應(yīng)用1:(實時)熒光定量PCR(RT-PCR)——以“新冠病毒核酸檢測”為例(1)RT-PCRRT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用,由RNA合成cDNA,再以cDNA為模板,在DNA聚合酶的作用下擴增合成目的片段。
(2)實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號的積累,實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
先從樣本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同時也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生物的RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄酶將樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進行PCR擴增,在PCR反應(yīng)體系中,包含一對特異性引物以及一個Taqman探針,該探針為一段特異性寡核苷酸序列,兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;若反應(yīng)體系存在靶序列,PCR反應(yīng)時探針與模板結(jié)合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解,報告基團與淬滅基團分離,發(fā)出熒光。每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān),病毒核酸濃度越高,Ct值越小(如圖)。
(3)實時熒光定量PCR方法檢測新冠病毒核酸從樣本中提取病毒RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用形成cDNA。然后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增,測定樣品中病毒核酸量。
在通過實時熒光定量PCR檢測新冠病毒感染時,檢測到的熒光強度變化如圖所示。與指數(shù)增長期相比,線性增長期目的基因數(shù)量的增長率下降,可能原因有底物濃度下降、酶活性下降等。Ct值的含義是指在PCR擴增過程中,每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。當樣本中初始模板越多時,Ct值就越小。Ct值≤37判定為陽性,Ct值>40或無Ct值判定為陰性。上圖所示新冠病毒核酸檢測結(jié)果應(yīng)判定為陽性。
應(yīng)用2:PCR定點突變技術(shù)該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點,而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。因此,分別利用引物1和2,引物3和4進行PCR后,得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成為一條完整的DNA片段。最后,用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。
1. (2023·江蘇揚州質(zhì)檢)實時熒光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸檢測,其原理是:在PCR復(fù)性過程中探針和引物一起與模板結(jié)合,探針兩側(cè)分別帶有熒光基團和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團,新鏈延伸過程中,DNA聚合酶會破壞探針,導致熒光基團與淬滅基團分離而發(fā)出熒光。利用RT-PCR進行核酸檢測的相關(guān)過程如圖所示。
下列說法錯誤的是(　　)A.做RT-PCR之前,需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B.RNA不能作為PCR擴增的模板,故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進行擴增C.若檢測結(jié)果有強烈熒光信號發(fā)出,說明被檢測者沒有感染病毒D.病毒的檢測還可以檢測病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體,其原理都是抗原—抗體雜交
解析 PCR擴增必須以DNA為模板,RNA不能作為PCR擴增的模板,所以需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進行擴增,B項正確;若檢測結(jié)果有強烈熒光信號發(fā)出,說明被檢測者極有可能感染了病毒,C項錯誤。
2.(2023·山東煙臺聯(lián)考)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中某種DNA含量。其原理是在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某模板鏈互補的熒光探針,熒光探針兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團,探針完整時,發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收不到熒光信號。當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處,會水解探針,使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號。即每擴增一次,就有一個熒光分子生成(如圖所示)。
下列相關(guān)敘述正確的是(　　)A.擴增過程中引物先于探針結(jié)合到模板DNA上B.在PCR系統(tǒng)中需加入解旋酶C.熒光信號積累越多,說明PCR循環(huán)次數(shù)越多D.若擴增n次,則其需要消耗2n-1個探針
解析 基因擴增過程中需要特定的引物,該引物的作用是定位基因的位置,與模板鏈結(jié)合并為子鏈的延伸提供起點,擴增過程中引物和探針應(yīng)同時結(jié)合到模板DNA上,A項錯誤;在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中無需加入解旋酶,可通過高溫解旋DNA,B項錯誤;據(jù)題干信息“即每擴增一次,就有一個熒光分子生成”可知,熒光信號積累越多,說明PCR循環(huán)次數(shù)越多,C項正確;據(jù)題干信息“在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某模板鏈互補的熒光探針”,即每個DNA分子需要1個探針,擴增n次,可得到2n個DNA分子,則共需要消耗2n-1個探針,D項錯誤。
3.(2023·江蘇百校聯(lián)考)重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板,經(jīng)過多次PCR 擴增,獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA 片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景,下圖表示利用重疊延伸PCR 技術(shù)擴增某目的基因的過程。
下列敘述正確的是(　　)A.引物中C+G 的含量越低,引物與模板DNA 結(jié)合的穩(wěn)定性越高B.在第一階段由于引物2和引物3發(fā)生堿基互補配對,因此兩者置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中C.引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進行一次復(fù)制后,共產(chǎn)生4種雙鏈DNA 分子D.在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中,經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA,至少要經(jīng)過3次復(fù)制
解析 C 與G之間有3個氫鍵,A 與T 之間有2個氫鍵,因此引物中G+C的含量越高,引物與模板DNA 結(jié)合的穩(wěn)定性越高,A項錯誤;由圖可知,引物2和引物3分別作用于同一段DNA 的兩條鏈,二者會發(fā)生堿基互補配對,因此需將它們置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中,B項正確;引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進行一次復(fù)制后,各產(chǎn)生2種雙鏈DNA分子,由于引物1和引物4合成的DNA屬于同一種DNA ,因此共產(chǎn)生了3種雙鏈DNA 分子,C項錯誤;在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中,經(jīng)第一階段要形成題圖所示雙鏈DNA ,至少要經(jīng)過2次復(fù)制,D項錯誤。
1.(2023·河北石家莊模擬)如圖是快速RT-PCR過程示意圖,①和②為逆轉(zhuǎn)錄酶催化的逆轉(zhuǎn)錄過程,③是PCR過程。據(jù)圖分析,下列敘述錯誤的是(　　)A.逆轉(zhuǎn)錄酶具有DNA聚合酶的能力B.③PCR過程只需要引物bC.RT-PCR可檢測基因表達水平D.RT-PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
解析 ③PCR過程需要引物a、b,因為后續(xù)的模板鏈序列既有與靶RNA一致的,也有與cDNA一致的,B項錯誤。
2.利用重疊延伸PCR技術(shù)進行定點突變,可以實現(xiàn)對纖維素酶基因的合理性改造,其過程如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)A.產(chǎn)物AB是依賴引物a和引物b擴增的結(jié)果B.引物c和引物b上均含有突變的堿基序列C.①過程需要先加熱至90 ℃以上后再冷卻至50 ℃左右D.②過程需要利用引物a和引物d獲得突變產(chǎn)物AD
解析 PCR技術(shù)中DNA單鏈延伸的方向是沿著引物的5'端向3'端延伸的,據(jù)此可分析,PCR1過程中的產(chǎn)物AB是依賴引物a和引物b擴增的結(jié)果,引物c和引物b分別與DNA的兩條鏈互補,若引物c和引物b完全與模板互補,則引物c和引物b會發(fā)生互補,導致引物失效,故引物c和引物b上均含有與模板鏈不能互補的堿基,均應(yīng)含有突變的堿基序列,A、B兩項正確;①過程是雙鏈DNA解聚為單鏈的過程,需加熱至90 ℃以上完成變性,而后將溫度下降到50 ℃左右復(fù)性,為子鏈的延伸做準備,②過程是子鏈延伸的過程,該過程需要利用AB上鏈和CD下鏈之間的互補配對來獲得突變產(chǎn)物AD,C項正確,D項錯誤。
3.(2023·湖南雅禮中學調(diào)研)新冠病毒是一種單鏈RNA病毒,常用“熒光RT-PCR技術(shù)”進行檢測,方法是取受檢者的mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,并大量擴增,用熒光標記的新冠病毒核酸探針來檢測樣品中新冠病毒的核酸含量。請回答下列問題。(1)“熒光RT-PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有　　　　　、　　　　 　、熒光標記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。?
耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
(2)如果要同時擴增兩種基因,則試劑盒中的引物應(yīng)該有　　　　　種。圖1為新冠病毒的ORFlab基因?qū)?yīng)的cDNA片段結(jié)構(gòu)示意圖,則與之對應(yīng)的引物結(jié)合的部位應(yīng)該是圖中的　　　(子鏈延伸方向為其自身的5'→3',用圖中數(shù)字作答)。若已知該基因的一條引物,　　　　(填“能”或“不能”)依據(jù)其堿基序列設(shè)計出另一條引物,理由是　? 　。
兩種引物的堿基序列沒有相關(guān)性
(3)在檢測過程中,隨著PCR的進行,反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累,熒光信號的強度也隨之增加。根據(jù)熒光強度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,得到一條熒光擴增曲線(如圖2)。
①出現(xiàn)“平臺期”最可能的原因是?? 　。?試劑盒中的原料、引物和探針數(shù)量一定,超出一定的循環(huán)數(shù)后,熒光分子不再增加②理論上,在檢測過程中,有熒光信號出現(xiàn),則說明檢測結(jié)果呈　　　　(填“陰”或“陽”)性,但為了保證檢測結(jié)果的準確性,一般要達到或超過閾值時才確診?，F(xiàn)有兩個待檢樣本,檢測時都出現(xiàn)了如圖2所示的曲線,但甲的A點比乙的A點明顯左移。請給這種結(jié)果作出科學合理的解釋(試劑盒合格且正常,操作過程規(guī)范且準確):　?? 　。?
甲樣本中的新冠病毒核酸含量更高,達到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少
解析 (1)根據(jù)題目信息可知,熒光RT-PCR技術(shù)的基本原理是將新冠病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,因此熒光RT-PCR技術(shù)所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶、引物、四種脫氧核苷酸、緩沖體系。(2)根據(jù)PCR的原理,在擴增DNA分子時每一條鏈均需與相應(yīng)的引物結(jié)合才能進行擴增,因此如果要將兩種基因分別擴增出來,則在試劑盒中的引物應(yīng)該有4種;在利用PCR擴增DNA分子過程中,DNA聚合酶只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸,又由于DNA的兩條鏈是反向平行的,所以引物與DNA分子單鏈的3'端相結(jié)合即圖示中的1和4所示部位。由于兩段引物的堿基序列沒有相關(guān)性,既不相同,也不互補,因此不能根據(jù)該基因一條引物的堿基序列設(shè)計出另一條引物。
(3)分析熒光擴增曲線圖,圖中曲線通過熒光強度變化反映產(chǎn)物量的變化,因此曲線中出現(xiàn)“平臺期”最可能的原因是試劑盒中的原料和探針數(shù)量一定,超出一定的循環(huán)數(shù)后,熒光強度不再增加。理論上,在檢測過程中,有熒光信號出現(xiàn),則說明檢測結(jié)果呈陽性,但為了保證檢測結(jié)果的準確性,一般要達到或超過閾值時才確診。檢測結(jié)果甲的A點比乙的A點明顯左移,說明甲樣本中的新冠病毒核酸含量更高,達到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少。

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