（第Ⅰ卷）
一、單項選擇題：本題共19個小題，每小題2分，共38分。在每小題給出的四個選項中，只有一項是符合題目要求的。
1. 下圖表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表達載體的構建中的作用，下列有關敘述錯誤的是（ ）
A. 限制酶沿識別序列的中軸線兩側將DNA兩條鏈切開
B. 在圖1和圖2中將分別產生4個和2個粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之間的磷酸二酯鍵和氫鍵
D. 圖示中酶1、酶2和酶3可以為不同種類的限制酶
2. 下圖是幾種限制酶的切割位點，下列說法正確的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通過E．cliDNA連接酶相互連接
B. DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成
C. 所有限制酶識別序列均由6個核苷酸組成
D. SmaI切割后產生的是黏性末端
3. T4 DNA連接酶可將任意2個具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸（AMP）通過共價鍵與酶相連，隨后AMP轉移至DNA片段，進而完成連接反應。下列敘述正確的是（ ）
A. T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無專一性
B. T4 DNA連接酶催化反應后，其組成成分已改變
C. ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵
D. T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
4. 科研人員以抗四環(huán)素基因為標記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細胞貧血癥。下列相關實驗設計，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、啟動子、終止子、抗四環(huán)素基因等元件來構建基因表達載體
B. 利用正常小鼠DNA分子通過PCR克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列
C. 用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經導入β-珠蛋白編碼序列的大腸桿菌
D. 將β-珠蛋白基因表達載體導入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中
5. 如圖表示利用現(xiàn)代生物工程技術制備山羊乳腺生物反應器的流程圖，目的是從轉基因山羊的乳汁中獲得人乳鐵蛋白。已知細胞甲是來自雌山羊的胚胎成纖維細胞，下列相關敘述錯誤的是（ ）

A. 完成圖中①過程用到了質粒、限制酶和DNA連接酶等
B. 篩選出的細胞乙是含有目的基因的胚胎成纖維細胞
C. 該重構胚發(fā)育至囊胚時需要進行DNA分析以鑒定性別
D. 圖示流程中，②④⑤過程都用到了顯微操作技術
6. 噬菌體展示技術是將編碼某蛋白質的基因導入噬菌體的DNA中，使該外源基因隨噬菌體外殼蛋白表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。以下對該技術分析正確的是（ ）
A. 噬菌體展示技術的遺傳學原理是基因突變
B. 構建目的基因表達載體時需使用限制酶和DNA酶
C. 需用營養(yǎng)成分齊全的培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)噬菌體
D. 可利用抗原—抗體雜交技術篩選目標蛋白
7. 將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿海水稻新品種。下圖PCR擴增OsMYB56時需要添加引物，應選用引物組合為（ ）

A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
8. 下圖為采用“實時熒光定量RT-PCR(即將病毒RNA逆轉錄后再進行PCR擴增)”技術檢測2019nCV核酸的基本流程，1～2h內即可得到檢測結果。有關說法正確的是（ ）

A. 過程①是逆轉錄過程，不屬于中心法則的內容
B. 過程②表示擴增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 熒光標記法還可以用于探究DNA的復制方式
D. RT-PCR反應體系中加入的原料是脫氧核苷酸
9. 食物中的生物胺會引起胃腸道不適和過敏等不良反應，微生物來源的多銅氧化酶(MCO)能高效分解生物胺?？蒲腥藛T采用PCR技術獲得發(fā)酵乳酸桿菌的MCO基因，然后轉入大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達。若目的基因MCO經限制酶切開后的末端如圖甲，要MCO片段能與載體質粒pCLY15(圖乙)高效連接，需用于切割的酶組合為（ ）

A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
10. 霍亂是因感染霍亂弧菌引起的一種傳染性非常強的消化道疾病，患者往往上吐下瀉，甚至死亡。研究人員通過基因工程改變大米的蛋白質構成，使其攜帶一種叫“霍亂毒素B”的物質，該物質進入人體后，能促進人體產生免疫反應，有效預防霍亂的感染。下列有關說法錯誤的是（ ）
A. 大米中攜帶的霍亂毒素B相當于抗原，能激發(fā)人體產生特異性免疫反應
B. 該項研究成功的標志是人體產生相應的記憶細胞和針對霍亂毒素B的特異性抗體
C. 當接種者再次接觸抗原時，體內記憶細胞會迅速分泌大量抗體，與抗原特異性結合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重組的原理，效果明顯，可造福世界人民
11. 科學家利用基因工程培育出了能產生乙肝病毒蛋白質的西紅柿，被稱之為“西紅柿乙肝疫苗”。具體操作是：將乙肝抗原基因M導入農桿菌，然后利用農桿菌將M導入西紅柿細胞。實驗顯示小白鼠連續(xù)五周吃這樣的西紅柿，體內產生了抗乙肝病毒的抗體，下列敘述錯誤的（ ）
A. 實驗用PCR技術對M基因進行擴增，需要兩種引物
B. 含M的重組Ti質粒必須插入到西紅柿染色體DNA上
C. 即使M在西紅柿中成功表達，也要做個體生物學水平鑒定
D. 西紅柿乙肝疫苗成本相對較低且易于儲存
12. PCR引物的3'端為結合模板DNA的關鍵，5'端無嚴格限制，可用于添加限制酶切點等序列，dNTP是DNA合成的原料，還可供能。下列相關說法錯誤的是（ ）
A. 圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個環(huán)節(jié)的低
B. 引物的設計要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高溫Taq酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈
D. 1個循環(huán)后，子代DNA雙鏈的脫氧核苷酸數(shù)量相同
13. 幽門螺桿菌（Hp）感染會引發(fā)胃炎、消化性潰瘍等多種疾病。研究人員將Hp的Ipp20基因作為目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通過基因工程制備相應的疫苗，質粒及操作步驟如圖所示。下列相關敘述錯誤的是（ ）

A. Ipp20基因整合到大腸桿菌的DNA中屬于基因重組
B. 基因表達載體導入之前，可用Ca2+處理大腸桿菌
C. 培養(yǎng)基A中添加了氯霉素，培養(yǎng)基B中添加了潮霉素
D. 能用來生產Hp疫苗的大腸桿菌在菌落3和5中
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實時監(jiān)控CD163蛋白的表達和轉運過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起（如下圖），使其表達成一條多肽。該拼接過程的關鍵步驟是除去（ ）

A. CD163基因中編碼起始密碼子的序列
B. CD163基因中編碼終止密碼子序列
C. RFP基因中編碼起始密碼子的序列
D. RFP基因中編碼終止密碼子的序列
二、多項選擇題：本題共4小題，每小題3分，共12分。在每小題給出的四個選項中，有兩個或兩個以上選項符合題目要求。全部選對得3分，選對但不全的得1分，有選錯的得0分。
15. 限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（ ）
A. DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
B. 限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
C. E.cliDNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端
D. 限制酶主要從原核生物中分離純化而來，不能剪切自身的DNA
16. 人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補作用。干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程。①?④表示相關的操作， EcR I 、BamHI為限制酶，它們的識別序列及切割位點如 下表所示。下列有關敘述錯誤的是（ ）
A. 過程①所需的兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列有利于后續(xù)操作
B. 構建基因表達載體時，目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進行復制
C. 過程③利用的是T-DNA的特性將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA中
D. 過程④需控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細胞發(fā)生再分化
17. RT-PCR是將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。下圖是RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析，下列敘述正確的是（ ）

A. 該技術可用來檢測新冠病毒等RNA病毒
B. 該技術可用來檢測組織細胞中基因是否轉錄
C. ①過程需要的酶是逆轉錄酶，③過程需要的酶是耐高溫的DNA聚合酶
D. ③過程中DNA解鏈后，應升高反應體系溫度使引物與模板結合
18. 科研人員將釀酒酵母質粒上的丙酮酸脫氫酶基因（PD）替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因（LPG），可獲得乳酸乙酯（白酒香味的主要來源）高產菌株，過程如圖。下列分析合理的是（ ）

A. 轉入的LPG基因表達產物不能影響釀酒酵母的活性
B. LPG基因替換質粒上的PD基因需要兩端攜帶相同基因片段
C. 標記基因Ampr可檢測是否成功構建乳酸乙酯高產菌株
D. 可以利用PCR技術篩選含有LPG基因的受體細胞
（第Ⅱ卷）
三、綜合題：共4題，每題15分，共60分。
19. 葉用萵苣（如生菜）是大眾喜愛蔬菜，夏季高溫極易引起先期抽苔造成減產，泛素連接酶（LsE3）是研究人員在萵苣高溫抽苔植株中篩選得到的。LsE3基因受溫度調控，影響萵苣抽苔，但是LsE3基因作用機制尚不清楚。研究人員用無縫克隆技術構建萵苣LsE3基因的表達載體用于研究其分子機理。無縫克隆技術是構建表達載體的一種技術如圖2。

（1）目的基因獲取，在_____條件下，提取先期抽苔萵苣細胞中_____，經_____獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術擴增LsE3基因。PCR擴增除了圖1標出的物質以外，還需加入_____（至少寫兩種）。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中需要兩種引物F（左側）、R（右側）選用_____（選項中為引物部分序列，方向為5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表達載體構建，近年來新一代無縫克隆技術發(fā)展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成為目前研究的熱點。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技術（如圖2）。 T4 DNA 聚合酶在反應體系中沒有添加dNTP情況下具有 3'→5'外切酶活性；在反應體系中添加dNTP情況下具有5'→3'聚合酶活性；在反應體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時，外切酶活性和聚合酶活性同時發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應，產生指定長度的單鏈黏性末端。請結合圖1和圖2回答下列問題：
①LIC技術構建表達載體，圖1中利用PCR擴增LsE3基因，反應液中加入T4 DNA聚合酶和_____處理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質粒獲得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____處理質粒。處理后將兩者混合、退火并導入細胞內完成重組克隆。
②LIC技術依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術，后經過多次改進，Qi等建立了RQ-SLIC技術，用EcRⅤ酶切割質粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當時間，將混合物加熱到72℃，目的是_____，緩慢降溫（退火）后移入細胞內轉化修復形成完整重組質粒，細胞內轉化修復過程中用到_____酶。
（3）導入受體細胞，取葉用萵苣幼芽經_____（過程）形成愈傷組織備用，用_____處理農桿菌后導入重組質粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入_____植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出成功導入質粒的植物細胞。
20. CD3D嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突變引起的，該突變阻止了T細胞生長發(fā)育所需的CD3D蛋白的合成?？蒲腥藛T對第3代CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進行改造，獲得一種超精確的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），該系統(tǒng)主要由向導sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶組成，作用機制如圖1。利用該系統(tǒng)在CD3D-SCID患者的造血干細胞中可以更正約71.2%的致病突變。

（1）研究發(fā)現(xiàn)，Cas9切口酶催化雙鏈DNA___鍵水解，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸轉變成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸堿基互補配對，據此推測，至少通過___次DNA復制可以完成修復。
（2）sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補配對的特殊序列，由23個連續(xù)堿基組成。sgRNA設計是否合理，對于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的切割有重要影響，否則會導致sgRNA脫靶，試分析其原因是___。
（3）為了對改造后的CD3D基因進行研究，把CD3D基因和His標簽基因（His標簽由6個組氨酸組成）連接起來構建融合基因，并構建重組基因表達載體，圖2為載體、CD3D基因的結構、不同限制酶的識別序列及切割位點，欲將標簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，已知組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG。

①PCR的一般過程為___，在變性之前通常有預變性，其目的是___。判斷是否擴增出DNA片段，判斷的依據是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及___來評價擴增的結果。如果電泳鑒定的結果不止一條條帶分析可能的原因有___（至少答兩點）。
②寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5′___3′。
③為構建融合基因并將其插入載體，科研人員設計了一對與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補配對的引物，設計時需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的識別序列和His基因的編碼序列，請寫出該引物開頭的12個堿基序列：5′___3′。
21. 畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時需要大量表達醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的長度為2200bp。科研人員將蜂毒肽（MEL）與石斑魚c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA質粒上構建重組表達質粒，導入畢赤酵母以獲得高效低毒的廣譜抑菌融合蛋白，實驗的主要流程如下，請回答：
注：重組質粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜帶石斑魚c型溶菌酶屬于免疫系統(tǒng)的_______。相對于原核表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)翻譯出的蛋白可以經過_______加工修飾，表達的蛋白具有天然生物學活性。
（2）為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同時兩端帶有pPICZαA的同源序列，過程①PCR反應體系中加入的模板是_______，引物應該選擇以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）過程②將PCR產物片段與線性化的pPICZαA混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質粒，這一過程與傳統(tǒng)構建重組質粒相比不需要_______酶。
（4）為了驗證構建是否成功，利用限制性內切酶EcRI和SalI對提取出重組質粒2進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示分別得到大小約為_______（限制酶識別序列不計）的片段。過程③將重組質粒2導入大腸桿菌的目的是_______。
（5）過程⑤培養(yǎng)畢赤酵母時加入_______作為唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因與宿主基因組染色體的交換方式包括單交換和雙交換。含有目的基因的載體插入宿主染色體的AOX1基因的上游或下游，不影響AOX1基因的正常表達，屬于單交換；當發(fā)生基因取代時，含目的基因的載體與宿主染色體中AOX1基因區(qū)域發(fā)生交換，宿主AOX1基因編碼區(qū)域被全部取代，屬于雙交換。以AOX1基因兩端序列為依據設計引物，對三株重組酵母（編號1、2、3）進行菌液PCR、電泳后得到下圖，根據結果推斷目的基因與宿主基因組染色體發(fā)生單交換的酵母菌株有_______。
22. 結核病是由結核桿菌引起的人畜共患病。結核桿菌通常以氣溶膠形式傳播，氣溶膠顆粒被肺泡吞噬細胞吞噬，吞噬細胞破裂導致結核桿菌在機體內進一步傳播。羊癢病是由正常細胞的非致病性朊蛋白異構化為癢病朊蛋白所致。為研制既能抗結核病又能抗羊癢病的雙抗羊，科學家進行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前發(fā)現(xiàn)的具有抗結核桿菌感染功能的基因。研究人員為了驗證SP110基因的功能，同時也為了驗證山羊吞噬細胞特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細胞內的表達，將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成融合基因，設計了下表所示的三組實驗。
取三組實驗等量的細胞裂解液，用_____法培養(yǎng)，結果如下圖1所示。由圖可知小鼠SP110基因可用于雙抗羊的研制，依據的實驗現(xiàn)象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，PRNP基因的結構如圖2．研究人員用新型基因敲除技術對體外培養(yǎng)的山羊成纖維細胞PRNP基因的外顯子3序列實施定點敲除。請根據上述信息，設計一個檢測敲除是否成功的思路：提取山羊成纖維細胞的DNA，根據_____設計引物進行PCR，并用_____作用于PCR產物后進行凝膠電泳，若僅獲得一條電泳條帶，說明定點敲除成功。
（3）用TALEN敲除載體與供體DNA表達載體（圖4）共同轉化體外培養(yǎng)的幼羊成纖維細胞，可將融合基因定點敲入PRNP基因的外顯子3部位，原理如圖3．請指出圖4中數(shù)字1和2的分別代表的結構：1．_____、2．_____。經用_____法檢測，山羊成纖維細胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表達情況是_____（填“兩者均增加”或“兩者均減少或不表達”或“前者減少、后者增加”或“前者增加、后者減少”）。
（4）欲用上述細胞獲得雙抗羊，需要用到的技術有_____（至少寫出兩項）。限制酶
識別序列及切割位點
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
組別
主要操作
培養(yǎng)細胞后，使之破裂
對照組1
空質粒導入山羊肺泡吞噬細胞，接種適量結核桿菌
細胞培養(yǎng)72小時后，加入③_____，使吞噬細胞破裂，釋放結核桿菌
對照組2
含有能廣泛表達SP110基因的山羊肺泡吞噬細胞，①_____
實驗組
②_____，接種等量的結核桿菌
江蘇省靖江高級中學2023-2024學年第二學期階段測試
高二生物試卷
（第Ⅰ卷）
一、單項選擇題：本題共19個小題，每小題2分，共38分。在每小題給出的四個選項中，只有一項是符合題目要求的。
1. 下圖表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表達載體的構建中的作用，下列有關敘述錯誤的是（ ）
A. 限制酶沿識別序列的中軸線兩側將DNA兩條鏈切開
B. 在圖1和圖2中將分別產生4個和2個粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之間的磷酸二酯鍵和氫鍵
D. 圖示中酶1、酶2和酶3可以為不同種類的限制酶
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程:目的基因的篩選與獲取、構建基因表達載體、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。
農桿菌轉化法:取Ti質粒和目的基因構建基因表達載體、將基因表達載體轉入農桿菌、將農桿菌導入植物細胞、將植物細胞培育為新性狀植株。
【詳解】A、由圖可知，產生的是黏性末端，所以可知限制酶在它識別序列的中軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開的，A正確；
B、由圖可知，圖1中含有酶1和酶2，能產生4個黏性末端，圖2中含有酶2，能產生2個黏性末端，B正確；
C、限制酶切割的是特定核苷酸序列之間的磷酸二酯鍵，不會切割氫鍵，C錯誤；
D、限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，圖示中酶1、酶2和酶3可以為不同種類的限制酶，D正確。
故選C。
2. 下圖是幾種限制酶的切割位點，下列說法正確的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通過E．cliDNA連接酶相互連接
B. DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成
C. 所有限制酶的識別序列均由6個核苷酸組成
D. SmaI切割后產生的是黏性末端
【答案】B
【解析】
【分析】1、限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。
2、DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
【詳解】A、限制酶Sma I和EcR V切割形成的是平末端，E.cliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，但連接效率較低，A錯誤；
B、DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵；RNA聚合酶將單個核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵，B正確；
C、并不是所有的限制酶的識別序列都是由6個核苷酸組成，有些限制酶的識別序列有4個或8個核苷酸組成，C錯誤；
D、SmaI切割后產生的是平末端，D錯誤。
故選B。
3. T4 DNA連接酶可將任意2個具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸（AMP）通過共價鍵與酶相連，隨后AMP轉移至DNA片段，進而完成連接反應。下列敘述正確的是（ ）
A. T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無專一性
B. T4 DNA連接酶催化反應后，其組成成分已改變
C. ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵
D. T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
【答案】C
【解析】
【分析】1、DNA連接酶分為E. cliDNA連接酶和T4DNA連接酶。DNA連接酶連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。這二者都能連接黏性末端，此外T4DNA連接酶還可以連接平末端，但連接平末端時的效率比較低。
2、酶的特性：專一性、高效性和作用條件溫和。
3、酶是催化劑，在催化反應前后性質不變。
【詳解】A、T4DNA連接酶有專一性，A錯誤；
B、酶在催化反應前后性質不變，故T4DNA連接酶催化反應后，其組成成分不變，B錯誤；
C、ATP水解產生AMP需要打開兩個特殊的化學鍵，結合題干“該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸（AMP）通過共價鍵與酶相連”可推測ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵，C正確；
D、T4DNA連接酶需在低溫和最適pH條件下保存，D錯誤。
故選C。
4. 科研人員以抗四環(huán)素基因為標記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細胞貧血癥。下列相關實驗設計，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、啟動子、終止子、抗四環(huán)素基因等元件來構建基因表達載體
B. 利用正常小鼠DNA分子通過PCR克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列
C. 用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經導入β-珠蛋白編碼序列的大腸桿菌
D. 將β-珠蛋白基因表達載體導入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中
【答案】D
【解析】
【分析】基因表達載體包括啟動子、目的基因（β珠蛋白基因）、標記基因（抗四環(huán)素基因）、終止子等。抗四環(huán)素基因是標記基因，用于篩選導入重組質粒的受體細胞，因此受體細胞（大腸桿菌）不含有四環(huán)素抗性基因。導入重組質粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，因此可以用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經導入β珠蛋白編碼序列的大腸桿菌。
【詳解】A、基因表達載體包括啟動子、目的基因（β珠蛋白基因）、標記基因（抗四環(huán)素基因）、終止子等，A正確；
B、β珠蛋白基因屬于目的基因，可以利用正常小鼠DNA分子為模板，利用PCR技術擴增，B正確；
C、標記基因是四環(huán)素抗性基因，因此用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經導入β-珠蛋白編碼序列的大腸桿菌，C正確；
D、標記基因是四環(huán)素抗性基因，說明受體細胞大腸桿菌本身不具有四環(huán)素抗性，D錯誤。
故選D。
5. 如圖表示利用現(xiàn)代生物工程技術制備山羊乳腺生物反應器的流程圖，目的是從轉基因山羊的乳汁中獲得人乳鐵蛋白。已知細胞甲是來自雌山羊的胚胎成纖維細胞，下列相關敘述錯誤的是（ ）

A. 完成圖中①過程用到了質粒、限制酶和DNA連接酶等
B. 篩選出的細胞乙是含有目的基因的胚胎成纖維細胞
C. 該重構胚發(fā)育至囊胚時需要進行DNA分析以鑒定性別
D. 圖示流程中，②④⑤過程都用到了顯微操作技術
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技術的步驟：目的基因的獲取，主要有三種方法：基因文庫、PCR技術擴增、人工合成；基因表達載體構建，表達載體組成：啟動子+目的基因+終止子+標記基因；目的基因導入受體細胞，動物細胞（受體）采用顯微注射技術導入，植物細胞（受體）采用農桿菌轉化法或花粉管通道法導入，微生物細胞（受體）采用感受態(tài)細胞法導入；目的基因檢測與鑒定，采用分子檢測、個體生物學水平鑒定。
【詳解】A、完成圖中①過程需要構建基因表達載體，用到了質粒、限制酶和DNA連接酶等，A正確；
B、將目的基因導入雌山羊的胚胎成纖維細胞，再篩選出含有目的基因的胚胎成纖維細胞，B正確；
C、圖中的供體細胞細胞核來自雌性山羊，則胚胎移植后生出的小羊性別為雌性，因此并不需要進行性別鑒別，C錯誤；
D、圖示流程中，②將重組質粒導入動物細胞用顯微操作技術，④需要在顯微鏡下去核，⑤需要在顯微鏡下進行注入操作技術，D正確。
故選C。
6. 噬菌體展示技術是將編碼某蛋白質的基因導入噬菌體的DNA中，使該外源基因隨噬菌體外殼蛋白表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。以下對該技術分析正確的是（ ）
A. 噬菌體展示技術的遺傳學原理是基因突變
B. 構建目的基因表達載體時需使用限制酶和DNA酶
C. 需用營養(yǎng)成分齊全的培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)噬菌體
D. 可利用抗原—抗體雜交技術篩選目標蛋白
【答案】D
【解析】
【分析】題意分析，噬菌體展示技術離不開基因工程的支持?；蚬こ痰牟僮鞑襟E是：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】A、題中技術的原理是將目標基因與噬菌體DNA重組，屬于基因工程的范疇，其遺傳學原理是基因重組，A錯誤；
B、構建目的基因表達載體時需使用限制酶和DNA連接酶，而DNA酶會水解DNA，B錯誤；
C、噬菌體沒有細胞結構，不能獨立生活，必須用含有活細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)噬菌體，C錯誤；
D、抗原-抗體雜交可以檢測特定的蛋白質，因此可利用抗原—抗體雜交技術篩選目標蛋白，D正確。
故選D。
7. 將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿海水稻新品種。下圖PCR擴增OsMYB56時需要添加引物，應選用的引物組合為（ ）

A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
【答案】A
【解析】
【分析】PCR技術可特異性的擴增DNA片段，關鍵在于引物可以和特定DNA片段的3'端特異性結合，使Taq酶沿引物的3'端延伸子鏈。
【詳解】―端為DNA鏈的5'端，―OH端為DNA鏈的3'端。進行PCR時，引物與模板鏈的3'端結合，因此在擴增OsMYB56時需要添加的引物是5'-CTTGCATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'，A項符合題意，BCD不符合題意。
故選A。
8. 下圖為采用“實時熒光定量RT-PCR(即將病毒RNA逆轉錄后再進行PCR擴增)”技術檢測2019nCV核酸的基本流程，1～2h內即可得到檢測結果。有關說法正確的是（ ）

A. 過程①是逆轉錄過程，不屬于中心法則的內容
B. 過程②表示擴增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 熒光標記法還可以用于探究DNA的復制方式
D. RT-PCR反應體系中加入的原料是脫氧核苷酸
【答案】D
【解析】
【分析】圖中過程①表示以RNA為模板合成DNA為逆轉錄，過程②表示利用PCR擴增DNA片段。
【詳解】A、過程①表示以RNA為模板合成DNA，表示逆轉錄過程，屬于中心法則內容之一，A錯誤；
B、過程②表示利用PCR擴增DNA片段，需要用到的酶有TaqDNA聚合酶，B錯誤；
C、探究DNA的復制方式采用同位素標記法，不是熒光標記法，C錯誤；
D、逆轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程，PCR是體外模擬DNA復制的技術，所以應加入的原料是4種脫氧核苷酸，D正確。
故選D
9. 食物中的生物胺會引起胃腸道不適和過敏等不良反應，微生物來源的多銅氧化酶(MCO)能高效分解生物胺?？蒲腥藛T采用PCR技術獲得發(fā)酵乳酸桿菌的MCO基因，然后轉入大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達。若目的基因MCO經限制酶切開后的末端如圖甲，要MCO片段能與載體質粒pCLY15(圖乙)高效連接，需用于切割的酶組合為（ ）

A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
【答案】C
【解析】
【分析】題意分析，根據酶切位點分析，目的基因應位于啟動子和終止子之間，為高效連接應選用黏性末端相同的酶，而不能選用平末端，故目的基因應使用Kpnl和Xmal切割。
【詳解】KpnⅠ酶切后產生 5′?GTAC?3′的末端，XmaⅠ酶切后產生 5′?CCGG?3′的末端，剛好與目的基因的游離末端配對，因此，切割pCLY15的酶組合為KpnⅠ和XmaⅠ，C正確。
故選C。
10. 霍亂是因感染霍亂弧菌引起的一種傳染性非常強的消化道疾病，患者往往上吐下瀉，甚至死亡。研究人員通過基因工程改變大米的蛋白質構成，使其攜帶一種叫“霍亂毒素B”的物質，該物質進入人體后，能促進人體產生免疫反應，有效預防霍亂的感染。下列有關說法錯誤的是（ ）
A. 大米中攜帶的霍亂毒素B相當于抗原，能激發(fā)人體產生特異性免疫反應
B. 該項研究成功的標志是人體產生相應的記憶細胞和針對霍亂毒素B的特異性抗體
C. 當接種者再次接觸抗原時，體內記憶細胞會迅速分泌大量抗體，與抗原特異性結合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重組的原理，效果明顯，可造福世界人民
【答案】C
【解析】
【分析】通過基因工程技術可使大米合成“霍亂毒素B”的物質，該物質進入人體可引起人體產生特異性免疫，使機體產生針對相應抗原的記憶細胞和抗體。
【詳解】A、大米中攜帶的霍亂毒素B相當于抗原，能激發(fā)人體產生特異性免疫反應，使機體產生記憶細胞，A正確；
B、該項研究成功標志是人體產生相應的記憶細胞和針對霍亂毒素B的特異性抗體，當相應抗原進入機體后，記憶細胞可增殖分化形成漿細胞，產生大量抗體，抗體與霍亂毒素結合，B正確；
C、抗體是漿細胞分泌的，C錯誤；
D、“大米疫苗”的研制主要利用了基因重組的原理，該“大米疫苗”生產簡單、成本低廉且效果明顯，可造福世界人民，D正確。
故選C。
11. 科學家利用基因工程培育出了能產生乙肝病毒蛋白質的西紅柿，被稱之為“西紅柿乙肝疫苗”。具體操作是：將乙肝抗原基因M導入農桿菌，然后利用農桿菌將M導入西紅柿細胞。實驗顯示小白鼠連續(xù)五周吃這樣的西紅柿，體內產生了抗乙肝病毒的抗體，下列敘述錯誤的（ ）
A. 實驗用PCR技術對M基因進行擴增，需要兩種引物
B. 含M的重組Ti質粒必須插入到西紅柿染色體DNA上
C. 即使M在西紅柿中成功表達，也要做個體生物學水平鑒定
D. 西紅柿乙肝疫苗成本相對較低且易于儲存
【答案】B
【解析】
【分析】基因工程的基本操作步驟主要包括：①目的基因的獲取；②基因表達載體的構建；③將目的基因導入受體細胞；④目的基因的檢測與表達。
【詳解】A、導入前目的基因需要對M基因擴增，PCR需要兩種引物結合M基因的兩條鏈合成相應子鏈，A正確；
B、含M的T-DNA插入到西紅柿染色體DNA上，才能穩(wěn)定存在和表達，而不是整個Ti質粒，B錯誤；
C、即使M在西紅柿中成功表達，也必須在個體生物學水平鑒定，來確定實際效果，C正確；
D、西紅柿種植容易，成本低且易儲存，D正確。
故選B。
12. PCR引物的3'端為結合模板DNA的關鍵，5'端無嚴格限制，可用于添加限制酶切點等序列，dNTP是DNA合成的原料，還可供能。下列相關說法錯誤的是（ ）
A. 圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個環(huán)節(jié)的低
B. 引物的設計要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高溫Taq酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈
D. 1個循環(huán)后，子代DNA雙鏈的脫氧核苷酸數(shù)量相同
【答案】D
【解析】
【分析】1、PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在體外復制特定的DNA的核酸合成技術。
2、原理：DNA復制。
3、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Tag 酶）。
【詳解】A、圖示環(huán)節(jié)為引物與模板堿基互補配對，表示的是復性環(huán)節(jié)，復性的上一環(huán)節(jié)為變性，復性的溫度比變性的溫度低，A正確；
B、引物的設計要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保證其與已知模板能堿基配對，在后續(xù)擴增的過程中才能進行子鏈的延伸，B正確；
C、子鏈是從5'-3'端延伸的，耐高溫Tag 酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈，C正確；
D、由于兩個引物均不在該片段的端點，因此一個循環(huán)后，子代DNA雙鏈的脫氧核苷酸數(shù)量不相同，D錯誤。
故選D。
13. 幽門螺桿菌（Hp）感染會引發(fā)胃炎、消化性潰瘍等多種疾病。研究人員將Hp的Ipp20基因作為目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通過基因工程制備相應的疫苗，質粒及操作步驟如圖所示。下列相關敘述錯誤的是（ ）

A. Ipp20基因整合到大腸桿菌的DNA中屬于基因重組
B. 基因表達載體導入之前，可用Ca2+處理大腸桿菌
C. 培養(yǎng)基A中添加了氯霉素，培養(yǎng)基B中添加了潮霉素
D. 能用來生產Hp疫苗的大腸桿菌在菌落3和5中
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技術的基本步驟：
1.目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成。
2.基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
3.將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
【詳解】A、基因重組是指控制不同性狀基因發(fā)生重新組合，主要發(fā)生在有性生殖過程中，但通過基因工程將不同來源的 DNA 拼接，可以賦予生物新的遺傳特性，也屬于基因重組的范疇，故利用基因工程將Ipp20基因整合到大腸桿菌的DNA中屬于基因重組，A正確；
B、原核細胞作為受體細胞時，可用Ca2+處理受體細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，更容易將基因表達載體導入其中，B正確；
CD、該過程使用了限制酶 Xh I和Xba I切割質粒和Ipp20基因，結合圖示可知，在構建目的基因表達載體的過程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常質粒還是重組質粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常質粒才同時含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培養(yǎng)基A篩選出導入正常質粒、重組質粒的大腸桿菌，再采用同位影印接種到含有氯霉素的培養(yǎng)基B和含有潮霉素的培養(yǎng)基A中，此時含有重組質粒的大腸桿菌不能在含有氯霉素的培養(yǎng)基 B上生長，從而與培養(yǎng)基A（對照）相比會消失一些菌落，對照兩個平板上減少的菌落就是符合要求的大腸桿菌菌落，結合圖示可知，符合要求的大腸桿菌菌落是3和5，C錯誤，D正確。
故選C。
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實時監(jiān)控CD163蛋白的表達和轉運過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起（如下圖），使其表達成一條多肽。該拼接過程的關鍵步驟是除去（ ）

A. CD163基因中編碼起始密碼子的序列
B. CD163基因中編碼終止密碼子的序列
C. RFP基因中編碼起始密碼子的序列
D. RFP基因中編碼終止密碼子的序列
【答案】B
【解析】
【分析】基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因啟動子終止子和標記基因等。
【詳解】為實時監(jiān)控CD163蛋白的表達和轉運過程，則拼接在一起的紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因都得轉錄和翻譯，使其表達成一條多肽，因此拼接在一起的CD163基因轉錄形成的mRNA中不能出現(xiàn)終止密碼子，否則紅色熒光蛋白RFP基因轉錄形成的mRNA不能進行翻譯，無法合成紅色熒光蛋白，因此該拼接過程的關鍵步驟是除去CD163基因中編碼終止密碼子的序列，B符合題意，ACD不符合題意。
故選B。
二、多項選擇題：本題共4小題，每小題3分，共12分。在每小題給出的四個選項中，有兩個或兩個以上選項符合題目要求。全部選對得3分，選對但不全的得1分，有選錯的得0分。
15. 限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（ ）
A. DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
B. 限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
C. E.cliDNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端
D. 限制酶主要從原核生物中分離純化而來，不能剪切自身的DNA
【答案】BD
【解析】
【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制酶；②基因的 “針線”---DNA連接酶；③基因的運載體---質粒、噬菌體、動植物病毒等。
【詳解】A、DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，A錯誤；
B、限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能切割，B正確；
C、E·cli DNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端，C錯誤；
D、限制酶主要從原核生物中分離純化而來，但是因為原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D正確。
故選BD。
16. 人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補作用。干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程。①?④表示相關的操作， EcR I 、BamHI為限制酶，它們的識別序列及切割位點如 下表所示。下列有關敘述錯誤的是（ ）
A. 過程①所需的兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列有利于后續(xù)操作
B. 構建基因表達載體時，目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進行復制
C. 過程③利用的是T-DNA的特性將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA中
D. 過程④需控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細胞發(fā)生再分化
【答案】BC
【解析】
【分析】Ti質粒是在根瘤土壤桿菌細胞中存在的一種核區(qū)DNA外的自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子。是一種存在于根癌土壤桿菌中可引起雙子葉植物根部致癌的質粒。細菌從雙子葉植物的受傷根部侵入根部細胞后，最后在其中裂解，釋放出Ti質粒，其上的T-DNA片段會與植物細胞的核基因組整合。
【詳解】A、結合圖示可知，PCR的產物用EcR I和BamHI來酶切，因此在基因的引物兩側加上酶切位點G↓AATTC和G↓GATCC，A正確；
B、啟動子負責與RNA聚合酶結合啟動表達，終止子負責終止表達，因此構建基因表達載體時，目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進行表達，B錯誤；
C、過程③是利用T-DNA的特性將目的基因導入到農桿菌中，農桿根瘤菌是原核生物，無染色體，C錯誤；
D、整個過程最終需要利用愈傷組織細胞生成干擾素，因此應控制培養(yǎng)基中植物激素的種類和比例，以防止愈傷組織細胞發(fā)生再分化，D正確。
故選BC。
17. RT-PCR是將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。下圖是RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析，下列敘述正確的是（ ）

A. 該技術可用來檢測新冠病毒等RNA病毒
B. 該技術可用來檢測組織細胞中基因否轉錄
C. ①過程需要的酶是逆轉錄酶，③過程需要的酶是耐高溫的DNA聚合酶
D. ③過程中DNA解鏈后，應升高反應體系溫度使引物與模板結合
【答案】ABC
【解析】
【分析】PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。PCR每次循環(huán)一般分為：變性（溫度超過90°C）、復性（溫度降至50°C左右）、延伸（溫度上升到72°C左右）。
【詳解】A、由圖可知，RNA的逆轉錄（RT）和cDNA聚合酶鏈式擴增原理都是堿基互補配對原則，故該技術可用來檢測新冠病毒等RNA病毒，A正確；
B、基因轉錄的產物是RNA，使用RT-PCR技術可用于檢測細胞中的基因是否轉錄，B正確；
C、①和②為逆轉錄過程，需要逆轉錄酶參與；③過程為DNA的復制，需要耐高溫的DNA聚合酶，C正確；
D、③過程中DNA解鏈后，進行復性，溫度降至50°C左右，兩種引物與單鏈相應互補序列結合，D錯誤。
故選ABC。
18. 科研人員將釀酒酵母質粒上的丙酮酸脫氫酶基因（PD）替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因（LPG），可獲得乳酸乙酯（白酒香味的主要來源）高產菌株，過程如圖。下列分析合理的是（ ）

A. 轉入的LPG基因表達產物不能影響釀酒酵母的活性
B. LPG基因替換質粒上的PD基因需要兩端攜帶相同基因片段
C. 標記基因Ampr可檢測是否成功構建乳酸乙酯高產菌株
D. 可以利用PCR技術篩選含有LPG基因的受體細胞
【答案】ABD
【解析】
【分析】分析題圖：圖示是采用基因工程技術將釀酒酵母質粒上的丙酮酸脫氫酶基因(PD)替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因(L-PG)，從而獲得乳酸乙酯高產菌株。
【詳解】A、目的基因表達產物不能影響受體細胞的生存和活性，因此轉入的L-PG基因表達產物不能影響釀酒酵母活性，A正確；
B、LPG基因替換質粒上的PD基因需要兩端攜帶相同基因片段，即相同的黏性末端，B正確；
C、標記基因Ampr可篩選含有目的基因的受體細胞，但不能檢測是否成功構建乳酸乙酯高產菌株，C錯誤；
D、PCR技術是一項體外擴增基因的技術，依據堿基互補配對原則，可以用于篩選含有L-PG基因的受體細胞，D正確。
故選ABD。
（第Ⅱ卷）
三、綜合題：共4題，每題15分，共60分。
19. 葉用萵苣（如生菜）是大眾喜愛蔬菜，夏季高溫極易引起先期抽苔造成減產，泛素連接酶（LsE3）是研究人員在萵苣高溫抽苔植株中篩選得到的。LsE3基因受溫度調控，影響萵苣抽苔，但是LsE3基因作用機制尚不清楚。研究人員用無縫克隆技術構建萵苣LsE3基因的表達載體用于研究其分子機理。無縫克隆技術是構建表達載體的一種技術如圖2。

（1）目的基因獲取，在_____條件下，提取先期抽苔萵苣細胞中_____，經_____獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術擴增LsE3基因。PCR擴增除了圖1標出的物質以外，還需加入_____（至少寫兩種）。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中需要兩種引物F（左側）、R（右側）選用_____（選項中為引物部分序列，方向為5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表達載體構建，近年來新一代無縫克隆技術發(fā)展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成為目前研究的熱點。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技術（如圖2）。 T4 DNA 聚合酶在反應體系中沒有添加dNTP情況下具有 3'→5'外切酶活性；在反應體系中添加dNTP情況下具有5'→3'聚合酶活性；在反應體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時，外切酶活性和聚合酶活性同時發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應，產生指定長度的單鏈黏性末端。請結合圖1和圖2回答下列問題：
①LIC技術構建表達載體，圖1中利用PCR擴增LsE3基因，反應液中加入T4 DNA聚合酶和_____處理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質粒獲得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____處理質粒。處理后將兩者混合、退火并導入細胞內完成重組克隆。
②LIC技術依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術，后經過多次改進，Qi等建立了RQ-SLIC技術，用EcRⅤ酶切割質粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當時間，將混合物加熱到72℃，目的是_____，緩慢降溫（退火）后移入細胞內轉化修復形成完整重組質粒，細胞內轉化修復過程中用到_____酶。
（3）導入受體細胞，取葉用萵苣幼芽經_____（過程）形成愈傷組織備用，用_____處理農桿菌后導入重組質粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入_____植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出成功導入質粒的植物細胞。
【答案】（1） ①. 高溫 ②. 總RNA（或“總mRNA”或“RNA”） ③. 逆轉錄 ④. Taq酶、緩沖液、dNTP、Mg2+ ⑤. AC
（2） ①. dGTP ②. 平 ③. dCTP ④. 終止T4 DNA聚合酶活性 ⑤. DNA聚合酶和DNA連接
（3） ①. 脫分化 ②. 氯化鈣（或Ca2+） ③. 潮霉素
【解析】
【分析】基因工程技術的基本步驟：
1、目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
2、基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
3、將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
4、目的基因的檢測與鑒定：
（1）分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。
（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【小問1詳解】
目的基因獲取，在高溫條件下，提取先期抽苔萵苣細胞中總RNA，經逆轉錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，利用PCR技術擴增LsE3基因。PCR擴增的條件有模板、引物、Taq酶、dNTP、能量等，除了圖1標出的物質以外，還需加入Taq酶、緩沖液、dNTP、Mg2+。LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中引物需要結合在模板鏈的3'，子鏈的延伸方向是沿引物的5'進行，結合圖1和堿基互補配對原則，引物F（左側）選用A、R（右側）選用C。
【小問2詳解】
①由題干信息可知，在反應體系中僅添加某種特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP時，外切酶活性和聚合酶活性同時發(fā)揮作用，從而競爭性終止反應，產生指定長度的單鏈黏性末端，所以圖1中利用PCR擴增LsE3基因，反應液中加入T4 DNA聚合酶和dGTP處理。用EcR Ⅴ酶（GAT↓ATC）切割圖1所示質粒獲得平末端，后加T4 DNA聚合酶和dCTP處理質粒。
②LIC技術依賴特定同源序列，2007年Li等建立了不依賴特定序列的克隆( SLIC) 技術，后經過多次改進，Qi等建立了RQ-SLIC技術，用EcR Ⅴ酶切割質粒后與LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶處理適當時間，將混合物加熱到72℃，目的是終止T4 DNA聚合酶活性，緩慢降溫（退火）后移入細胞內轉化修復形成完整重組質粒，細胞內轉化修復過程中用到DNA聚合酶和DNA連接酶。
【小問3詳解】
導入受體細胞，取葉用萵苣幼芽經脫分化形成愈傷組織備用，用氯化鈣（或Ca2+）處理農桿菌后導入重組質粒，再感染葉用萵苣愈傷組織，將感染后的愈傷組織置于加入潮霉素植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原因是重組質粒中含有潮霉素抗性基因，然后篩選出成功導入質粒的植物細胞。
20. CD3D嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突變引起的，該突變阻止了T細胞生長發(fā)育所需的CD3D蛋白的合成。科研人員對第3代CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進行改造，獲得一種超精確的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），該系統(tǒng)主要由向導sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶組成，作用機制如圖1。利用該系統(tǒng)在CD3D-SCID患者的造血干細胞中可以更正約71.2%的致病突變。

（1）研究發(fā)現(xiàn)，Cas9切口酶催化雙鏈DNA___鍵水解，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸轉變成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸堿基互補配對，據此推測，至少通過___次DNA復制可以完成修復。
（2）sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補配對的特殊序列，由23個連續(xù)堿基組成。sgRNA設計是否合理，對于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的切割有重要影響，否則會導致sgRNA脫靶，試分析其原因是___。
（3）為了對改造后的CD3D基因進行研究，把CD3D基因和His標簽基因（His標簽由6個組氨酸組成）連接起來構建融合基因，并構建重組基因表達載體，圖2為載體、CD3D基因的結構、不同限制酶的識別序列及切割位點，欲將標簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，已知組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG。

①PCR的一般過程為___，在變性之前通常有預變性，其目的是___。判斷是否擴增出DNA片段，判斷的依據是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及___來評價擴增的結果。如果電泳鑒定的結果不止一條條帶分析可能的原因有___（至少答兩點）。
②寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5′___3′。
③為構建融合基因并將其插入載體，科研人員設計了一對與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補配對的引物，設計時需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的識別序列和His基因的編碼序列，請寫出該引物開頭的12個堿基序列：5′___3′。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯 ②. 2##兩##二
（2）當其他DNA序列也含有與sgRNA互補配對的序列，造成sgRNA錯誤結合而脫靶
（3） ①. 變性→復性→延伸 ②. 增加模板DNA徹底變性的概率 ③. 寬度 ④. 引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好 ⑤. CATCATCATCATCATCATTAG ⑥. B ⑦. XhⅠ ⑧. CTCGAGCTAATG
【解析】
【分析】基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟?；虮磉_載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
【小問1詳解】
Cas9切口酶相當于內切酶，催化雙鏈DNA的磷酸二酯鍵水解，由圖1可知需要把A-T堿基對修復為G-C堿基對，腺嘌呤脫氨酶把A變成次黃嘌呤核苷酸，第一次復制黃嘌呤核苷酸與C配對，第二次復制C-G配對，完成修復，所以至少通過2次DNA復制可以完成修復。
【小問2詳解】
sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補配對的特殊序列，由23個連續(xù)堿基組成，當其他DNA序列也含有與sgRNA互補配對的序列，造成sgRNA錯誤結合而脫靶；為了解決這個問題可以適當增加sgRNA的長度，提高其與目標基因識別的特異性程度。
【小問3詳解】
①PCR的一般過程為：變性→復性→延伸，PCR循環(huán)之前，常要進行一次預變性，預變性的目的是增加模板DNA徹底變性的概率?？赏ㄟ^是在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及寬度來評價擴增是否成功。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。
②基因編碼鏈的堿基序列，相當于把mRNA的序列中U改為T，His標簽由6個組氨酸組成，組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG，所以His的基因編碼鏈的堿基序列為5'CATCATCATCATCATCATTAG3'。
③欲將標簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，也就是在圖中的右側，所以要加相應的限制酶識別序列和His基因的編碼序列需要在右側，即用引物B；結合圖示可知，限制酶應選用XhⅠ，所以增加的是His的基因編碼鏈的互補鏈堿基序列和XhⅠ的識別序列：5'CTCGAGCTAATG3'。
21. 畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時需要大量表達醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的長度為2200bp?？蒲腥藛T將蜂毒肽（MEL）與石斑魚c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA質粒上構建重組表達質粒，導入畢赤酵母以獲得高效低毒的廣譜抑菌融合蛋白，實驗的主要流程如下，請回答：
注：重組質粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜帶石斑魚c型溶菌酶屬于免疫系統(tǒng)的_______。相對于原核表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)翻譯出的蛋白可以經過_______加工修飾，表達的蛋白具有天然生物學活性。
（2）為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同時兩端帶有pPICZαA的同源序列，過程①PCR反應體系中加入的模板是_______，引物應該選擇以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）過程②將PCR產物片段與線性化的pPICZαA混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質粒，這一過程與傳統(tǒng)構建重組質粒相比不需要_______酶。
（4）為了驗證構建是否成功，利用限制性內切酶EcRI和SalI對提取出的重組質粒2進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示分別得到大小約為_______（限制酶識別序列不計）的片段。過程③將重組質粒2導入大腸桿菌的目的是_______。
（5）過程⑤培養(yǎng)畢赤酵母時加入_______作為唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因與宿主基因組染色體的交換方式包括單交換和雙交換。含有目的基因的載體插入宿主染色體的AOX1基因的上游或下游，不影響AOX1基因的正常表達，屬于單交換；當發(fā)生基因取代時，含目的基因的載體與宿主染色體中AOX1基因區(qū)域發(fā)生交換，宿主AOX1基因編碼區(qū)域被全部取代，屬于雙交換。以AOX1基因兩端序列為依據設計引物，對三株重組酵母（編號1、2、3）進行菌液PCR、電泳后得到下圖，根據結果推斷目的基因與宿主基因組染色體發(fā)生單交換的酵母菌株有_______。
【答案】（1） ①. （免疫）活性物質 ②. 內質網、高爾基體
（2） ①. 重組質粒1 ②. AB
（3）限制酶和DNA連接酶
（4） ①. 611bp、3493bp ②. 使得重組質粒2在大腸桿菌中穩(wěn)定保存、準確復制、方便提取
（5） ①. 甲醇 ②. 誘導目的基因大量表達
（6）1、2、3
【解析】
【分析】1、PCR技術的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；
2、PCR的操作過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。
【小問1詳解】
免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞和免疫活性物質構成，溶菌酶屬于免疫系統(tǒng)的免疫活性物質。原核細胞沒有細胞核和眾多細胞器，只有核糖體，真核細胞具有內質網、高爾基體等細胞器，因此相對于原核表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)翻譯出的蛋白可以經過內質網、高爾基體。
【小問2詳解】
重組質粒Ⅰ上既含有MEL基因又含有Ec-cLYZ，且兩基因相連，因此重組質粒Ⅰ可作為過程①PCR反應體系中的模板，為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，且兩端帶有pPICZαA的同源序列，因此所設計的引物，一側應包含pPICZαA和Ec-cLY的堿基序列，且連接處應含有限制酶EcRⅠ識別序列，又因為子鏈延伸的方向是5'→3'，因此，該側引物序列應為5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’，即A選項；另一側引物應包含MEL和pPICZαA，且連接處應含有限制酶SalⅠ識別序列，子鏈延伸的方向是5'→3'，因此，該側引物序列應為5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’，即B選項。
綜上所述AB正確，CD錯誤。
故選AB。
【小問3詳解】
過程②將PCR產物片段與線性化的pPICZαA混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質粒，在該過程中未用到限制酶和DNA連接酶。
【小問4詳解】
由圖可知，Ec-cLYZ基因片段長度為533bp，MEL基因片段長度為78bp，在重組質粒Ⅱ中兩基因為融合基因，之間為限制酶識別序列，但在兩端分別含有限制性內切酶EcRI和SalI識別序列，若用限制性內切酶EcRI和SalI對提取出的重組質粒2進行雙酶切，得到的融合基因片段長度為533+78=611bp，另一片段為pPICZαA片段，長度為3493bp，因此利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示分別得到大小約為611bp、3493bp兩種片段。過程③將重組質粒2導入大腸桿菌可使得使得重組質粒2在大腸桿菌中穩(wěn)定保存、準確復制、方便提取。
【小問5詳解】
畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時需要大量表達醇氧化酶，MEL和Ec-cLYZ融合基因存在于AOX1基因啟動子和終止子之間，因此過程⑤培養(yǎng)畢赤酵母時加入甲醇作為唯一碳源，目的是誘導目的基因（MEL和Ec-cLYZ融合基因）大量表達。
【小問6詳解】
由題可知，AOX1基因的長度為2200bp，發(fā)生單交換的含有目的基因的載體插入宿主染色體的AOX1基因的上游或下游，不影響AOX1基因的正常表達，因此以AOX1基因兩端序列為依據設計引物，若發(fā)生單交換，則擴增出來的片段大于AOX1基因本身的長度2200bp，若為雙交換則AOX1基因編碼區(qū)全部被替換，擴增出來的片段小于AOX1基因本身的長度2200bp，由圖可知，三株重組酵母在大于2000bp的位置均有電泳條帶，可知菌株1、2、3中目的基因與宿主基因組染色體發(fā)生單交換。
22. 結核病是由結核桿菌引起的人畜共患病。結核桿菌通常以氣溶膠形式傳播，氣溶膠顆粒被肺泡吞噬細胞吞噬，吞噬細胞破裂導致結核桿菌在機體內進一步傳播。羊癢病是由正常細胞的非致病性朊蛋白異構化為癢病朊蛋白所致。為研制既能抗結核病又能抗羊癢病的雙抗羊，科學家進行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前發(fā)現(xiàn)的具有抗結核桿菌感染功能的基因。研究人員為了驗證SP110基因的功能，同時也為了驗證山羊吞噬細胞特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細胞內的表達，將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成融合基因，設計了下表所示的三組實驗。
取三組實驗等量的細胞裂解液，用_____法培養(yǎng)，結果如下圖1所示。由圖可知小鼠SP110基因可用于雙抗羊的研制，依據的實驗現(xiàn)象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，PRNP基因的結構如圖2．研究人員用新型基因敲除技術對體外培養(yǎng)的山羊成纖維細胞PRNP基因的外顯子3序列實施定點敲除。請根據上述信息，設計一個檢測敲除是否成功的思路：提取山羊成纖維細胞的DNA，根據_____設計引物進行PCR，并用_____作用于PCR產物后進行凝膠電泳，若僅獲得一條電泳條帶，說明定點敲除成功。
（3）用TALEN敲除載體與供體DNA表達載體（圖4）共同轉化體外培養(yǎng)的幼羊成纖維細胞，可將融合基因定點敲入PRNP基因的外顯子3部位，原理如圖3．請指出圖4中數(shù)字1和2的分別代表的結構：1．_____、2．_____。經用_____法檢測，山羊成纖維細胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表達情況是_____（填“兩者均增加”或“兩者均減少或不表達”或“前者減少、后者增加”或“前者增加、后者減少”）。
（4）欲用上述細胞獲得雙抗羊，需要用到的技術有_____（至少寫出兩項）。
【答案】（1） ①. 接種等量的結核桿菌 ②. 含有融合基因與質粒構建的重組質粒的山羊肺泡吞噬細胞 ③. 等量蒸餾水 ④. 稀釋涂布平板 ⑤. 組3的吞噬細胞裂解后釋放的結核桿菌數(shù)量與組2接近，顯著小于組1
（2） ①. 外顯子3的（部分）序列 ②. BamHⅠ
（3） ①. L4序列 ②. MRS啟動子 ③. 抗原抗體雜交技術 ④. 均降低（或不表達）
（4）體細胞核移植、動物細胞培養(yǎng)（早期胚胎培養(yǎng)）、胚胎移植
【解析】
【分析】基因工程中的操作工具及其作用：
①“分子手術刀”——限制性核酸內切酶（限制酶），能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。
②“分子縫合針”——DNA連接酶，E·cliDNA連接酶，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合黏性末端和平末端。
③“分子運輸車”——載體。將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法，農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可整合到受體細胞的染色體DNA上。基因表達載體常包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因。標記基因是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。
【小問1詳解】
實驗目的是驗證SP110基因的功能，同時驗證山羊吞噬細胞特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細胞內的表達，自變量是是否有SP110基因、是否有特異性啟動子MSR，實驗組是將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成融合基因，構建成重組質粒后導入肺泡吞噬細胞，現(xiàn)在已經設置轉入空質粒的山羊吞噬細胞為對照組（組1），還需要設置已經轉入廣泛表達小鼠SP110基因的重組質粒的山羊吞噬細胞（組3）作為對照組。構建重組質粒時，需要用限制酶切割目的基因和質粒，用DNA連接酶將目的基因和質粒連接在一起。分別接種等量的結核桿菌，經72h后需要使吞噬細胞破裂，應加入蒸餾水使其吸水膨漲破裂。取三組實驗等量的細胞裂解液，用稀釋涂布平板法培養(yǎng)，根據圖1，實驗組（組2）的吞噬細胞裂解后釋放的結核桿菌數(shù)量和組3接近，顯著小于1組，說明特異性啟動子MSR可以啟動SP110基因在吞噬細胞內的表達。
【小問2詳解】
由圖可知，外顯子3序列內部存在限制酶BamHⅠ識別序列，若利用基因敲除技術對體外培養(yǎng)的山羊成纖維細胞PRNP基因的外顯子3序列實施定點敲除，則外顯子3內部限制酶BamHⅠ識別序列被破壞，因此檢測敲除是否成功可提取山羊成纖維細胞的DNA，根據外顯子3的（部分）序列設計引物進行PCR，并用BamHⅠ作用于PCR產物后進行凝膠電泳，若僅獲得一條電泳條帶，說明定點敲除成功。
【小問3詳解】
非致病性朊蛋白是由山羊13號染色體上的PRNP基因的第三外顯子控制合成的，為了降低非致病性朊蛋白的量，同時又能抗結核病，可設計用將MRS啟動子與小鼠SP110基因形成的融合基因替換PRNP基因的第三外顯子，據圖2和圖3，對山羊成纖維細胞L4與R1之間的序列實施定點敲除，將TALEN敲除載體與供體DNA載體（MRS啟動子與小鼠SP110基因形成的融合基因）共轉化幼羊成纖維細胞，將SP110基因定點敲入PRNP基因的第三外顯子中。則圖4中供體DNA表達載體中：1是L4序列（和第三外顯子前的L4序列同源），2是MRS啟動子，3是終止子（使SP110基因轉錄停止），4是R1序列（和第三外顯子后的R1序列同源）。若想對山羊成纖維細胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表達情況進行檢測，則需要進行抗原抗體雜交技術。由于PRNP基因的第三外顯子被敲除，非致病性朊蛋白基因不表達，由于成纖維細胞中特異性啟動子MSR不能發(fā)揮作用，SP110基因也不表達。
【小問4詳解】
若將TALEN敲除載體與供體DNA載體共轉化幼羊成纖維細胞獲得雙抗羊，首先將該細胞細胞核移植到去核卵母細胞中，誘導卵母細胞分裂、分化，進行早期胚胎細胞培養(yǎng)，到適宜階段進行胚胎移植，移入適宜的代孕母體。
限制酶
識別序列及切割位點
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
組別
主要操作
培養(yǎng)細胞后，使之破裂
對照組1
空質粒導入山羊肺泡吞噬細胞，接種適量結核桿菌
細胞培養(yǎng)72小時后，加入③_____，使吞噬細胞破裂，釋放結核桿菌
對照組2
含有能廣泛表達SP110基因的山羊肺泡吞噬細胞，①_____
實驗組
②_____，接種等量的結核桿菌

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