一、選擇題
1. [2023廣東，2分]“DNA 粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是:裂解→ 分離→ 沉淀→ 鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是( D )
A. 裂解:使細(xì)胞破裂釋放出DNA 等物質(zhì)
B. 分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等
C. 沉淀:可反復(fù)多次以提高DNA 的純度
D. 鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色
[解析]DNA 粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的基本過程是：裂解、分離、沉淀、鑒定。裂解的目的是使細(xì)胞破裂，釋放出DNA 等物質(zhì)，A 正確。DNA 不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA 與蛋白質(zhì)等，DNA 分離過程中混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等可被去除，B 正確。DNA 在不同濃度的NaCl 溶液中溶解度不同，通過控制NaCl 溶液的濃度去除雜質(zhì)，可反復(fù)多次以提高DNA 的純度，C 正確。進(jìn)行DNA 鑒定時(shí)可以使用二苯胺試劑，但要進(jìn)行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D 錯(cuò)誤。
2. [2023浙江1月選考，2分]以哺乳動(dòng)物為研究對象的生物技術(shù)已獲得了長足的進(jìn)步。對生物技術(shù)應(yīng)用于人類，在安全與倫理方面有不同的觀點(diǎn)，下列敘述正確的是( D )
A. 試管嬰兒技術(shù)應(yīng)全面禁止
B. 治療性克隆不需要監(jiān)控和審查
C. 生殖性克隆不存在倫理道德方面的風(fēng)險(xiǎn)
D. 我國不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實(shí)驗(yàn)
[解析]試管嬰兒屬于有性生殖，合理范圍內(nèi)，試管嬰兒技術(shù)是可以使用的，A 錯(cuò)誤；對治療性克隆要進(jìn)行有效監(jiān)控和嚴(yán)格審查，B 錯(cuò)誤；生殖性克隆會(huì)引起嚴(yán)重的道德、倫理、社會(huì)和法律問題，C 錯(cuò)誤。
3. [2021湖北，2分]某實(shí)驗(yàn)利用PCR 技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是( D )
A. 增加模板DNA 的量B. 延長熱變性的時(shí)間
C. 延長延伸的時(shí)間D. 提高復(fù)性的溫度
[解析]PCR 過程中，引物和模板不完全配對會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA 的量不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A 項(xiàng)錯(cuò)誤；延長熱變性的時(shí)間，有利于雙鏈DNA 解聚為單鏈，不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，B 項(xiàng)錯(cuò)誤；延長延伸的時(shí)間，有利于合成新的DNA 鏈，但不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，C 項(xiàng)錯(cuò)誤；在一定溫度范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，D 項(xiàng)正確。
二、非選擇題
4. [2023全國甲理綜節(jié)選，11分]接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙肝病毒是一種DNA 病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）?；卮鹣铝袉栴}。
（1） 接種上述重組乙肝疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒，原因是重組乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遺傳物質(zhì)，接種該疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒（3分）。
[解析]重組乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遺傳物質(zhì)，故接種該疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒。
（2） 制備重組乙肝疫苗時(shí)，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是鑒別受體細(xì)胞（酵母菌）中是否含有目的基因（乙肝病毒表面抗原基因），從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。能識別載體中的啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄的酶是RNA 聚合酶。
[解析]抗生素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA 片段，位于基因的上游，它是RNA 聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA ，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。
（3） 若要通過實(shí)驗(yàn)檢測目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請簡要寫出實(shí)驗(yàn)思路。
[答案]從轉(zhuǎn)基因酵母菌中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，觀察是否有雜交帶出現(xiàn)。（4分）
[解析]若要通過實(shí)驗(yàn)檢測目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，應(yīng)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已表達(dá)出目的蛋白。
5. [2022湖南節(jié)選，13分]水蛭是我國的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}:
（1） 蛋白質(zhì)工程流程如圖所示，物質(zhì)a 是多肽鏈，物質(zhì)b 是mRNA 。在生產(chǎn)過程中，物質(zhì)b 可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是密碼子的簡并（一種氨基酸對應(yīng)多個(gè)密碼子）（2分）。
[解析]蛋白質(zhì)工程的流程一般為:預(yù)期蛋白質(zhì)功能→ 設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→ 推測應(yīng)有的氨基酸序列→ 找到對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）。密碼子的簡并指的是同一種氨基酸可以由幾種不同的密碼子決定。
（2） PCR 技術(shù)遵循的基本原理是DNA 雙鏈復(fù)制（2分）。
[解析]PCR 技術(shù)遵循的基本原理是DNA 雙鏈復(fù)制。
（3） 將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性，結(jié)果如圖所示。推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的種類（填“種類”或“含量”）有關(guān)，其活性不同的原因是不同肽鏈的氨基酸數(shù)目、排列順序不同導(dǎo)致功能出現(xiàn)差異（2分）。
[解析]由題圖可知，將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，水解產(chǎn)物中的肽含量差別不大，但抗凝血活性差別較大，推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關(guān)。不同肽的功能不同主要與氨基酸的數(shù)目、排列順序不同有關(guān)。
（4） 若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：取四支試管，分別加入等量的生理鹽水、蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素，再向四支試管中各加入等量的新鮮血液，觀察四支試管中血液的凝血情況（4分）。
6. [2021全國甲理綜，15分]PCR 技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌,醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作:①分析PCR 擴(kuò)增結(jié)果;②從病人組織樣本中提取DNA ;③利用PCR 擴(kuò)增DNA 片段;④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}:
（1） 若要得到正確的檢測結(jié)果,正確的操作順序應(yīng)該是④②③① （3分）（用數(shù)字序號表示）。
[解析]用PCR 技術(shù)進(jìn)行臨床的病原菌檢測時(shí)，首先應(yīng)采集病人組織樣本，從病人組織樣本中提取DNA ，再利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增DNA 片段，分析PCR 擴(kuò)增結(jié)果。
（2） 操作③中使用的酶是熱穩(wěn)定DNA 聚合酶（Taq 酶）。PCR 反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步,其中復(fù)性的結(jié)果是兩種引物分別與兩條單鏈DNA 模板結(jié)合（3分）。
[解析]利用PCR 擴(kuò)增DNA 片段過程中使用的酶是熱穩(wěn)定DNA 聚合酶（Taq 酶）。PCR 由變性—復(fù)性—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，其中復(fù)性的結(jié)果是兩種引物分別與兩條單鏈DNA 模板結(jié)合。
（3） 為了做出正確的診斷，PCR 反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與病原菌DNA 特異性結(jié)合。
[解析]要擴(kuò)增病原菌DNA ，設(shè)計(jì)的引物應(yīng)該能和病原菌DNA 特異性結(jié)合。
（4） PCR （多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是指根據(jù)DNA 半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA 復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)（3分）。
該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
[解析]多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 是一項(xiàng)根據(jù)DNA 半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA 復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
7. [2021海南，11分]CRISPR/Cas9 是一種高效的基因編輯技術(shù)，Cas 9基因表達(dá)的Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向?qū)NAsgRNA 引導(dǎo)下，切割DNA 雙鏈以敲除目標(biāo)基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示?；卮鹣铝袉栴}。
（1） 過程①中，為構(gòu)建CRISPR/Cas9 重組質(zhì)粒，需對含有特定sgRNA 編碼序列的DNA 進(jìn)行酶切處理，然后將其插入到經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上，插入時(shí)所需要的酶是DNA 連接酶（1分）。
[解析]基因工程中所需的工具酶有限制酶和DNA 連接酶，限制酶負(fù)責(zé)“切割”，DNA 連接酶負(fù)責(zé)“連接”。
（2） 過程②中，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法（1分）。
[解析]將目的基因?qū)氪竽c桿菌細(xì)胞常用的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（3） 過程③~⑤中，sgRNA 與Cas9 蛋白形成復(fù)合體，該復(fù)合體中的sgRNA 可識別并與目標(biāo)DNA 序列特異性結(jié)合，二者結(jié)合所遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對原則（1分）。隨后，Cas9 蛋白可切割目標(biāo)DNA 上特定的核苷酸（2分）序列。
[解析]sgRNA 與Cas9 蛋白形成的復(fù)合體中的sgRNA 可通過堿基互補(bǔ)配對原則與目標(biāo)DNA 序列特異性結(jié)合。由題圖可知，Cas9 蛋白在功能上屬于限制酶，可切割目標(biāo)DNA 上特定的核苷酸序列。
（4） 利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除一個(gè)長度為1200bp 的基因，在DNA 水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是DNA 分子雜交技術(shù)（1分），基因敲除成功的判斷依據(jù)是不出現(xiàn)雜交帶（2分）。
[解析]在DNA 水平上,可利用DNA 分子雜交技術(shù)判斷基因敲除是否成功，若不出現(xiàn)雜交帶，則說明基因敲除成功。
（5） 某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白?？蒲腥藛T將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9 質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒，隨后將其導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA 中，構(gòu)建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡述CRISPR/Cas9 重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)，將該蛋白酶基因插入到基因組DNA 的編輯過程：CRISPR/Cas9 重組質(zhì)粒中的sgRNA 編碼序列、Cas 9基因分別在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，sgRNA 編碼序列轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是sgRNA ，Cas 9基因表達(dá)的產(chǎn)物是Cas9 蛋白，二者形成復(fù)合體，該復(fù)合體中的sgRNA 可引導(dǎo)識別目標(biāo)DNA 序列，并與之結(jié)合，Cas9 蛋白在特定位點(diǎn)對基因組DNA 進(jìn)行切割，以便蛋白酶基因插入到基因組DNA 中（3分）。
【高分必備】
與DNA 相關(guān)的幾種酶
題組二
一、選擇題
1. [2023新課標(biāo)理綜，6分]某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA 連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是( C )
A. 質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.cliDNA 連接酶連接
B. 質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA 連接酶連接
C. 質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA 連接酶連接
D. 質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cliDNA 連接酶連接
[解析]只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化或者使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，而且酶3切割產(chǎn)生平末端，E.cliDNA 連接酶不能連接具有平末端的DNA 片段，A 錯(cuò)誤；用酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，無法連接，B 錯(cuò)誤；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA 連接酶連接，使目的基因定向插到質(zhì)粒中，C 正確；酶2和酶4切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，易導(dǎo)致目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化或者使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，并且用酶4切割會(huì)破壞標(biāo)記基因，D 錯(cuò)誤。
【高分必備】在基因工程操作中，DNA 連接酶主要有兩類:一類是從大腸桿菌中分離得到的，稱為E.cliDNA 連接酶；另一類是從T4 噬菌體中分離出來的，稱為T4DNA 連接酶。這兩類酶都能將雙鏈DNA 片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵，但這兩種酶的作用有所差別。E.cliDNA 連接酶只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA 片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA 片段。而T4DNA 連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA 片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA 片段的平末端，但連接平末端的效率相對較低。
2. [2022遼寧，2分]抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12?5 是我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR 方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是( B )
A. 預(yù)變性過程可促進(jìn)模板DNA 邊解旋邊復(fù)制
B. 后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分
C. 延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制
D. 轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因后即可上市
[解析]預(yù)變性的溫度為94℃ ，在這個(gè)溫度下，雙鏈DNA 解旋為單鏈，但模板鏈不易和引物結(jié)合，不能進(jìn)行復(fù)制，A 錯(cuò)誤。延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長了延伸時(shí)間，使目的基因的擴(kuò)增更加充分，B 正確。延伸過程需要引物與模板鏈結(jié)合,在引物的3′ 端加上相應(yīng)的核苷酸，C 錯(cuò)誤。轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因且已經(jīng)表達(dá)使生物體表現(xiàn)出相應(yīng)性狀后，還需要經(jīng)過系列的安全性評價(jià)，符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后才能上市，D 錯(cuò)誤。
二、非選擇題
3. [2023全國乙理綜節(jié)選，10分]GFP 是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白。科研人員以GFP 基因?yàn)椴牧?，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類。回答下列問題。
（1）構(gòu)建突變基因文庫?？蒲腥藛T將GFP 基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP 基因的突變基因文庫。
（2） 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。科研人員從構(gòu)建的GFP 突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示（箭頭為GFP 突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為終止子（1分）;②為啟動(dòng)子（1分），其作用是被RNA 聚合酶識別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)GFP 突變基因的轉(zhuǎn)錄（2分）。
[解析]一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA 片段，位于基因的上游，它是RNA 聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA ，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA 片段。
（3） 目的基因的表達(dá)。科研人員將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點(diǎn)的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子具有簡并性，GFP 基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前相同（2分）（答出1點(diǎn)即可）。
[解析]結(jié)合題中信息可知，將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有的大腸桿菌發(fā)綠色熒光，即GFP 蛋白的熒光顏色，推測發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子具有簡并性，GFP 基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前的相同。
（4） 新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP 突變基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP 基因的不同，將該GFP 突變基因命名為YFP 基因（黃色熒光蛋白基因）。若要通過基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)思路是選擇合適的運(yùn)載體，利用合適的限制酶和DNA 連接酶將YFP 基因和運(yùn)載體連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，之后將基因表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌，檢測其是否會(huì)發(fā)黃色熒光（4分）。
[解析]基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的獲?。虎诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測與鑒定。欲通過基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，可通過基因工程的方法將目的基因?qū)虢湍妇?，之后檢測酵母菌是否發(fā)黃色熒光，如果發(fā)黃色熒光，則可證明YFP 基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)，否則，不能證明YFP 基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)。
4. [2022山東，12分]某種類型的白血病由蛋白P 引發(fā)，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG?P 和FLAG?P△ 。P△ 是缺失特定氨基酸序列的P ，F(xiàn)LAG 是一種短肽，連接在P 或P△ 的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG 抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P 或P△ 的功能。
（1） 為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR 特異性擴(kuò)增P 基因。用于擴(kuò)增P 基因的引物需滿足的條件是能與P 基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對、短單鏈核酸（2分）。為使PCR 產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的5′ 端（2分）（填“3′ 端”或“5′ 端”）。
[解析]引物是一小段能與DNA 母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸，且DNA 復(fù)制時(shí)，子鏈的延伸方向?yàn)?′3′ ,因此用于擴(kuò)增P 基因的引物需要滿足的條件是：兩種引物分別與兩條模板鏈3′ 端的堿基序列互補(bǔ)配對。由于DNA 聚合酶只能從引物的3′ 端延伸DNA 鏈，為使PCR 產(chǎn)物能被限制酶切割，需要在引物的5′ 端添加限制酶識別序列。
（2） PCR 擴(kuò)增得到的P 基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG 的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA ”為P 基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA 序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正確，但P 基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P 不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是P 基因編碼鏈的第一個(gè)堿基A 與EcR Ⅰ識別序列的最后兩個(gè)堿基TC 編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA 的密碼子被錯(cuò)位讀取（2分）。修改擴(kuò)增P 基因時(shí)使用的帶有EcR Ⅰ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是在引物中的 EcR Ⅰ識別序列3′ 端添加1個(gè)堿基（2分）。
圖甲
[解析]分析圖甲可知，P 基因編碼鏈的第一個(gè)堿基A 與EcR Ⅰ識別序列的最后兩個(gè)堿基TC 編碼一個(gè)氨基酸Ser ，導(dǎo)致P 基因?qū)?yīng)mRNA 的密碼子被錯(cuò)位讀取，因此P 基因?qū)?yīng)的氨基酸序列發(fā)生了改變。若通過修改擴(kuò)增P 基因時(shí)使用的帶有EcR Ⅰ識別序列的引物來解決該問題，則可以在引物中的 EcR Ⅰ識別序列的3′ 端添加1個(gè)（或3n+1 個(gè)）堿基，從而使P 基因編碼鏈編碼正確的氨基酸序列。
（3） 融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG?P 、FLAG?P△ 、藥物A和UBC 按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG 抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC 抗體檢測，檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG?P 和FLAG?P△ 不能降解UBC ，由①②③組結(jié)果的差異推測，藥物A的作用是增強(qiáng)FLAG?P 與UBC 的結(jié)合（1分）；由②④組或③⑤組的差異推測，P△ 中缺失的特定序列的作用是參與P 與UBC 的結(jié)合（1分）。
[解析]①組僅添加UBC ，樣品混勻后流經(jīng)含F(xiàn)LAG 抗體的介質(zhì)，不能分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)，不出現(xiàn)雜交帶；②組添加UBC 和FLAG?P ，樣品混勻后流經(jīng)含F(xiàn)LAG 抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC 抗體檢測，出現(xiàn)雜交帶（較窄）；③組添加UBC 、藥物A 和FLAG?P ，樣品混勻后流經(jīng)含F(xiàn)LAG 抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC 抗體檢測，雜交帶較寬，說明藥物A 的作用是促進(jìn)UBC 與FLAG?P 的結(jié)合。分析可知，②③組出現(xiàn)雜交帶；④⑤組沒有出現(xiàn)雜交帶，再結(jié)合②③④⑤組中添加的物質(zhì)推測，P△ 中缺失的特定序列的作用是參與P 與UBC 的結(jié)合。（4）根據(jù)（3）的分析可知，藥物A 可促進(jìn)UBC 與FLAG?P 的結(jié)合，據(jù)此推測，藥物A 治療該病的機(jī)理是通過增強(qiáng)UBC 與P 的結(jié)合促進(jìn)P 被蛋白酶識別并降解，從而治療該病。
（4） 根據(jù)以上結(jié)果推測，藥物A治療該病的機(jī)理是藥物A 通過增強(qiáng)P 與UBC 結(jié)合促進(jìn)P 降解（2分）。
5. [2022廣東，12分]“綠水逶迤去，青山相向開?！贝罅Πl(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)已成為全社會(huì)的共識。基于某些梭菌的特殊代謝能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣（含CO2 等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業(yè)）為原料，通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，構(gòu)建一種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)。
回答下列問題：
（1） 研究者針對每個(gè)需要擴(kuò)增的酶基因（如圖）設(shè)計(jì)一對引物，利用PCR 技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。
[解析]利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)酶基因的前提是根據(jù)目標(biāo)酶基因兩端的堿基序列設(shè)計(jì)一對引物。
（2） 研究者構(gòu)建了一種表達(dá)載體pMTL80k ，用于在梭菌中建立多基因組合表達(dá)庫，經(jīng)篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動(dòng)子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，終止子的作用是終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。
[解析]基因表達(dá)載體中，抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，可使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。
（3） 培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)重組梭菌大量表達(dá)上述酶蛋白時(shí)，出現(xiàn)了生長遲緩的現(xiàn)象，推測其原因可能是CO2 等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長，此外丙酮的積累會(huì)傷害細(xì)胞，需要進(jìn)一步優(yōu)化菌株和工藝才能擴(kuò)大應(yīng)用規(guī)模。
[解析]重組梭菌可大量表達(dá)題述酶蛋白，在這些酶蛋白的作用下，CO2 等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長，所以會(huì)導(dǎo)致其生長遲緩。
（4） 這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了廢物的資源化，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)的優(yōu)勢在于不僅不排放CO2 ，而且還可以消耗工業(yè)廢氣中的CO2 ，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會(huì)效益。
[解析]根據(jù)題意可知，這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù),以高污染排放企業(yè)排出的CO2 等一碳溫室氣體為原料，生產(chǎn)丙酮，實(shí)現(xiàn)了廢物的資源化，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看,利用該技術(shù)生產(chǎn)丙酮的過程中不僅不排放CO2 ，還可以消耗工業(yè)廢氣中的CO2 ，有利于減緩溫室效應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)較高的經(jīng)濟(jì)效益，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會(huì)效益。
【高分必備】DNA 復(fù)制需要引物的原因及其要求歸納
1.需要引物的原因 引物為一段已知脫氧核苷酸序列的DNA 單鏈或RNA ，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。DNA 復(fù)制時(shí)，DNA 聚合酶不能從5′ 端開始合成DNA ，而只能從3′ 端延伸DNA 鏈，因此，DNA 復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA 母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA 聚合酶就能從引物的3′ 端開始延伸DNA 鏈，DNA 的合成方向總是從子鏈的5′ 端向3′ 端延伸。
2.引物必須符合的基本要求
（1）與目的基因一端堿基互補(bǔ)；
（2）3′ 端不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?′ 端開始的；
（3）引物相互之間不能有多個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)；
（4）引物自身不能有多個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)。
題組三
一、選擇題
1. [2023湖北，2分]用氨芐青霉素抗性基因AmpR 、四環(huán)素抗性基因TetR 作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是( D )
A. 若用Hind Ⅲ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同
B. 若用Pνu Ⅰ酶切，在含Tet （四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因
C. 若用Sp? Ⅰ酶切,可通過DNA 凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否
D. 若用Sp? Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp （氨芐青霉素）和Tet 的培養(yǎng)基中能形成菌落
[解析]若用Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA 片段，用DNA 連接酶將兩者連接成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A 正確；若用Pvu Ⅰ酶切，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，在含Tet （四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落可能是含有目的基因的重組質(zhì)粒，也可能是質(zhì)粒自身連接的普通質(zhì)粒，因此，在含Tet （四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B 正確；若用Sp? Ⅰ酶切，由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的堿基對數(shù)不同，因此可通過DNA 凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C 正確；若用Sp? Ⅰ酶切，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌能在含Amp （氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中形成菌落，不能在含Tet （四環(huán)素）的培養(yǎng)基中形成菌落，D 錯(cuò)誤。
【高分必備】 圖解限制酶的選擇依據(jù)
（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類
①應(yīng)選擇位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲中可選擇Pst Ⅰ。
②不能選擇目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲中不能選擇Sma Ⅰ。
（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類
①通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，以確保出現(xiàn)相同的黏性末端，如圖乙中的Pst Ⅰ。
②在只有一種標(biāo)記基因時(shí)，選擇的限制酶不能破壞標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶Sma Ⅰ會(huì)破壞標(biāo)記基因。
2. [2023浙江6月選考，2分]某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因GFP 整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3?GFP 基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。
圖甲
圖乙
下列敘述正確的是( B )
A. Gata3 基因的啟動(dòng)子無法控制GFP 基因表達(dá)
B. 翻譯時(shí)先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C. 2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3?GFP 基因純合子
D. 若用引物1和引物3進(jìn)行PCR ,能更好地區(qū)分雜合子和純合子
[解析]由圖甲可知，Gata3 基因與GFP 基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，且由題干可知兩基因能正常表達(dá)出相關(guān)蛋白質(zhì)，A 錯(cuò)誤；由于啟動(dòng)子在左側(cè)，基因在右側(cè)，轉(zhuǎn)錄基因時(shí)，先轉(zhuǎn)錄Gata3 基因，再轉(zhuǎn)錄GFP 基因，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向均是沿mRNA 的5′→3′ ，因此翻譯時(shí)先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正確；由圖乙可知，大片段包含GFP 基因編碼區(qū)片段，小片段不包含GFP 基因編碼區(qū)片段，則2號小鼠是Gata3?GFP 基因純合子，4號小鼠是野生型，C 錯(cuò)誤；若用引物1和引物3進(jìn)行PCR ，雜合子和Gata3?GFP 基因純合子均能擴(kuò)增出條帶，僅有Gata3 基因時(shí)無法擴(kuò)增出條帶，不利于區(qū)分雜合子和純合子，D 錯(cuò)誤。
【考情速遞】
運(yùn)用新技術(shù)解決常規(guī)問題
該題靈活運(yùn)用電泳技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型，試題新穎，反映了生物技術(shù)進(jìn)步能夠幫助人們解決實(shí)際問題，同時(shí)能幫助考生轉(zhuǎn)變思維習(xí)慣，多角度認(rèn)識常規(guī)問題，并采用多種方法解決它。
二、非選擇題
3. [2023廣東，14分]種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥2n=10 進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型DA1 基因發(fā)生一個(gè)堿基G 到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
回答下列問題:
（1） 擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1 基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型（1分）植株的種子大小相近。
[解析]據(jù)題干信息可知，突變體是由野生型DA1 基因發(fā)生隱性突變形成的，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1 基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由隱性突變造成，由于轉(zhuǎn)入的基因?yàn)轱@性基因，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。
（2） 用PCR 反應(yīng)擴(kuò)增DA1 基因，用限制性核酸內(nèi)切酶對PCR 產(chǎn)物和Ti 質(zhì)粒（1分）進(jìn)行切割，用DNA 連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1 基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動(dòng)子和終止子（2分）。
[解析]構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需要用限制性核酸內(nèi)切酶對經(jīng)過PCR 擴(kuò)增的DA1 基因和作為運(yùn)載體的Ti 質(zhì)粒進(jìn)行切割。為確保插入的DA1 基因可以正常表達(dá)，DA1 基因（目的基因）的上下游需具備啟動(dòng)子和終止子。
（3） 轉(zhuǎn)化后，T?DNA （其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（如圖所示），用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。
① 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0 植株并自交，將T1 種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個(gè)體即表示其基因組中插入了DA1 基因和卡那霉素抗性基因（2分）。
[解析]卡那霉素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0 植株并自交，將T1 種子播種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個(gè)體即表示其基因組中插入了DA1 基因和卡那霉素抗性基因。
② T1 陽性植株自交所得的T2 種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約75（2分）%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。
[解析]T1 陽性植株都含DA1 基因，由于T?DNA 可在基因組單一位點(diǎn)插入，也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)，所以不確定是單一位點(diǎn)插入還是多位點(diǎn)插入。若是單一位點(diǎn)插入，相當(dāng)于一對等位基因的雜合子，其自交后代應(yīng)該出現(xiàn)3:1的性狀分離比，而題干要求選出單一位點(diǎn)插入的植株，因此應(yīng)該選擇陽性率約75% 的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。
③ 將②中選出的T2 陽性植株自交（2分）（填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T3 種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到 100 %的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。
為便于在后續(xù)研究中檢測該突變，研究者利用PCR 擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性核酸內(nèi)切酶X 切割產(chǎn)物，通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測，相關(guān)信息如圖所示，在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。
如圖所示（2分）
[解析]將②中選出的T2 陽性植株自交，所得的T3 種子按單株收種并播種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，若某培養(yǎng)基上全部為具有卡那霉素抗性的植株，即為需要選擇的植株，因此陽性率達(dá)到100% 的培養(yǎng)基中的幼苗為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。分析題圖可知，野生型相關(guān)基因中不含限制性核酸內(nèi)切酶X 的識別序列，不能被該酶切割，已知DA1 基因的長度為150bp ，因此，野生型相關(guān)基因被限制性核酸內(nèi)切酶X 切割并電泳后得到的條帶為150bp 。突變型相關(guān)基因中含有限制性核酸內(nèi)切酶X 的識別序列，用該酶切割后，突變基因被切割成100bp 、50bp 兩種DNA 片段，經(jīng)電泳后得到的條帶為100bp 和50bp 。突變型和野生型相關(guān)基因經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶X 切割并電泳后得到的結(jié)果見答案。
【考情速遞】
創(chuàng)新考遺傳，繪制電泳條帶
該題將孟德爾遺傳規(guī)律的應(yīng)用與基因工程創(chuàng)新結(jié)合起來進(jìn)行考查，考查了基因表達(dá)載體的構(gòu)建、遺傳規(guī)律的應(yīng)用及相關(guān)計(jì)算、核酸電泳等知識，其中第（3）小題的最后一問要求考生在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑，設(shè)問創(chuàng)新，考點(diǎn)創(chuàng)新。
4. [2022北京，11分]生態(tài)文明建設(shè)已成為我國的基本國策。水中雌激素類物質(zhì)（E物質(zhì)）污染會(huì)導(dǎo)致魚類雌性化等異常，并通過食物鏈影響人體健康和生態(tài)安全。原產(chǎn)南亞的斑馬魚，其肌細(xì)胞、生殖細(xì)胞等存在E 物質(zhì)受體，且幼體透明。科學(xué)家將綠色熒光蛋白GFP 等基因轉(zhuǎn)入斑馬魚，建立了一種經(jīng)濟(jì)且快速的水體E 物質(zhì)監(jiān)測方法。
（1） 將表達(dá)載體導(dǎo)入斑馬魚受精卵的最佳方式是顯微注射（1分）。
[解析]可通過顯微注射將表達(dá)載體導(dǎo)入斑馬魚受精卵。
（2） 為監(jiān)測E 物質(zhì)，研究者設(shè)計(jì)了如圖所示的兩種方案制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其中ERE 和酵母來源的UAS 是兩種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，分別被E 物質(zhì)—受體復(fù)合物和酵母來源的Gal4 蛋白特異性激活，啟動(dòng)下游基因表達(dá)。
與方案1相比，方案2的主要優(yōu)勢是監(jiān)測靈敏度更高（2分），因而被用于制備監(jiān)測魚MO 。
[解析]方案1中，E 物質(zhì)與受體結(jié)合形成E 物質(zhì)—受體復(fù)合物，該復(fù)合物可激活ERE ，進(jìn)而啟動(dòng)GFP 基因表達(dá)；而方案2中，E 物質(zhì)與受體結(jié)合形成E 物質(zhì)—受體復(fù)合物，該復(fù)合物激活ERE ，進(jìn)而啟動(dòng)Gal 4基因表達(dá)，產(chǎn)生Gal4 蛋白，Gal4 蛋白再激活UAS ，UAS 可啟動(dòng)GFP 基因表達(dá)。由于級聯(lián)反應(yīng)，與方案1相比，方案2的監(jiān)測靈敏度會(huì)更高。
（3） 現(xiàn)擬制備一種不育的監(jiān)測魚SM ，用于實(shí)際監(jiān)測。SM 需經(jīng)MO 和另一親本X 雜交獲得。欲獲得X ，需從以下選項(xiàng)中選擇啟動(dòng)子和基因，構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入野生型斑馬魚受精卵，經(jīng)培育后進(jìn)行篩選。請將選項(xiàng)的序號填入相應(yīng)的方框中。
Ⅰ.啟動(dòng)子：□②（2分）
①ERE②UAS ③使基因僅在生殖細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子（P 生） ④使基因僅在肌細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子（P ?。?br>Ⅱ.基因：□ D（2分）
A.GFP B.Gal 4 C.雌激素受體基因ER D.僅導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡的基因dg
[解析]現(xiàn)擬制備一種不育的監(jiān)測魚SM ，親本X 是可以產(chǎn)生配子的，同時(shí)保證親本X 和MO 的后代SM 既可以監(jiān)測到物質(zhì)E ，又是不育的。導(dǎo)入X 的基因，應(yīng)該是與不育相關(guān)的基因，則應(yīng)該為僅導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡的基因dg 。雌激素類物質(zhì)可以使啟動(dòng)子ERE 活化，則導(dǎo)入X 的啟動(dòng)子不能為①；X 是可以正常產(chǎn)生配子的，故啟動(dòng)子不能選擇③；選擇啟動(dòng)子④則無法使SM 不育，故啟動(dòng)子最好選擇②。獲得SM 的機(jī)理簡單表述如下：由于親本X 中不含有Gal4 基因編碼的Gal4 蛋白，則在親本X 的細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)子UAS 不發(fā)揮作用，僅導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡的基因dg 也不會(huì)表達(dá)，而在X 和MO 的后代SM 細(xì)胞中會(huì)同時(shí)出現(xiàn)Gal4 基因編碼的Gal4 蛋白和啟動(dòng)子UAS ，所以基因dg 可以在SM 細(xì)胞中表達(dá)，使SM 的生殖細(xì)胞凋亡，從而使SM 不育。
（4） SM 不育的原因是：成體SM 自身產(chǎn)生雌激素，與受體結(jié)合后激活ERE ，誘導(dǎo)Gal 4基因表達(dá)，Gal4 蛋白結(jié)合UAS 誘導(dǎo)dg 表達(dá)，生殖細(xì)胞凋亡（2分），造成不育。
[解析]結(jié)合第（3）小問的分析可知，成體SM 自身會(huì)產(chǎn)生雌激素（E物質(zhì)），與受體結(jié)合后激活ERE ,誘導(dǎo)Gal 4基因表達(dá)，Gal4 蛋白與UAS 結(jié)合,誘導(dǎo)僅導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡的基因dg 表達(dá)，生殖細(xì)胞凋亡，造成不育。
（5） 使擬用于實(shí)際監(jiān)測的SM 不育的目的是避免轉(zhuǎn)基因斑馬魚逃逸帶來生物安全問題（2分）。
[解析]在研究中選取不育的斑馬魚是因?yàn)檫@樣設(shè)計(jì)可以避免轉(zhuǎn)基因斑馬魚逃逸帶來生物安全問題。
題組四
1. [2023浙江6月選考，14分]賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術(shù)可提高食物中賴氨酸含量?；卮鹣铝袉栴}：
（1） 植物細(xì)胞合成的賴氨酸達(dá)到一定濃度時(shí)，能抑制合成過程中兩種關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于負(fù)反饋調(diào)節(jié)。根據(jù)這種調(diào)節(jié)方式，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的賴氨酸類似物（2分）,用于篩選經(jīng)人工誘變的植物懸浮細(xì)胞，可得到抗賴氨酸類似物的細(xì)胞突變體，通過培養(yǎng)獲得再生植株。
[解析]通過抑制或減弱一開始的變化，維持物質(zhì)含量穩(wěn)定，這種調(diào)節(jié)方式屬于負(fù)反饋調(diào)節(jié)。人為添加一定濃度的賴氨酸類似物，使不抗賴氨酸類似物的細(xì)胞死亡，而抗賴氨酸類似物的細(xì)胞突變體能夠存活。
（2） 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞工程結(jié)合和發(fā)展，2011年我國首次利用轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功培育了高產(chǎn)賴氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：
① 構(gòu)建乳腺專一表達(dá)載體。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因（目的基因）,可通過檢索生物信息數(shù)據(jù)庫/遺傳序列數(shù)據(jù)庫（2分）獲取其編碼序列，用化學(xué)合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動(dòng)子的相應(yīng)載體連接，構(gòu)建出乳腺專一表達(dá)載體。
[解析]可通過檢索生物信息數(shù)據(jù)庫（或遺傳序列數(shù)據(jù)庫）獲取目的基因的編碼序列。
② 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細(xì)胞（BEF）。將表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，與BEF 膜發(fā)生融合,表達(dá)載體最終進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生轉(zhuǎn)化。
[解析]脂質(zhì)體由磷脂等構(gòu)成，脂質(zhì)體可以與牛胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生融合，從而使表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞，最終進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生轉(zhuǎn)化。
③ 核移植。將轉(zhuǎn)基因的BEF 作為核供體細(xì)胞，從牛卵巢獲取卵母細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)及去核后作為受體細(xì)胞。將兩種細(xì)胞進(jìn)行電融合，電融合的作用除了促進(jìn)細(xì)胞融合，同時(shí)起到了激活重組細(xì)胞發(fā)育的作用。
[解析]卵母細(xì)胞去核后作為受體細(xì)胞。經(jīng)核移植的重組細(xì)胞需利用電刺激進(jìn)行胚激活。
④ 重組細(xì)胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。重組細(xì)胞體外培養(yǎng)至早期囊胚，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。
[解析]將重組細(xì)胞體外培養(yǎng)至早期囊胚后，可移植至代孕母牛子宮角。
⑤ 檢測。DNA 水平檢測：利用PCR 技術(shù)，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞為陽性對照，檢測到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。RNA 水平檢測：從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞，提取總RNA ,對總RNA 進(jìn)行DNA 酶處理，以去除DNA 污染，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA ,并以此為模板,利用特定引物擴(kuò)增目的基因片段。結(jié)果顯示目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，原因是什么？構(gòu)建的表達(dá)載體含乳腺特異性啟動(dòng)子，使目的基因僅在乳腺細(xì)胞中表達(dá)（2分）。
[解析]DNA 水平檢測的目的是檢測轉(zhuǎn)基因牛中是否含有目的基因。分析可知，可以轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陽性對照。進(jìn)行RNA 水平檢測時(shí)，需利用DNA 酶（DNA 水解酶）處理總RNA ，以去除DNA 污染。RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA 可作為PCR 擴(kuò)增的模板，通過PCR 技術(shù)可獲取大量的目的基因片段。目的基因只在轉(zhuǎn)基因牛乳腺細(xì)胞中表達(dá)的原因是在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，將目的基因與含有乳腺特異性啟動(dòng)子的相應(yīng)載體連接，構(gòu)建出了乳腺專一表達(dá)載體，該表達(dá)載體中的特異性啟動(dòng)子使目的基因僅在乳腺細(xì)胞中表達(dá)，而不會(huì)在其他細(xì)胞中表達(dá)。
【考情速遞】
把知識形成過程作為考試內(nèi)容
高考生物試題情境來源豐富，從設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果等多個(gè)維度考查考生的實(shí)驗(yàn)探究能力，引導(dǎo)考生注重科學(xué)思維素養(yǎng)的培養(yǎng)。該題在考查陽性對照和陰性對照的設(shè)置以及對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和討論等的同時(shí)，引導(dǎo)考生提高運(yùn)用生物技術(shù)解決實(shí)際問題的意識，探究過程就是知識形成過程，亦是考試內(nèi)容，符合深度學(xué)習(xí)的趨勢。
2. [2022天津，10分]研究者擬構(gòu)建高效篩選系統(tǒng)，將改進(jìn)的苯丙氨酸合成關(guān)鍵酶基因P1導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌，以提高苯丙氨酸產(chǎn)量。
（1） 如圖是該高效篩選系統(tǒng)載體的構(gòu)建過程。載體1中含有KanR （卡那霉素抗性基因）和SacB 兩個(gè)標(biāo)記基因，為去除篩選效率較低的SacB ,應(yīng)選擇引物1和4，并在引物的5′ 5′/3′ 端引入X? Ⅰ酶識別序列，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接后環(huán)化成載體2。
[解析]據(jù)題中信息知，選擇引物1和4擴(kuò)增出來的片段不含SacB 基因，故為去除篩選效率較低的SacB 基因，應(yīng)選擇引物1和4。PCR 時(shí)，引物與單鏈DNA 結(jié)合后，從引物的3′ 端開始延伸，故應(yīng)在引物的5′ 端引入X? Ⅰ酶識別序列。
（2） PCR 擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因RpsL （鏈霉素敏感基因）時(shí)，引物應(yīng)包含X? Ⅰ（2分）（EcR Ⅰ/Hind Ⅲ/X? Ⅰ）酶識別序列，產(chǎn)物經(jīng)單酶切后連接到載體2構(gòu)建高效篩選載體4。
[解析]分析題圖可知，利用載體2構(gòu)建載體4時(shí)，只使用了X? Ⅰ限制酶，故擴(kuò)增出的RpsL 基因片段應(yīng)含X? Ⅰ酶識別序列，所以PCR 擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因RpsL （鏈霉素敏感基因）時(shí)，引物應(yīng)包含X? Ⅰ酶識別序列。
（3） 將改進(jìn)的P1基因整合到載體4構(gòu)建載體5。將載體5導(dǎo)入鏈霉素不敏感（由RpsL 突變造成）、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株，應(yīng)采用含有卡那霉素（2分）的平板進(jìn)行初步篩選。
[解析]分析可知，受體菌的表型為鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感，而載體5上具有RpsL （鏈霉素敏感基因）和KanR （卡那霉素抗性基因），故為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株，應(yīng)采用含有卡那霉素的平板進(jìn)行初步篩選。
（4） 用一定的方法篩選出如下菌株:P1基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA ,且載體5上其他DNA 片段全部丟失。該菌的表型為B。
A. 卡那霉素不敏感、鏈霉素敏感B. 卡那霉素敏感、鏈霉素不敏感
C. 卡那霉素和鏈霉素都敏感D. 卡那霉素和鏈霉素都不敏感
[解析]據(jù)題意知，P1 基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA ，載體5上其他DNA 片段全部丟失，所以該菌的表型依然是受體菌的表型，即鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感，B 選項(xiàng)符合題意。
（5） 可采用PCR （聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，答案合理即可）技術(shù)鑒定成功整合P1基因的菌株。之后以發(fā)酵法檢測苯丙氨酸產(chǎn)量。
[解析]提取受體菌的DNA ，以該DNA 為模板，采用P1基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，若獲得大量P1基因，即可確定該菌株成功整合了P1基因。
3. [2022江蘇，12分]纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異常可引起多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機(jī)制具有重要意義。請回答下列問題。
（1） 纖毛結(jié)構(gòu)如圖1所示，由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成?；w由中心體轉(zhuǎn)變而來，中心體在有絲分裂中的功能是參與紡錘體的形成。
[解析]細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。中心體可參與紡錘體的形成,其與有絲分裂有關(guān)。
（2） 某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X 是否發(fā)生了變異,對基因X 進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增與產(chǎn)物測序。從細(xì)胞樣品中分離DNA 時(shí),可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA 分離出來，溶液中添加NaCl 至2.0ml/L 的目的是溶解DNA 。
PCR 擴(kuò)增時(shí),需在耐高溫的DNA 聚合酶（Taq 酶）催化下，在引物3′ 端進(jìn)行DNA 鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，用于測序。
[解析]DNA 在2.0ml/L 的NaCl 溶液中的溶解度最大，高于或低于這一濃度，DNA 的溶解度均會(huì)下降，因此實(shí)驗(yàn)過程中添加NaCl 至2.0ml/L 的目的是溶解DNA 。PCR 擴(kuò)增時(shí)，需在耐高溫的DNA 聚合酶（Taq 酶）的催化下，在引物的3′ 端進(jìn)行DNA 鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
（3） 為研究蛋白質(zhì)X 在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP 與X 的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X?GFP 基因融合片段M 導(dǎo)入如圖2所示載體質(zhì)粒Y ,構(gòu)建Y?M 重組質(zhì)粒（在EcR Ⅴ識別位點(diǎn)插入片段）。請完成表。
圖2
圖3
[解析]據(jù)題圖可知，應(yīng)選擇圖2中的引物a 和引物b ，PCR 目的產(chǎn)物約為300+800=1100bp 。結(jié)合題中信息知，Y?M 的連接處上游含有Hind Ⅲ+EcR Ⅴ的識別序列，下游含有EcR Ⅴ+BamH Ⅰ的識別序列，又知構(gòu)建Y?M 重組質(zhì)粒時(shí)，在EcR Ⅴ識別位點(diǎn)插入片段，則Y?M 連接處測序后部分序列應(yīng)含EcR Ⅴ的識別序列，根據(jù)各限制酶識別序列分析，質(zhì)粒測序正確的是Q4 。
（4） 為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z 表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR 法檢測健康人與病人基因Z 的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA ，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA 作為模板，PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA 模板量相等的條件下,健康人Ct 值為15,而病人Ct 值為20（Ct 值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR 循環(huán)數(shù)）。從理論上估算，在PCR 擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的32（2分）倍。
[解析]RNA 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下可形成cDNA 。結(jié)合題中信息知，在總cDNA 模板量相等的條件下，健康人Ct 值為15，而病人Ct 值為20，說明病人的基因Z 表達(dá)水平較低，設(shè)健康人Z 基因的mRNA 數(shù)為x ，病人Z 基因的mRNA 數(shù)為y ，則有x×215=y×220 ，從理論上估算，在PCR 擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的25=32 （倍）。項(xiàng)目種類
作用底物
作用結(jié)果
限制酶
DNA 分子
切開磷酸二酯鍵，形成黏性末端或平末端
DNA 連接酶
DNA 分子片段
通過形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成新的DNA 分子
DNA 聚合酶
脫氧核苷酸
通過形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成新的DNA 分子
DNA 酶
DNA 分子
斷開磷酸二酯鍵，形成脫氧核苷酸
解旋酶
DNA 分子
斷開堿基對間的氫鍵，形成單鏈DNA 分子
RNA 聚合酶
核糖核苷酸
通過形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成單鏈RNA 分子
分步實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)
簡易操作、結(jié)果、分析
PCR 鑒定正向重組質(zhì)粒Y?M （圖2中融合片段M 中有白色的箭頭，代表方向）
①選擇圖2中引物a 、b ；
②PCR 目的產(chǎn)物約為1100 bp 。
確保M 及連接處序列正確,Y?M 的連接處上游含有Hind Ⅲ+EcR Ⅴ的識別序列，下游含有EcR Ⅴ+BamH Ⅰ的識別序列
③質(zhì)粒測序，圖3中正確的是Q4 （選填序列編號）。
檢測融合蛋白定位
④對照質(zhì)粒Y?GFP （僅表達(dá)GFP ）與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y?M 分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光，而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說明X 蛋白定位在纖毛基部。

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