xì)胞的生存和活性，因此轉(zhuǎn)入的L-PG基因表達(dá)產(chǎn)物不能影響釀酒酵母活性，A正確；
B、LPG基因替換質(zhì)粒上的PD基因需要兩端攜帶相同基因片段，即相同的黏性末端，B正確；
C、標(biāo)記基因Ampr可篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，但不能檢測是否成功構(gòu)建乳酸乙酯高產(chǎn)菌株，C錯(cuò)誤；
D、PCR技術(shù)是一項(xiàng)體外擴(kuò)增基因的技術(shù)，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，可以用于篩選含有L-PG基因的受體細(xì)胞，D正確。
故選ABD。
（第Ⅱ卷）
三、綜合題：共4題，每題15分，共60分。
19. 葉用萵苣（如生菜）是大眾喜愛蔬菜，夏季高溫極易引起先期抽苔造成減產(chǎn)，泛素連接酶（LsE3）是研究人員在萵苣高溫抽苔植株中篩選得到的。LsE3基因受溫度調(diào)控，影響萵苣抽苔，但是LsE3基因作用機(jī)制尚不清楚。研究人員用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建萵苣LsE3基因的表達(dá)載體用于研究其分子機(jī)理。無縫克隆技術(shù)是構(gòu)建表達(dá)載體的一種技術(shù)如圖2。

（1）目的基因獲取，在_____條件下，提取先期抽苔萵苣細(xì)胞中_____，經(jīng)_____獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LsE3基因。PCR擴(kuò)增除了圖1標(biāo)出的物質(zhì)以外，還需加入_____（至少寫兩種）。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中需要兩種引物F（左側(cè)）、R（右側(cè)）選用_____（選項(xiàng)中為引物部分序列，方向?yàn)?'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表達(dá)載體構(gòu)建，近年來新一代無縫克隆技術(shù)發(fā)展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成為目前研究的熱點(diǎn)。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技術(shù)（如圖2）。 T4 DNA 聚合酶在反應(yīng)體系中沒有添加dNTP情況下具有 3'→5'外切酶活性；在反應(yīng)體系中添加dNTP情況下具有5'→3'聚合酶活性；在反應(yīng)體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時(shí)，外切酶活性和聚合酶活性同時(shí)發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應(yīng)，產(chǎn)生指定長度的單鏈黏性末端。請結(jié)合圖1和圖2回答下列問題：
①LIC技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，圖1中利用PCR擴(kuò)增LsE3基因，反應(yīng)液中加入T4 DNA聚合酶和_____處理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質(zhì)粒獲得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____處理質(zhì)粒。處理后將兩者混合、退火并導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)完成重組克隆。
②LIC技術(shù)依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術(shù)，后經(jīng)過多次改進(jìn)，Qi等建立了RQ-SLIC技術(shù)，用EcRⅤ酶切割質(zhì)粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當(dāng)時(shí)間，將混合物加熱到72℃，目的是_____，緩慢降溫（退火）后移入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)形成完整重組質(zhì)粒，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)過程中用到_____酶。
（3）導(dǎo)入受體細(xì)胞，取葉用萵苣幼芽經(jīng)_____（過程）形成愈傷組織備用，用_____處理農(nóng)桿菌后導(dǎo)入重組質(zhì)粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入_____植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出成功導(dǎo)入質(zhì)粒的植物細(xì)胞。
【答案】（1） ①. 高溫 ②. 總RNA（或“總mRNA”或“RNA”） ③. 逆轉(zhuǎn)錄 ④. Taq酶、緩沖液、dNTP、Mg2+ ⑤. AC
（2） ①. dGTP ②. 平 ③. dCTP ④. 終止T4 DNA聚合酶活性 ⑤. DNA聚合酶和DNA連接
（3） ①. 脫分化 ②. 氯化鈣（或Ca2+） ③. 潮霉素
【解析】
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：
1、目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
4、目的基因的檢測與鑒定：
（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。
（2）個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【小問1詳解】
目的基因獲取，在高溫條件下，提取先期抽苔萵苣細(xì)胞中總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LsE3基因。PCR擴(kuò)增的條件有模板、引物、Taq酶、dNTP、能量等，除了圖1標(biāo)出的物質(zhì)以外，還需加入Taq酶、緩沖液、dNTP、Mg2+。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中引物需要結(jié)合在模板鏈的3'，子鏈的延伸方向是沿引物的5'進(jìn)行，結(jié)合圖1和堿基互補(bǔ)配對原則，引物F（左側(cè)）選用A、R（右側(cè)）選用C。
【小問2詳解】
①由題干信息可知，在反應(yīng)體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時(shí)，外切酶活性和聚合酶活性同時(shí)發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應(yīng)，產(chǎn)生指定長度的單鏈黏性末端，所以圖1中利用PCR擴(kuò)增LsE3基因，反應(yīng)液中加入T4 DNA聚合酶和dGTP處理。用EcR Ⅴ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質(zhì)粒獲得平末端，后加T4 DNA聚合酶和dCTP處理質(zhì)粒。
②LIC技術(shù)依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術(shù)，后經(jīng)過多次改進(jìn)，Qi等建立了RQ-SLIC技術(shù)，用EcR Ⅴ酶切割質(zhì)粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當(dāng)時(shí)間，將混合物加熱到72℃，目的是終止T4 DNA聚合酶活性，緩慢降溫（退火）后移入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)形成完整重組質(zhì)粒，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化修復(fù)過程中用到DNA聚合酶和DNA連接酶。
【小問3詳解】
導(dǎo)入受體細(xì)胞，取葉用萵苣幼芽經(jīng)脫分化形成愈傷組織備用，用氯化鈣（或Ca2+）處理農(nóng)桿菌后導(dǎo)入重組質(zhì)粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入潮霉素植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原因是重組質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因，然后篩選出成功導(dǎo)入質(zhì)粒的植物細(xì)胞。
20. CD3D嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突變引起的，該突變阻止了T細(xì)胞生長發(fā)育所需的CD3D蛋白的合成?？蒲腥藛T對第3代CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行改造，獲得一種超精確的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），該系統(tǒng)主要由向?qū)gRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶組成，作用機(jī)制如圖1。利用該系統(tǒng)在CD3D-SCID患者的造血干細(xì)胞中可以更正約71.2%的致病突變。

（1）研究發(fā)現(xiàn)，Cas9切口酶催化雙鏈DNA___鍵水解，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸堿基互補(bǔ)配對，據(jù)此推測，至少通過___次DNA復(fù)制可以完成修復(fù)。
（2）sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補(bǔ)配對的特殊序列，由23個(gè)連續(xù)堿基組成。sgRNA設(shè)計(jì)是否合理，對于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的切割有重要影響，否則會導(dǎo)致sgRNA脫靶，試分析其原因是___。
（3）為了對改造后的CD3D基因進(jìn)行研究，把CD3D基因和His標(biāo)簽基因（His標(biāo)簽由6個(gè)組氨酸組成）連接起來構(gòu)建融合基因，并構(gòu)建重組基因表達(dá)載體，圖2為載體、CD3D基因的結(jié)構(gòu)、不同限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)，欲將標(biāo)簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，已知組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG。

①PCR的一般過程為___，在變性之前通常有預(yù)變性，其目的是___。判斷是否擴(kuò)增出DNA片段，判斷的依據(jù)是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及___來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。如果電泳鑒定的結(jié)果不止一條條帶分析可能的原因有___（至少答兩點(diǎn)）。
②寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5′___3′。
③為構(gòu)建融合基因并將其插入載體，科研人員設(shè)計(jì)了一對與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補(bǔ)配對的引物，設(shè)計(jì)時(shí)需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的識別序列和His基因的編碼序列，請寫出該引物開頭的12個(gè)堿基序列：5′___3′。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯 ②. 2##兩##二
（2）當(dāng)其他DNA序列也含有與sgRNA互補(bǔ)配對的序列，造成sgRNA錯(cuò)誤結(jié)合而脫靶
（3） ①. 變性→復(fù)性→延伸 ②. 增加模板DNA徹底變性的概率 ③. 寬度 ④. 引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好 ⑤. CATCATCATCATCATCATTAG ⑥. B ⑦. XhⅠ ⑧. CTCGAGCTAATG
【解析】
【分析】基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟。基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
【小問1詳解】
Cas9切口酶相當(dāng)于內(nèi)切酶，催化雙鏈DNA的磷酸二酯鍵水解，由圖1可知需要把A-T堿基對修復(fù)為G-C堿基對，腺嘌呤脫氨酶把A變成次黃嘌呤核苷酸，第一次復(fù)制黃嘌呤核苷酸與C配對，第二次復(fù)制C-G配對，完成修復(fù)，所以至少通過2次DNA復(fù)制可以完成修復(fù)。
【小問2詳解】
sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補(bǔ)配對的特殊序列，由23個(gè)連續(xù)堿基組成，當(dāng)其他DNA序列也含有與sgRNA互補(bǔ)配對的序列，造成sgRNA錯(cuò)誤結(jié)合而脫靶；為了解決這個(gè)問題可以適當(dāng)增加sgRNA的長度，提高其與目標(biāo)基因識別的特異性程度。
【小問3詳解】
①PCR的一般過程為：變性→復(fù)性→延伸，PCR循環(huán)之前，常要進(jìn)行一次預(yù)變性，預(yù)變性的目的是增加模板DNA徹底變性的概率?？赏ㄟ^是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及寬度來評價(jià)擴(kuò)增是否成功。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。
②基因編碼鏈的堿基序列，相當(dāng)于把mRNA的序列中U改為T，His標(biāo)簽由6個(gè)組氨酸組成，組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG，所以His的基因編碼鏈的堿基序列為5'CATCATCATCATCATCATTAG3'。
③欲將標(biāo)簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，也就是在圖中的右側(cè)，所以要加相應(yīng)的限制酶識別序列和His基因的編碼序列需要在右側(cè)，即用引物B；結(jié)合圖示可知，限制酶應(yīng)選用XhⅠ，所以增加的是His的基因編碼鏈的互補(bǔ)鏈堿基序列和XhⅠ的識別序列：5'CTCGAGCTAATG3'。
21. 畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時(shí)需要大量表達(dá)醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的長度為2200bp?？蒲腥藛T將蜂毒肽（MEL）與石斑魚c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA質(zhì)粒上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母以獲得高效低毒的廣譜抑菌融合蛋白，實(shí)驗(yàn)的主要流程如下，請回答：
注：重組質(zhì)粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜帶石斑魚c型溶菌酶屬于免疫系統(tǒng)的_______。相對于原核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)翻譯出的蛋白可以經(jīng)過_______加工修飾，表達(dá)的蛋白具有天然生物學(xué)活性。
（2）為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同時(shí)兩端帶有pPICZαA的同源序列，過程①PCR反應(yīng)體系中加入的模板是_______，引物應(yīng)該選擇以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）過程②將PCR產(chǎn)物片段與線性化的pPICZαA混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，這一過程與傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒相比不需要_______酶。
（4）為了驗(yàn)證構(gòu)建是否成功，利用限制性內(nèi)切酶EcRI和SalI對提取出的重組質(zhì)粒2進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示分別得到大小約為_______（限制酶識別序列不計(jì)）的片段。過程③將重組質(zhì)粒2導(dǎo)入大腸桿菌的目的是_______。
（5）過程⑤培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)加入_______作為唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因與宿主基因組染色體的交換方式包括單交換和雙交換。含有目的基因的載體插入宿主染色體的AOX1基因的上游或下游，不影響AOX1基因的正常表達(dá)，屬于單交換；當(dāng)發(fā)生基因取代時(shí)，含目的基因的載體與宿主染色體中AOX1基因區(qū)域發(fā)生交換，宿主AOX1基因編碼區(qū)域被全部取代，屬于雙交換。以AOX1基因兩端序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，對三株重組酵母（編號1、2、3）進(jìn)行菌液PCR、電泳后得到下圖，根據(jù)結(jié)果推斷目的基因與宿主基因組染色體發(fā)生單交換的酵母菌株有_______。
【答案】（1） ①. （免疫）活性物質(zhì) ②. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體
（2） ①. 重組質(zhì)粒1 ②. AB
（3）限制酶和DNA連接酶
（4） ①. 611bp、3493bp ②. 使得重組質(zhì)粒2在大腸桿菌中穩(wěn)定保存、準(zhǔn)確復(fù)制、方便提取
（5） ①. 甲醇 ②. 誘導(dǎo)目的基因大量表達(dá)
（6）1、2、3
【解析】
【分析】1、PCR技術(shù)的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；
2、PCR的操作過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。
【小問1詳解】
免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性物質(zhì)構(gòu)成，溶菌酶屬于免疫系統(tǒng)的免疫活性物質(zhì)。原核細(xì)胞沒有細(xì)胞核和眾多細(xì)胞器，只有核糖體，真核細(xì)胞具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，因此相對于原核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)翻譯出的蛋白可以經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體。
【小問2詳解】
重組質(zhì)粒Ⅰ上既含有MEL基因又含有Ec-cLYZ，且兩基因相連，因此重組質(zhì)粒Ⅰ可作為過程①PCR反應(yīng)體系中的模板，為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，且兩端帶有pPICZαA的同源序列，因此所設(shè)計(jì)的引物，一側(cè)應(yīng)包含pPICZαA和Ec-cLY的堿基序列，且連接處應(yīng)含有限制酶EcRⅠ識別序列，又因?yàn)樽渔溠由斓姆较蚴?'→3'，因此，該側(cè)引物序列應(yīng)為5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’，即A選項(xiàng)；另一側(cè)引物應(yīng)包含MEL和pPICZαA，且連接處應(yīng)含有限制酶SalⅠ識別序列，子鏈延伸的方向是5'→3'，因此，該側(cè)引物序列應(yīng)為5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’，即B選項(xiàng)。
綜上所述AB正確，CD錯(cuò)誤。
故選AB。
【小問3詳解】
過程②將PCR產(chǎn)物片段與線性化的pPICZαA混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，在該過程中未用到限制酶和DNA連接酶。
【小問4詳解】
由圖可知，Ec-cLYZ基因片段長度為533bp，MEL基因片段長度為78bp，在重組質(zhì)粒Ⅱ中兩基因?yàn)槿诤匣?，之間為限制酶識別序列，但在兩端分別含有限制性內(nèi)切酶EcRI和SalI識別序列，若用限制性內(nèi)切酶EcRI和SalI對提取出的重組質(zhì)粒2進(jìn)行雙酶切，得到的融合基因片段長度為533+78=611bp，另一片段為pPICZαA片段，長度為3493bp，因此利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示分別得到大小約為611bp、3493bp兩種片段。過程③將重組質(zhì)粒2導(dǎo)入大腸桿菌可使得使得重組質(zhì)粒2在大腸桿菌中穩(wěn)定保存、準(zhǔn)確復(fù)制、方便提取。
【小問5詳解】
畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時(shí)需要大量表達(dá)醇氧化酶，MEL和Ec-cLYZ融合基因存在于AOX1基因啟動子和終止子之間，因此過程⑤培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)加入甲醇作為唯一碳源，目的是誘導(dǎo)目的基因（MEL和Ec-cLYZ融合基因）大量表達(dá)。
【小問6詳解】
由題可知，AOX1基因的長度為2200bp，發(fā)生單交換的含有目的基因的載體插入宿主染色體的AOX1基因的上游或下游，不影響AOX1基因的正常表達(dá)，因此以AOX1基因兩端序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，若發(fā)生單交換，則擴(kuò)增出來的片段大于AOX1基因本身的長度2200bp，若為雙交換則AOX1基因編碼區(qū)全部被替換，擴(kuò)增出來的片段小于AOX1基因本身的長度2200bp，由圖可知，三株重組酵母在大于2000bp的位置均有電泳條帶，可知菌株1、2、3中目的基因與宿主基因組染色體發(fā)生單交換。
22. 結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的人畜共患病。結(jié)核桿菌通常以氣溶膠形式傳播，氣溶膠顆粒被肺泡吞噬細(xì)胞吞噬，吞噬細(xì)胞破裂導(dǎo)致結(jié)核桿菌在機(jī)體內(nèi)進(jìn)一步傳播。羊癢病是由正常細(xì)胞的非致病性朊蛋白異構(gòu)化為癢病朊蛋白所致。為研制既能抗結(jié)核病又能抗羊癢病的雙抗羊，科學(xué)家進(jìn)行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前發(fā)現(xiàn)的具有抗結(jié)核桿菌感染功能的基因。研究人員為了驗(yàn)證SP110基因的功能，同時(shí)也為了驗(yàn)證山羊吞噬細(xì)胞特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成融合基因，設(shè)計(jì)了下表所示的三組實(shí)驗(yàn)。
取三組實(shí)驗(yàn)等量的細(xì)胞裂解液，用_____法培養(yǎng)，結(jié)果如下圖1所示。由圖可知小鼠SP110基因可用于雙抗羊的研制，依據(jù)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，PRNP基因的結(jié)構(gòu)如圖2．研究人員用新型基因敲除技術(shù)對體外培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞PRNP基因的外顯子3序列實(shí)施定點(diǎn)敲除。請根據(jù)上述信息，設(shè)計(jì)一個(gè)檢測敲除是否成功的思路：提取山羊成纖維細(xì)胞的DNA，根據(jù)_____設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，并用_____作用于PCR產(chǎn)物后進(jìn)行凝膠電泳，若僅獲得一條電泳條帶，說明定點(diǎn)敲除成功。
（3）用TALEN敲除載體與供體DNA表達(dá)載體（圖4）共同轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的幼羊成纖維細(xì)胞，可將融合基因定點(diǎn)敲入PRNP基因的外顯子3部位，原理如圖3．請指出圖4中數(shù)字1和2的分別代表的結(jié)構(gòu)：1．_____、2．_____。經(jīng)用_____法檢測，山羊成纖維細(xì)胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表達(dá)情況是_____（填“兩者均增加”或“兩者均減少或不表達(dá)”或“前者減少、后者增加”或“前者增加、后者減少”）。
（4）欲用上述細(xì)胞獲得雙抗羊，需要用到的技術(shù)有_____（至少寫出兩項(xiàng)）。
【答案】（1） ①. 接種等量的結(jié)核桿菌 ②. 含有融合基因與質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒的山羊肺泡吞噬細(xì)胞 ③. 等量蒸餾水 ④. 稀釋涂布平板 ⑤. 組3的吞噬細(xì)胞裂解后釋放的結(jié)核桿菌數(shù)量與組2接近，顯著小于組1
（2） ①. 外顯子3的（部分）序列 ②. BamHⅠ
（3） ①. L4序列 ②. MRS啟動子 ③. 抗原抗體雜交技術(shù) ④. 均降低（或不表達(dá)）
（4）體細(xì)胞核移植、動物細(xì)胞培養(yǎng)（早期胚胎培養(yǎng)）、胚胎移植
【解析】
【分析】基因工程中的操作工具及其作用：
①“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶），能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。
②“分子縫合針”——DNA連接酶，E·cliDNA連接酶，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合黏性末端和平末端。
③“分子運(yùn)輸車”——載體。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上?；虮磉_(dá)載體常包括目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因。標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。
【小問1詳解】
實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖球?yàn)證SP110基因的功能，同時(shí)驗(yàn)證山羊吞噬細(xì)胞特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，自變量是是否有SP110基因、是否有特異性啟動子MSR，實(shí)驗(yàn)組是將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成融合基因，構(gòu)建成重組質(zhì)粒后導(dǎo)入肺泡吞噬細(xì)胞，現(xiàn)在已經(jīng)設(shè)置轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的山羊吞噬細(xì)胞為對照組（組1），還需要設(shè)置已經(jīng)轉(zhuǎn)入廣泛表達(dá)小鼠SP110基因的重組質(zhì)粒的山羊吞噬細(xì)胞（組3）作為對照組。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要用限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接在一起。分別接種等量的結(jié)核桿菌，經(jīng)72h后需要使吞噬細(xì)胞破裂，應(yīng)加入蒸餾水使其吸水膨漲破裂。取三組實(shí)驗(yàn)等量的細(xì)胞裂解液，用稀釋涂布平板法培養(yǎng)，根據(jù)圖1，實(shí)驗(yàn)組（組2）的吞噬細(xì)胞裂解后釋放的結(jié)核桿菌數(shù)量和組3接近，顯著小于1組，說明特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
【小問2詳解】
由圖可知，外顯子3序列內(nèi)部存在限制酶BamHⅠ識別序列，若利用基因敲除技術(shù)對體外培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞PRNP基因的外顯子3序列實(shí)施定點(diǎn)敲除，則外顯子3內(nèi)部限制酶BamHⅠ識別序列被破壞，因此檢測敲除是否成功可提取山羊成纖維細(xì)胞的DNA，根據(jù)外顯子3的（部分）序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，并用BamHⅠ作用于PCR產(chǎn)物后進(jìn)行凝膠電泳，若僅獲得一條電泳條帶，說明定點(diǎn)敲除成功。
【小問3詳解】
非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，為了降低非致病性朊蛋白的量，同時(shí)又能抗結(jié)核病，可設(shè)計(jì)用將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成的融合基因替換PRNP基因的第三外顯子，據(jù)圖2和圖3，對山羊成纖維細(xì)胞L4與R1之間的序列實(shí)施定點(diǎn)敲除，將TALEN敲除載體與供體DNA載體（MRS啟動子與小鼠SP110基因形成的融合基因）共轉(zhuǎn)化幼羊成纖維細(xì)胞，將SP110基因定點(diǎn)敲入PRNP基因的第三外顯子中。則圖4中供體DNA表達(dá)載體中：1是L4序列（和第三外顯子前的L4序列同源），2是MRS啟動子，3是終止子（使SP110基因轉(zhuǎn)錄停止），4是R1序列（和第三外顯子后的R1序列同源）。若想對山羊成纖維細(xì)胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，則需要進(jìn)行抗原抗體雜交技術(shù)。由于PRNP基因的第三外顯子被敲除，非致病性朊蛋白基因不表達(dá)，由于成纖維細(xì)胞中特異性啟動子MSR不能發(fā)揮作用，SP110基因也不表達(dá)。
【小問4詳解】
若將TALEN敲除載體與供體DNA載體共轉(zhuǎn)化幼羊成纖維細(xì)胞獲得雙抗羊，首先將該細(xì)胞細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞分裂、分化，進(jìn)行早期胚胎細(xì)胞培養(yǎng)，到適宜階段進(jìn)行胚胎移植，移入適宜的代孕母體。
限制酶
識別序列及切割位點(diǎn)
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
組別
主要操作
培養(yǎng)細(xì)胞后，使之破裂
對照組1
空質(zhì)粒導(dǎo)入山羊肺泡吞噬細(xì)胞，接種適量結(jié)核桿菌
細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，加入③_____，使吞噬細(xì)胞破裂，釋放結(jié)核桿菌
對照組2
含有能廣泛表達(dá)SP110基因的山羊肺泡吞噬細(xì)胞，①_____
實(shí)驗(yàn)組
②_____，接種等量的結(jié)核桿菌

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