專題18 生物技術(shù)與工程綜合 --【浙江專用】近5年（20-24年）高考1年模擬生物真題分類匯編-試卷下載-教習(xí)網(wǎng)

1、（2024年6月浙江卷）植物體在干旱、蟲害或微生物侵害等脅迫過程中會產(chǎn)生防御物質(zhì)，這類物質(zhì)屬于次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物在植物抗蟲、抗病等方面發(fā)揮作用，也是藥物、香料和色素等的重要來源。次生代謝產(chǎn)物X的研發(fā)流程如下：
篩選高產(chǎn)細(xì)胞→細(xì)胞生長和產(chǎn)物X合成關(guān)系的確定→發(fā)酵生產(chǎn)X
回答下列問題：
（1）獲得高產(chǎn)細(xì)胞時，以X含量高的植物品種的器官和組織作為_____，經(jīng)脫分化形成愈傷組織，然后通過液體振蕩和用一定孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行_____獲得分散的單細(xì)胞。
（2）對分離獲得的單細(xì)胞進(jìn)行_____培養(yǎng)，并通過添加_____或營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)方法獲取細(xì)胞周期同步、遺傳和代謝穩(wěn)定、來源單一的細(xì)胞群。為進(jìn)一步提高目標(biāo)細(xì)胞的X含量，將微生物菌體或其產(chǎn)物作為誘導(dǎo)子加入到培養(yǎng)基中，該過程模擬了_____的脅迫。
（3）在大規(guī)模培養(yǎng)高產(chǎn)細(xì)胞前，需了解植物細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的關(guān)系。培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的模型分為3種，如圖所示。若X只在細(xì)胞生長停止后才能合成，則X的合成符合圖_____（填“甲”“乙”“丙”），根據(jù)該圖所示的關(guān)系，從培養(yǎng)階段及其目標(biāo)角度，提出獲得大量X的方法。_____
（4）多種次生代謝產(chǎn)物在根部合成與積累，如人參、三葉青等藥用植物，可通過_____培養(yǎng)替代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物。隨著基因組測序和功能基因組學(xué)的發(fā)展，在全面了解生物體合成某次生代謝產(chǎn)物的_____和_____的基礎(chǔ)上，可利用合成生物學(xué)的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生產(chǎn)植物的次生代謝產(chǎn)物。
【答案】（1） ①. 外植體 ②. 過濾
（2） ①. 擴(kuò)大 ②. 過量的胸苷 ③. 微生物侵害
（3） ①. 丙 ②. 將細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期（即停止生長時期）一定時間后，通過分離提純獲得大量X
（4） ①. 根的水培養(yǎng) ②. 相關(guān)基因組成 ③. 基因表達(dá)過程 ④. 基因工程和發(fā)酵
【解析】
【分析】1、植物組織培養(yǎng)就是在無菌和人工控制的條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整的植株。2、植物組織培養(yǎng)的條件：①細(xì)胞離體和適宜的外界條件（如適宜溫度、適時的光照、pH和無菌環(huán)境等）；②一定的營養(yǎng)（無機(jī)、有機(jī)成分）和植物激素（生長素和細(xì)胞分裂素）。
【小問1詳解】
植物體的器官和組織、細(xì)胞都可以作為外植體，經(jīng)脫分化形成愈傷組織，將愈傷組織進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使其分散成小的細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大的細(xì)胞團(tuán)和殘渣，離心除去小的殘渣，得到單細(xì)胞懸浮液。
【小問2詳解】
分離獲得的單細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過添加過量胸苷，（向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入過量胸苷（TdR），處于S期的細(xì)胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢復(fù)正常分裂，而處于其它時期的細(xì)胞不受過量TdR影響）或營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)方法獲取細(xì)胞周期同步、遺傳和代謝穩(wěn)定、來源單一的細(xì)胞群。將微生物菌體或其產(chǎn)物作為誘導(dǎo)子加入到培養(yǎng)基中，模擬了微生物侵害的迫害條件。
【小問3詳解】
由題可知X只在細(xì)胞生長停止后才能合成，所以丙圖符合。所以要獲得大量X的方法，是將細(xì)胞培養(yǎng)知穩(wěn)定期（即停止生長時期）一定時間后，通過分離提純獲得大量X。
【小問4詳解】
由題知，多種次生代謝產(chǎn)物在根部合成與積累，所以要對根進(jìn)行培養(yǎng)，為了方便進(jìn)行次生代謝物的收集，可以對根進(jìn)行水培。要大量獲得次生代謝物可以通過基因工程，將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入酵母菌體內(nèi)，然后通過發(fā)酵工程獲得，基因工程的前提是要了解生物體合成某次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)基因組成和基因表達(dá)過程。
2、（2024年1月浙江卷）鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境中Zn2+的功能。為研究該植物2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Zn2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，并進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定?；卮鹣铝袉栴}：
（1）鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N克隆。以該植物______為材料提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)序列信息設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR每個循環(huán)第一步是進(jìn)行熱變性處理，該處理的效果類似于生物體內(nèi)______的作用效果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳時，DNA分子因?yàn)楹琠_____而帶負(fù)電荷，凝膠點(diǎn)樣孔端應(yīng)靠近電泳槽負(fù)極接口；當(dāng)2個PCR產(chǎn)物分子量接近時，若延長電泳時間，凝膠中這2個條帶之間的距離會______?；厥誅NA片段，連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序驗(yàn)證。
（2）重組表達(dá)載體構(gòu)建。分別將含M、N基因的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體同時進(jìn)行雙酶切處理，然后利用______連接，將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功。此反應(yīng)可以用大腸桿菌懸液當(dāng)模板的原因是______。
（3）酵母菌轉(zhuǎn)化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，直接在固體培養(yǎng)基進(jìn)行______培養(yǎng)，活化后接種至液體培養(yǎng)基，采用______以擴(kuò)大菌體數(shù)量，用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母菌。檢測M、N基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)水平，無顯著差異。
（4）轉(zhuǎn)基因酵母功能鑒定。分別將轉(zhuǎn)化了M、N基因的酵母菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液用______法逐級稀釋至OD600為0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天，菌落生長如圖。該實(shí)驗(yàn)中陰性對照為______。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步推測：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N中，轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)的是______，依據(jù)是______。
注：OD600為波長600nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高；空載體為未插入M或N基因的表達(dá)載體。
【答案】（1） ①. 根 ②. 解旋酶 ③. 磷酸基團(tuán) ④. 變長
（2） ①. DNA連接酶 ②. 熱變性使大腸桿菌內(nèi)的DNA外溢
（3） ①. 劃線分離 ②. 振蕩培養(yǎng)
（4） ①. 梯度稀釋 ②. 鋅吸收缺陷型酵母+空載體 ③. N ④. 轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量數(shù)量多
【解析】
【分析】由圖中光譜吸收值可知，鋅吸收缺陷型酵母+N基因表達(dá)載體組吸收值與野生型酵母+空載體組相近，轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量數(shù)量多，說明N轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)。
【小問1詳解】
由題意可知，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)膜，所以以該植物的根為材料提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熱變性處理的目的是使DNA解螺旋，相當(dāng)于生物體內(nèi)解旋酶的效果。DNA分子因?yàn)楹辛姿峄鶊F(tuán)而帶負(fù)電荷，所以其點(diǎn)樣孔端應(yīng)靠近電泳槽負(fù)極接口。隨著時間的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，時間越長，距離差越大。
【小問2詳解】
內(nèi)切酶處理后的質(zhì)粒和目的基因，用DNA連接酶進(jìn)行連接。由于RCR過程中熱變性使大腸桿菌內(nèi)的DNA外溢，所以可用大腸桿菌懸液當(dāng)模板，利用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功。
【小問3詳解】
凍存酵母菌可直接在固體培養(yǎng)基上涂布或平板劃線接種后進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行活化，然后轉(zhuǎn)至液體培養(yǎng)基增殖，培養(yǎng)過程中進(jìn)行震蕩，有利于增加培養(yǎng)液的溶氧量和使酵母菌和培養(yǎng)液充分接觸，從而快速增殖。
【小問4詳解】
由題意可知，菌液稀釋后OD600為0.06、0.006和0.0006，說明其進(jìn)行10指數(shù)的梯度稀釋。由圖可知，鋅吸收缺陷型酵母+空載體組不會吸收鋅，為陰性對照。由圖中光譜吸收值可知，轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量數(shù)量多，說明N轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)。
3、（2023年6月浙江卷）賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術(shù)可提高食物中賴氨酸含量?；卮鹣铝袉栴}：
（1）植物細(xì)胞合成的賴氨酸達(dá)到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于______。根據(jù)這種調(diào)節(jié)方式，在培養(yǎng)基中添加______，用于篩選經(jīng)人工誘變的植物懸浮細(xì)胞，可得到抗賴氨酸類似物的細(xì)胞突變體，通過培養(yǎng)獲得再生植株。
（2）隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動物細(xì)胞工程結(jié)合和發(fā)展，2011年我國首次利用轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功培育了高產(chǎn)賴氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：
①構(gòu)建乳腺專一表達(dá)載體。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通過檢索______獲取其編碼序列，用化學(xué)合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動子的相應(yīng)載體連接，構(gòu)建出乳腺專一表達(dá)載體。
②表達(dá)載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細(xì)胞（BEF）。將表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，與BEF膜發(fā)生______，表達(dá)載體最終進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生轉(zhuǎn)化。
③核移植。將轉(zhuǎn)基因的BEF作為核供體細(xì)胞，從牛卵巢獲取卵母細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)及去核后作為______。將兩種細(xì)胞進(jìn)行電融合，電融合的作用除了促進(jìn)細(xì)胞融合，同時起到了______重組細(xì)胞發(fā)育的作用。
④重組細(xì)胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。重組細(xì)胞體外培養(yǎng)至______，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。
⑤檢測。DNA水平檢測：利用PCR技術(shù)，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對照，以______為陽性對照，檢測到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。RNA水平檢測：從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞，提取總RNA，對總RNA進(jìn)行______處理，以去除DNA污染，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為______，利用特定引物擴(kuò)增目的基因片段。結(jié)果顯示目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，原因是什么？______。
【答案】（1） ①. 負(fù)反饋調(diào)節(jié) ②. 過量賴氨酸類似物
（2） ①. 基因數(shù)據(jù)庫 ②. 融合 ③. 核受體細(xì)胞 ④. 激活 ⑤. 早期囊胚 ⑥. 轉(zhuǎn)基因BEF
⑦. DNA酶
⑧. PCR的模板 ⑨. 構(gòu)建的表達(dá)載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細(xì)胞中啟動轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細(xì)胞中不能表達(dá)。
【解析】
【分析】負(fù)反饋調(diào)節(jié)是指在一個系統(tǒng)中，系統(tǒng)工作的效果，反過來又作為信息調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的工作，并且使系統(tǒng)工作的效果減弱或受到限制，有助于系統(tǒng)保持穩(wěn)定?；蚬こ碳夹g(shù)的基本步驟：(1)目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等；(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法；(4)目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA-分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交技術(shù).個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【小問1詳解】
負(fù)反饋調(diào)節(jié)是指在一個系統(tǒng)中，系統(tǒng)工作效果，反過來又作為信息調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的工作，并且使系統(tǒng)工作的效果減弱或受到限制，有助于系統(tǒng)保持穩(wěn)定。植物細(xì)胞合成的賴氨酸達(dá)到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于負(fù)反饋調(diào)節(jié)。如果想得到抗賴氨酸類似物的細(xì)胞突變體可在培養(yǎng)基中添加過量賴氨酸類似物。
【小問2詳解】
①從基因數(shù)據(jù)庫獲取獲取目的基因編碼序列，用化學(xué)合成法制備可得到目的基因。
②表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞膜成分，其與BEF膜發(fā)生融合。
③去核的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞，其處于減數(shù)第二次分裂中期，因?yàn)槁涯讣?xì)胞中含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。電融合的作用除了促進(jìn)細(xì)胞融合，同時起到了激活重組細(xì)胞發(fā)育的作用。
④胚胎發(fā)育到適宜階段可取出向受體移植。牛、羊一般要培養(yǎng)到桑椹胚或囊胚階段；植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。
⑤陽性對照：按照當(dāng)前實(shí)驗(yàn)方案一定能得到正面預(yù)期結(jié)果的對照實(shí)驗(yàn)。陽性對照是已知的對測量結(jié)果有影響的因素，目的是確定實(shí)驗(yàn)程序無誤。陰性對照和陽性對照相反，按照當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)方案一定不能得到正面預(yù)期結(jié)果的對照實(shí)驗(yàn)。排除未知變量對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的不利影響。本實(shí)驗(yàn)以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對照，為了檢測到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。應(yīng)該以含有目的基因的牛耳組織細(xì)胞為陽性對照。為了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，原因是構(gòu)建的表達(dá)載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細(xì)胞中啟動轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細(xì)胞中不能表達(dá)。
4、（2023年1月浙江卷）甲植物細(xì)胞核基因具有耐鹽堿效應(yīng)，乙植物細(xì)胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應(yīng)。某研究小組用甲、乙兩種植物細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞雜交相關(guān)研究，基本過程包括獲取原生質(zhì)體、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合、篩選融合細(xì)胞、雜種植株再生和鑒定，最終獲得高產(chǎn)耐鹽堿再生植株?；卮鹣铝袉栴}：
（1）根據(jù)研究目標(biāo)，在甲、乙兩種植物細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞雜交前，應(yīng)檢驗(yàn)兩種植物的原生質(zhì)體是否具備__________的能力。為了便于觀察細(xì)胞融合的狀況，通常用不同顏色的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，若甲植物原生質(zhì)體采用幼苗的根為外植體，則乙植物可用幼苗的__________為外植體。
（2）植物細(xì)胞壁的主要成分為__________和果膠，在獲取原生質(zhì)體時，常采用相應(yīng)的酶進(jìn)行去壁處理。在原生質(zhì)體融合前，需對原生質(zhì)體進(jìn)行處理，分別使甲原生質(zhì)體和乙原生質(zhì)體的__________失活。對處理后的原生質(zhì)體在顯微鏡下用__________計數(shù)，確定原生質(zhì)體密度。兩種原生質(zhì)體1∶1混合后，通過添加適宜濃度的PEG進(jìn)行融合；一定時間后，加入過量的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，稀釋的目的是__________。
（3）將融合原生質(zhì)體懸浮液和液態(tài)的瓊脂糖混合，在凝固前倒入培養(yǎng)皿，融合原生質(zhì)體分散固定在平板中，并獨(dú)立生長、分裂形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細(xì)胞源于__________。下列各項中能說明這些愈傷組織只能來自于雜種細(xì)胞的理由是哪幾項？__________
A ．甲、乙原生質(zhì)體經(jīng)處理后失活，無法正常生長、分裂
B．同種融合的原生質(zhì)體因甲或乙原生質(zhì)體失活而不能生長、分裂
C．培養(yǎng)基含有抑制物質(zhì)，只有雜種細(xì)胞才能正常生長、分裂
D．雜種細(xì)胞由于結(jié)構(gòu)和功能完整可以生長、分裂
（4）愈傷組織經(jīng)__________可形成胚狀體或芽。胚狀體能長出__________，直接發(fā)育形成再生植株。
（5）用PCR技術(shù)鑒定再生植株。已知甲植物細(xì)胞核具有特異性DNA序列a，乙植物細(xì)胞質(zhì)具有特異性DNA序列b；M1、M2為序列a的特異性引物，N1、N2為序列b的特異性引物。完善實(shí)驗(yàn)思路：
Ⅰ．提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴(kuò)增的__________。
Ⅱ．將DNA提取物加入PCR反應(yīng)體系，__________為特異性引物，擴(kuò)增序列a；用同樣的方法擴(kuò)增序列b。
Ⅲ．得到的2個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)__________后，若每個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中均出現(xiàn)了預(yù)期的__________個條帶，則可初步確定再生植株來自于雜種細(xì)胞。
【答案】（1） ①. 再生 ②. 葉
（2） ①. 纖維素 ②. 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 ③. 血細(xì)胞計數(shù)板 ④. 降低PEG濃度，使其失去融合作用
（3） ①. 同一個雜種融合原生質(zhì)體 ②. ABD
（4） ①. 再分化 ②. 根和芽
（5） ①. 模板 ②. M1、M2 ③. 凝膠電泳 ④. 1
【解析】
【分析】1、植物組織培養(yǎng)過程：離體的植物組織經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，經(jīng)過再分化愈傷組織又能重新分化為有結(jié)構(gòu)的組織和器官，最終形成完整的植株。
2、植物體細(xì)胞雜交可以克服植物有性雜交不親和性、打破物種之間的生殖隔離，操作過程包括:原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選、雜種細(xì)胞培養(yǎng)、雜種植株再生以及雜種植株鑒定等步驟。
【小問1詳解】
在甲、乙兩種植物細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞雜交前，應(yīng)檢驗(yàn)兩種植物的原生質(zhì)體是否具備再生的能力。為了便于觀察細(xì)胞融合的狀況，通常用不同顏色的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，若甲植物原生質(zhì)體采用幼苗的根為外植體，則乙植物可用幼苗的葉為外植體。
【小問2詳解】
植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素和果膠，在獲取原生質(zhì)體時，常采用相應(yīng)的酶進(jìn)行去壁處理。甲植物細(xì)胞核基因具有耐鹽堿效應(yīng)，乙植物細(xì)胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應(yīng)，在原生質(zhì)體融合前，需對原生質(zhì)體進(jìn)行處理，分別使甲原生質(zhì)體和乙原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核失活，融合后具有甲植物的細(xì)胞核基因和乙植物的細(xì)胞質(zhì)基因。對處理后的原生質(zhì)體在顯微鏡下用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，確定原生質(zhì)體密度。兩種原生質(zhì)體1∶1混合后，通過添加適宜濃度的PEG進(jìn)行融合；一定時間后，加入過量的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，稀釋的目的是降低PEG濃度,使其失去融合作用。
【小問3詳解】
將融合原生質(zhì)體懸浮液和液態(tài)的瓊脂糖混合，在凝固前倒入培養(yǎng)皿，融合原生質(zhì)體分散固定在平板中，并獨(dú)立生長、分裂形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細(xì)胞源于同一個雜種融合的原生質(zhì)體。未融合的原生質(zhì)體因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的失活，無法正常生長、分裂；同種融合的原生質(zhì)體也因?yàn)榧自|(zhì)體細(xì)胞質(zhì)或乙原生質(zhì)體細(xì)胞核失活而不能生長、分裂；只有雜種細(xì)胞才具備有活性的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，可以生長、分裂，因此這些愈傷組織只能來自于雜種細(xì)胞。故選ABD。
【小問4詳解】
愈傷組織經(jīng)再分化可形成胚狀體或芽。胚狀體能長出根和芽，直接發(fā)育形成再生植株。
【小問5詳解】
Ⅰ．提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。
Ⅱ．將DNA提取物加入PCR反應(yīng)體系，M1、M2為特異性引物，擴(kuò)增序列a；用同樣的方法擴(kuò)增序列b。
Ⅲ．得到的2個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，若每個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中均出現(xiàn)了預(yù)期的1個條帶，則可初步確定再生植株來自于雜種細(xì)胞。
5、（2022年6月浙江卷）回答下列（一）、（二）小題：
（一）回答與產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌育種有關(guān)的問題：
（1）為快速分離產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，可將土樣用___________制成懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃的___________中保溫一段時間，其目的是___________。
（2）為提高篩選效率，可將菌種的___________過程與菌種的產(chǎn)酶性能測定一起進(jìn)行：將上述懸液稀釋后涂布于淀粉為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用___________顯色方法，根據(jù)透明圈與菌落直徑比值的大小，可粗略估計出菌株是否產(chǎn)酶及產(chǎn)酶性能。
（3）為了獲得高產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，可利用現(xiàn)有菌種，通過___________后再篩選獲得，或利用轉(zhuǎn)基因、___________等技術(shù)獲得。
（二）回答與植物轉(zhuǎn)基因和植物克隆有關(guān)的問題：
（4）在用農(nóng)桿菌侵染的方法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因過程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生長，二是篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)選擇培養(yǎng)基中抗生素濃度___________時，通常會出現(xiàn)較多假陽性植株，因此在轉(zhuǎn)基因前需要對受體進(jìn)行抗生素的___________檢測。
（5）為提高培育轉(zhuǎn)基因植株的成功率，植物轉(zhuǎn)基因受體需具有較強(qiáng)的___________能力和遺傳穩(wěn)定性。對培養(yǎng)的受體細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性的早期檢測，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)___________形態(tài)是否改變進(jìn)行判斷，也可通過觀察分裂期染色體的___________，分析染色體組型是否改變進(jìn)行判斷。
（6）植物轉(zhuǎn)基因受體全能性表達(dá)程度的高低主要與受體的基因型、培養(yǎng)環(huán)境、繼代次數(shù)和___________長短等有關(guān)。同時也與受體的取材有關(guān)，其中受體為___________時全能性表達(dá)能力最高。
【答案】（1） ①. 無菌水 ②. 水浴 ③. 殺死不耐熱微生物
（2） ①. 分離 ②. KI-I2
（3） ①. 人工誘變 ②. 原生質(zhì)體融合
（4） ①. 農(nóng)桿菌 ②. 過低 ③. 敏感性
（5） ①. 再生 ②. 細(xì)胞核 ③. 形態(tài)特征和數(shù)量
（6） ①. 培養(yǎng)時間 ②. 受精卵
【解析】
【分析】（一）選擇培養(yǎng)基是根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高該菌的篩選率。
（二）農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這一特點(diǎn)，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細(xì)胞中染色體的DNA上。轉(zhuǎn)化過程：目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→目的基因整合到植物細(xì)胞染色體上→目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。
【小問1詳解】
產(chǎn)生淀粉酶的枯草桿菌的最適溫度為50-75℃，要快速分離枯草桿菌，先將土樣加入無菌水制成枯草桿菌懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃的水浴中保溫一段時間，殺死不耐熱的微生物。
【小問2詳解】
將菌種的分離過程與菌種的產(chǎn)酶性能測定同時進(jìn)行可以提高篩選效率。用稀釋涂布平板法可以分離枯草桿菌，在培養(yǎng)基中添加淀粉作為唯一碳源，并且在培養(yǎng)基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草桿菌因?yàn)槟芾玫矸鄱婊?，同時淀粉由于被分解在菌落周圍會出現(xiàn)透明圈，比較透明圈與菌落直徑比值的大小，比值大的說明該菌株產(chǎn)酶性能較高。
【小問3詳解】
要獲得高產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，可利用誘變育種，由于變異的不定向性，人工誘變后還需要再篩選才能獲得高產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌。也可以利用轉(zhuǎn)基因、原生質(zhì)體融合等技術(shù)，從其他生物那里獲得與高產(chǎn)淀粉酶有關(guān)的基因，進(jìn)而獲得相應(yīng)的高產(chǎn)性狀。
【小問4詳解】
野生的農(nóng)桿菌沒有抗性基因，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌一般在其T—DNA中插入一種抗生素抗性基因?？股氐淖饔檬且种萍?xì)菌生長，農(nóng)桿菌屬于細(xì)菌，在其侵染植物過程中，可以用另一種抗生素抑制農(nóng)桿菌的生長，從而達(dá)到在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中消除轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中農(nóng)桿菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的細(xì)胞能在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上存活。當(dāng)培養(yǎng)基中抗生素濃度過低時，很多沒有抗性的細(xì)胞也存活下來，因此出現(xiàn)假陽性，故在轉(zhuǎn)基因前要對受體進(jìn)行抗生素的敏感性檢測。
【小問5詳解】
轉(zhuǎn)基因植株要經(jīng)過植物組織培育，要提高培育轉(zhuǎn)基因植株的成功率，應(yīng)該選再生能力和遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)的受體，這種受體全能性較高，能保持生物的性狀。對培養(yǎng)的受體細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性的早期檢測，可通過觀察細(xì)胞核形態(tài)是否改變進(jìn)行判斷，也可以直接在光學(xué)顯微鏡下觀察分裂期染色體的形態(tài)特征和數(shù)量，分析染色體組型是否改變。
【小問6詳解】
植物轉(zhuǎn)基因受體全能性表達(dá)程度高低除了與受體基因型、培養(yǎng)環(huán)境、繼代次數(shù)有關(guān)外，還與培養(yǎng)時間長短和受體的取材有關(guān)，受精卵是沒分化的細(xì)胞，分裂和分化能力都很強(qiáng)，故受體為受精卵時全能性表達(dá)能力最高。
6、（2022年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小題：
（一）紅曲霉合成的紅曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者進(jìn)行了紅曲色素的提取及紅色素的含量測定實(shí)驗(yàn)，流程如下：
（1）取紅曲霉菌種斜面，加適量____________洗下菌苔，制成菌懸液并培養(yǎng)，解除休眠獲得____________菌種。經(jīng)液體發(fā)酵，收集紅曲霉菌絲體，紅曲霉菌絲體與70%乙醇溶液混合，經(jīng)浸提、____________，獲得的上清液即為紅曲色素提取液。為進(jìn)一步提高紅曲色素得率，可將紅曲霉細(xì)胞進(jìn)行____________處理。
（2）紅曲色素包括紅色素、黃色素和橙黃色素等，紅色素在390nm、420nm和505nm波長處均有較大吸收峰。用光電比色法測定紅曲色素提取液甲的紅色素含量時，通常選用505nm波長測定的原因是____________。測定時需用____________作空白對照。
（3）生產(chǎn)上提取紅曲色素后的殘渣，經(jīng)__________處理后作為飼料添加劑或有機(jī)肥，這屬于廢棄物的無害化和__________處理。
（二）我國在新冠疫情方面取得了顯著的成效，但全球疫情形勢仍然非常嚴(yán)峻、尤其是病毒出現(xiàn)了新變異株——德爾塔、奧密克戎，更是威脅著全人類的生命健康。
（4）新冠病毒核酸定性檢測原理是：以新冠病毒的單鏈RNA為模板，利用__________酶合成DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，然后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入特異的__________，如果檢測到特異的雜交分子則核酸檢測為陽性。
（5）接種疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制備技術(shù)要點(diǎn)是：將腺病毒的復(fù)制基因敲除；以新冠病毒的__________基因?yàn)槟０搴铣傻腄NA插入腺病毒基因組，構(gòu)建重組腺病毒。重組腺病毒在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生新冠病毒抗原，從而引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。在此過程中，腺病毒的作用是作為基因工程中目的基因的____________。將腺病毒復(fù)制基因敲除的目的是____________。
（6）單克隆抗體有望用于治療新冠肺炎。單克隆抗體的制備原理是：取免疫陽性小鼠的____________細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)，使其融合，最后篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。與植物組織培養(yǎng)相比，雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)需要特殊的成分，如胰島素和____________。
【答案】（1） ①. 無菌水 ②. 活化 ③. 離心 ④. 破碎
（2） ①. 其它色素對該波長光的吸收相對較少，干擾相對較小 ②. 70%乙醇溶液
（3） ①. 滅菌 ②. 資源化
（4） ①. 逆轉(zhuǎn)錄 ②. 核酸探針
（5） ①. 抗原 ②. 載體 ③. 使腺病毒失去復(fù)制能力
（6） ①. 脾 ②. 動物血清
【解析】
【分析】1、無菌操作包括滅菌和消毒兩種方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；滅菌的方法有干熱滅菌、灼燒滅菌和高壓蒸汽滅菌。2、微生物接種：微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法，常用來統(tǒng)計樣品活菌數(shù)目的方法是稀釋涂布平板法。3、平板劃線法：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。
【小問1詳解】
防止污染，洗菌苔可加適量的無菌水，制成菌懸液并培養(yǎng)，解除休眠獲得活化菌種。紅曲霉菌絲體與70%乙醇溶液混合，經(jīng)浸提、離心，獲得的上清液即為紅曲色素提取液。為進(jìn)一步提高紅曲色素得率，可將紅曲霉細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，使細(xì)胞內(nèi)的紅曲色素釋放出來。
【小問2詳解】
用光電比色法測定紅曲色素提取液甲的紅色素含量時，通常選用505nm波長測定的原因是其它色素對該波長光的吸收相對較少，干擾相對較小。由于提取紅曲色素是用的70%乙醇溶液，故測定時需用70%乙醇溶液作空白對照。
7、(2021年6月浙江卷) 回答下列（一）、（二）小題：
（一）回答與甘蔗醋制作有關(guān)的問題：
（1）為了獲得釀造甘蔗醋的高產(chǎn)菌株，以自然發(fā)酵的甘蔗渣為材料進(jìn)行篩選。首先配制醋酸菌選擇培養(yǎng)基：將適量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，調(diào)節(jié)pH，再高壓蒸汽滅菌，經(jīng)__________后加入3%體積的無水乙醇。然后將10 g自然發(fā)酵的甘蔗渣加入選擇培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h。用__________將少量上述培養(yǎng)液涂布到含CaCO3的分離培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)48h。再挑取分離培養(yǎng)基上具有__________的單菌落若干，分別接種到與分離培養(yǎng)基成分相同的__________培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
（2）優(yōu)良產(chǎn)酸菌種篩選。將冰箱保存的菌種分別接入選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時間后，取合適接種量的菌液在30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)。持續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)液中醋酸濃度不再上升，或者培養(yǎng)液中______含量達(dá)到最低時，發(fā)酵結(jié)束。篩選得到的優(yōu)良菌種除了產(chǎn)酸量高外，還應(yīng)有____________________（答出2點(diǎn)即可）等特點(diǎn)。
（3）制醋過程中，可將甘蔗渣制作成固定化介質(zhì)，經(jīng)_________后用于發(fā)酵。其固定化方法為_________。
（二）斑馬魚是一種模式動物，體外受精發(fā)育，胚胎透明、便于觀察，可用于水質(zhì)監(jiān)測，基因功能分析以及藥物毒性與安全性評價等。
（1）由于人類活動產(chǎn)生的生活污水日益增多，大量未經(jīng)處理的污水直接排入河流、湖泊會引起水體__________，導(dǎo)致藻類大量繁殖形成水華。取水樣喂養(yǎng)斑馬魚，可用斑馬魚每周的體重和死亡率等指標(biāo)監(jiān)測水體污染程度。
（2）為了研究某基因在斑馬魚血管發(fā)育過程中的分子調(diào)控機(jī)制，用 DNA 連接酶將該基因連接到質(zhì)粒載體形成_______，導(dǎo)入到大腸桿菌菌株 DH5α 中。為了能夠連接上該目的基因、并有利于獲得含該目的基因的 DH5α 陽性細(xì)胞克隆，質(zhì)粒載體應(yīng)含有__________（答出2點(diǎn)即可）。提取質(zhì)粒后，采用____法，將該基因?qū)氲桨唏R魚受精卵細(xì)胞中，培養(yǎng)并觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎血管的發(fā)育情況。
（3）為了獲取大量斑馬魚胚胎細(xì)胞用于藥物篩選，可用__________分散斑馬魚囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，取分散細(xì)胞作為初始材料進(jìn)行__________培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中添加成纖維細(xì)胞作為__________，以提高斑馬魚胚胎細(xì)胞克隆的形成率。
【答案】 ①. 冷卻 ②. 玻璃刮刀 ③. 較大透明圈 ④. 斜面 ⑤. 乙醇 ⑥. 耐酒精度高、耐酸高 ⑦. 滅菌 ⑧. 吸附法 ⑨. 富營養(yǎng)化 ⑩. 重組DNA分子 ?. 限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、抗生素抗性基因 ?. 顯微注射 ?. 胰蛋白酶 ?. 原代 ?. 飼養(yǎng)層細(xì)胞
【解析】
【分析】1、涂布法：將待分離的菌液經(jīng)過大量稀釋后，均勻涂布在固體培養(yǎng)皿表面，經(jīng)培養(yǎng)后可形成單個菌落，是篩選高表達(dá)量菌株的常用方法；
2、基因工程的基本操作步驟為：獲取目的基因、形成重組DNA分子、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞和目的基因的表達(dá)。
【詳解】（一）
（1）高壓蒸汽滅菌剛結(jié)束時，培養(yǎng)基溫度較高，要等培養(yǎng)基冷卻后再加入3%體積的無水乙醇。涂布分離法可用于單菌落分離，使用玻璃刮刀將待分離的菌液涂布到分離培養(yǎng)基的整個平面上。醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的醋酸會使培養(yǎng)基中的CaCO3分解，形成透明圈。菌落小，透明圈大，代表著高產(chǎn)醋酸菌。菌種的貯存方法：在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存。
（2）醋酸發(fā)酵結(jié)束的標(biāo)志性：產(chǎn)物不再增加（醋酸濃度不再上升）或原料消耗到最低值（乙醇含量達(dá)到最低）。優(yōu)質(zhì)菌種不光要產(chǎn)酸高，還要耐高酸，同時還要耐酒精（原料）等特點(diǎn)。
（3）我們在利用微生物時，常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此，在培養(yǎng)微生物時必須進(jìn)行無菌操作，所以作為固定化介質(zhì)的甘蔗渣需要經(jīng)過滅菌處理。甘蔗渣類似果醋發(fā)酵裝置中的鋸末，可使醋桿菌吸附在甘蔗渣上進(jìn)行發(fā)酵。
（二）
（1）生活污水富含N、P，未經(jīng)處理就大量排放，會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，導(dǎo)致藻類大量繁殖形成水華或赤潮。
（2）具有相同黏性末端的目的基因和載體DNA（如質(zhì)粒），經(jīng)DNA連接酶處理后，會形成重組DNA分子。與目的基因相同的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，可以確保限制性內(nèi)切酶處理后與目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的連接。標(biāo)記基因（抗生素抗性基因）的存在，便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞。動物基因工程，通常采用顯微注射法將重組DNA分子導(dǎo)入動物受精卵中。
（3）使用胰蛋白酶處理囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，借助酶的專一性，可分解細(xì)胞間質(zhì)的蛋白質(zhì)，讓細(xì)胞分散，便于培養(yǎng)。將分散的細(xì)胞初次在卡氏瓶中培養(yǎng)，稱之為原代培養(yǎng)。提高細(xì)胞克隆形成率的措施有：選擇適宜的培養(yǎng)基、添加血清（胎牛血清最好）、飼養(yǎng)層細(xì)胞（滋養(yǎng)細(xì)胞如經(jīng)射線照射本身失去增殖力的小鼠成纖維細(xì)胞）支持生長、激素（胰島素等）刺激、使用CO2培養(yǎng)箱、調(diào)節(jié)pH等。
8、(2021年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小題：
（一）某環(huán)保公司從淤泥中分離到一種高效降解富營養(yǎng)化污水污染物的細(xì)菌菌株，制備了固定化菌株。
（1）從淤泥中分離細(xì)菌時常用劃線分離法或________法，兩種方法均能在固體培養(yǎng)基上形成________。對分離的菌株進(jìn)行誘變、________和鑒定，從而獲得能高效降解富營養(yǎng)化污水污染物的菌株。該菌株只能在添加了特定成分X的培養(yǎng)基上繁殖。
（2）固定化菌株的制備流程如下；①將菌株與該公司研制的特定介質(zhì)結(jié)合；②用蒸餾水去除________；③檢驗(yàn)固定化菌株的________。菌株與特定介質(zhì)的結(jié)合不宜直接采用交聯(lián)法和共價偶聯(lián)法，可以采用的2種方法是________。
（3）對外，只提供固定化菌株有利于保護(hù)該公司的知識產(chǎn)權(quán)，推測其原因是________。
（二）三葉青為蔓生的藤本植物，以根入藥。由于野生三葉青對生長環(huán)境要求非?？量?，以及生態(tài)環(huán)境的破壞和過度的采挖，目前我國野生三葉青已十分珍稀。
（1）為保護(hù)三葉青的________多樣性和保證藥材的品質(zhì)，科技工作者依據(jù)生態(tài)工程原理，利用________技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了三葉青的林下種植。
（2）依據(jù)基因工程原理，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染三葉青帶傷口的葉片，葉片產(chǎn)生酚類化合物，誘導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒上vir系列基因表達(dá)形成________和限制性核酸內(nèi)切酶等，進(jìn)而從質(zhì)粒上復(fù)制并切割出一段可轉(zhuǎn)移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA進(jìn)入葉片細(xì)胞并整合到染色體上，T-DNA上rl系列基因表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的植物激素，促使葉片細(xì)胞持續(xù)不斷地分裂形成________，再分化形成毛狀根。
（3）剪取毛狀根，轉(zhuǎn)入含頭孢類抗生素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次________培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛狀根轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基、置于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，通過控制搖床的________和溫度，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分中的________，獲得大量毛狀根，用于提取藥用成分。
【答案】 ①. 涂布分離 ②. 單菌落 ③. 篩選 ④. 未固定的細(xì)菌 ⑤. 降解富營養(yǎng)化污水污染物的能力 ⑥. 包埋法和吸附法 ⑦. 特定介質(zhì)能為菌株繁殖提供X ⑧. 遺傳 ⑨. 間種 ⑩. DNA聚合酶 ?. 愈傷組織 ?. 繼代 ?. 殺滅發(fā)根農(nóng)桿菌 ?. 轉(zhuǎn)速 ?. 營養(yǎng)元素以及生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度
【解析】
【分析】1、分離純化細(xì)菌最常用的方法是劃線分離法（平板劃線法）和涂布分離法（稀釋涂布平板法）。接種的目的是使聚集在一起的微生物分散成單個細(xì)胞，并在培養(yǎng)基表面形成單個細(xì)菌繁殖而成的子細(xì)胞群體--菌落。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些。
2、固定化酶( insluble enzyme)就是將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。固定化的方法有吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等。
3、植物組織培養(yǎng)的原理是植物細(xì)胞具有全能性，其具體過程：外植體→愈傷組織→胚狀體→新植體，其中脫分化過程要避光，而再分化過程需光。
4、在植物組織培養(yǎng)時，通過調(diào)節(jié)生長素和細(xì)胞分裂素的比值能影響愈傷組織分化出根或芽。
【詳解】（一）分析題意可知，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菑挠倌嘀蟹蛛x到一種高效降解富營養(yǎng)化污水污染物的細(xì)菌菌株，制備固定化菌株。
（1）分離純化細(xì)菌最常用的方法是劃線分離法或涂布分離法，兩種方法均能在固體培養(yǎng)基上形成單菌落。為了獲得能高效降解富營養(yǎng)化污水污染物的菌株，還需對分離的菌株進(jìn)行誘變處理，再經(jīng)篩選和鑒定。
（2）固定化的方法有吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等。由于菌株與特定介質(zhì)的結(jié)合不宜直接采用交聯(lián)法和共價偶聯(lián)法，故可以采用的2種方法是包埋法和吸附法。
（3）由于該菌株只能在添加了特定成分X的培養(yǎng)基上繁殖，可推測特定介質(zhì)能為菌株繁殖提供X，故該公司對外只提供固定化菌株，有利于保護(hù)該公司的知識產(chǎn)權(quán)。
（二）（1）生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性，為保護(hù)三葉青的遺傳多樣性和保證藥材的品質(zhì)；三葉青的林下種植，是利用間種技術(shù)。
（2）分析題意可知，從質(zhì)粒上復(fù)制并切割出一段可轉(zhuǎn)移的DNA片段（T-DNA），DNA復(fù)制需要DNA聚合酶，故可知，酚類化合物誘導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒上vir系列基因表達(dá)，形成DNA聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶等。根據(jù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)過程可知，相應(yīng)植物激素可以促使葉片細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，再分化形成毛狀根。
（3）剪取毛狀根，轉(zhuǎn)入含頭孢類抗生素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加抗生素的主要目的是殺滅發(fā)根農(nóng)桿菌。最后取毛狀根轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基、置于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，通過控制搖床的轉(zhuǎn)速和溫度，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分中的營養(yǎng)元素以及生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，獲得大量毛狀根，用于提取藥用成分。
9、(2020年7月浙江卷)回答下列（一）、（二）小題：
（一）回答與柑橘加工與再利用有關(guān)的問題：
（1）柑橘果實(shí)經(jīng)擠壓獲得果汁后，需用果膠酶處理，主要目的是提高果汁的__________。為確定果膠酶的處理效果，對分別加入不同濃度果膠酶的果汁樣品，可采用3種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①取各處理樣品，添加相同體積的__________，沉淀生成量較少的處理效果好。②對不同處理進(jìn)行離心，用比色計對上清液進(jìn)行測定，OD值__________的處理效果好。③對不同處理進(jìn)行__________，記錄相同體積果汁通過的時間，時間較短的處理效果好。
（2）加工后的柑橘殘渣含有抑菌作用的香精油及較多的果膠等。為篩選生長不被香精油抑制且能高效利用果膠的細(xì)菌，從腐爛殘渣中分離得到若干菌株，分別用無菌水配制成__________，再均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。配制適宜濃度的香精油，浸潤大小適宜并已__________的圓形濾紙片若干，再貼在上述培養(yǎng)基上。培養(yǎng)一段時間后，測量濾紙片周圍抑制菌體生長形成的透明圈的直徑大小。從直徑__________的菌株中取菌接種到含有適量果膠的液體培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)，若有果膠酶產(chǎn)生，搖晃試管并觀察，與接種前相比，液體培養(yǎng)基的__________下降。
（二）回答與基因工程和植物克隆有關(guān)的問題：
（1）天然農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上存在著一段DNA片段（T-DNA），該片段可轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞染色體上。為便于轉(zhuǎn)基因植物在組織培養(yǎng)階段的篩選，設(shè)計重組Ti質(zhì)粒時，應(yīng)考慮T-DNA中要有可表達(dá)的目的基因，還需要有可表達(dá)的__________。
（2）結(jié)合植物克隆技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，為獲得轉(zhuǎn)基因植株，農(nóng)桿菌侵染的宿主一般要選用具有優(yōu)良性狀、較高的遺傳穩(wěn)定性、__________及易被農(nóng)桿菌侵染等特點(diǎn)的植物材料。若植物材料對農(nóng)桿菌不敏感，則可用__________的轉(zhuǎn)基因方法。
（3）利用帶側(cè)芽的莖段獲得叢狀苗的過程與利用莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織再獲得叢狀苗的過程相比，前者總培養(yǎng)時間__________，且不經(jīng)歷__________過程，因而其遺傳性狀穩(wěn)定，是大多數(shù)植物快速繁殖的常用方法。
（4）與發(fā)芽培養(yǎng)基相比，配制轉(zhuǎn)基因叢狀苗生根培養(yǎng)基時，可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)添加__________，促進(jìn)叢狀苗基部細(xì)胞分裂形成愈傷組織并進(jìn)一步分化形成__________，最終形成根。還可通過改變MS培養(yǎng)基促進(jìn)生根，如_____（A．提高蔗糖濃度B．降低培養(yǎng)基濃度C．提高大量元素濃度D．不添加瓊脂）。
【答案】 ①. 澄清度 ②. 95%乙醇 ③. 較小 ④. 抽濾 ⑤. 細(xì)菌懸液 ⑥. 滅菌 ⑦. 較小 ⑧. 粘性 ⑨. 抗性基因 ⑩. 全能性表達(dá)充分 ?. 顯微注射 ?. 短 ?. 脫分化 ?. 生長素 ?. 根的分生組織 ?. B
【解析】
【分析】發(fā)芽培養(yǎng)基：3000mLMS培養(yǎng)基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g瓊脂，再加蒸餾水至4000mL，混合均勻加熱至瓊脂融化后，通過三角漏斗分裝至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg壓力下在滅菌鍋內(nèi)滅菌20分鐘。
生根培養(yǎng)基：1000mLMS培養(yǎng)基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g瓊脂，再加蒸餾水至2000mL，混合均勻加熱至瓊脂融化后，通過三角漏斗分裝至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg壓力下在滅菌鍋內(nèi)滅菌20分鐘。
【詳解】（一）（1）由于植物細(xì)胞壁和植物細(xì)胞間果膠的存在時，果汁的澄清度受到一定的影響，因此可以加入果膠酶使果膠降解為可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判斷果膠酶的處理效果，可采用三種方法，①看果膠的剩余量，果膠不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果膠的剩余量少，處理效果好，②進(jìn)行離心處理，取上清液測OD值，OD值越小，說明降解越充分，果膠酶的處理效果越好，③對不同處理進(jìn)行抽濾，記錄相同體積果汁的通過時間，固形物含量越少，時間越短，處理效果越好。
（2）為篩選不被香精油抑制且能高效利用果膠的細(xì)菌，需從腐爛殘渣中分離菌株，用無菌水配制成細(xì)菌懸液，再涂布在LB固體培養(yǎng)基上待篩選。由于目標(biāo)是篩選不被香精油抑制的細(xì)菌，因此還需準(zhǔn)備香精油，并將其制作成濾紙片貼在培養(yǎng)基上，香精油需滅菌處理。觀察濾紙片周圍的抑菌圈，直徑越小說明該菌株越不易被香精油抑制，因而成為初步待選的菌株。再進(jìn)一步接種到含果膠的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，果膠使植物細(xì)胞粘連，若果膠被降解，則液體培養(yǎng)基的粘性下降。
（二）（1）設(shè)計重組質(zhì)粒時，除了要含有可表達(dá)的目的基因，還需要有可表達(dá)的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培養(yǎng)基上，含重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞能夠生長，因而被篩選出來。
（2）轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)要求宿主細(xì)胞性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定性較高、全能性（細(xì)胞發(fā)育成個體的潛能）較高及易被農(nóng)桿菌侵染等特點(diǎn)。若植物材料對農(nóng)桿菌不敏感，可采用顯微注射的方法。
（3）利用帶側(cè)芽的莖段獲得叢狀苗的過程，比利用莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織獲得叢狀苗的過程時間更短，因?yàn)椴恍枰?jīng)歷脫分化的過程，而且遺傳性狀穩(wěn)定。植物器官的分化需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)及適宜的激素配比，配制叢狀苗生根培養(yǎng)基需根據(jù)實(shí)際情況添加生長素，促進(jìn)基部細(xì)胞形成愈傷組織，并進(jìn)一步分化形成根的分生組織，最終形成根。比較發(fā)芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基可知MS培養(yǎng)基的濃度下降，因此可降低培養(yǎng)基的濃度促進(jìn)生根。故選B。
10、(2020年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小題：
（一）回答與泡菜制作有關(guān)的問題：
（1）用蘿卜等根菜類蔬菜制作泡菜，用熱水短時處理，可抑制某些微生物產(chǎn)生_____，從而使成品泡菜口感較脆。同時，該處理也會使泡菜發(fā)酵時間縮短，其原因是_______。
（2）泡菜發(fā)酵初期，由于泡菜罐加蓋并水封，會使______菌被逐漸抑制。發(fā)酵中期，乳酸菌大量繁殖，會使______菌受到抑制。發(fā)酵后期，乳酸生產(chǎn)過多，會使乳酸菌受到抑制。
（3）從泡菜汁中可分離制作酸奶的乳酸菌，首先對經(jīng)多次發(fā)酵的泡菜汁進(jìn)行過濾，然后取濾液進(jìn)行______，再用______的方法在某種含牛乳的專用的培養(yǎng)基中進(jìn)行初步篩選。該培養(yǎng)基必須含有______，以便于觀察是否產(chǎn)酸。
（4）自然界中醋桿菌常與乳酸菌共同生長。若要篩選出醋桿菌，則其專用的培養(yǎng)基中應(yīng)添加______。
（二）回答與基因工程和植物克隆有關(guān)的問題：
（1）為了獲取某植物葉片無菌的原生質(zhì)體，先將葉片經(jīng)表面消毒并去除下表皮，再將其置于經(jīng)______處理的較高滲透壓的混合酶液中。酶解后，經(jīng)多次離心獲得原生質(zhì)體。然后測定該原生質(zhì)體的活性，可采用的方法有______（答出2點(diǎn)即可）。
（2）若要獲得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。為了提高目的基因和質(zhì)粒重組的成功率，選擇使用______，對含目的基因的DNA片段進(jìn)行處理，使其兩端形成不同的黏性末端，對質(zhì)粒也進(jìn)行相同的處理，然后用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。通過在大腸桿菌中______，以獲得大量的重組質(zhì)粒，最終將其導(dǎo)入原生質(zhì)體中。
（3）原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中，只有重新形成______后，才可進(jìn)行有絲分裂。多次分裂形成的小細(xì)胞團(tuán)可通過______或器官發(fā)生的途徑再生植株。
【答案】 ①. 果膠酶 ②. 細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)外流使乳酸菌快速地獲得營養(yǎng)物質(zhì) ③. 喜好氧的 ④. 不耐酸的 ⑤. 稀釋 ⑥. 涂布分離 ⑦. 酸堿指示劑 ⑧. 乙醇 ⑨. 過濾滅菌 ⑩. 染色法，滲透吸水或失水 ?. 化學(xué)合成 ?. 兩種限制性核酸內(nèi)切酶 ?. 擴(kuò)增 ?. 細(xì)胞壁 ?. 胚胎發(fā)生
【解析】
【分析】泡菜制作：
①菌種：假絲酵母和乳酸菌；②發(fā)酵原理：在無氧條件下，微生物利用菜中的糖和其他營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物有有機(jī)酸和醇類物質(zhì)等，還有亞硝酸。③亞硝酸鹽的測定：亞硝酸鹽可與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，這一產(chǎn)物再與N-1-萘基乙二胺偶聯(lián)，形成紫紅色產(chǎn)物，可用光電比色法定量。
【詳解】（一）
（1）用蘿卜等根菜類蔬菜制作泡菜時，為抑制某些微生物產(chǎn)生果膠酶，從而使成品泡菜口感較脆，可用熱水短時處理。同時，該處理也會使細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)外流使乳酸菌快速地獲得營養(yǎng)物質(zhì)，從而使泡菜發(fā)酵時間縮短。
（2）泡菜發(fā)酵初期，由于泡菜罐加蓋并水封，形成無氧環(huán)境，會使喜好氧的菌被逐漸抑制。發(fā)酵中期，乳酸菌大量繁殖，產(chǎn)生乳酸，會使不耐酸的菌受到抑制。發(fā)酵后期，乳酸生產(chǎn)過多，又會抑制乳酸菌。
（3）從泡菜汁中可分離制作酸奶的乳酸菌，首先對經(jīng)多次發(fā)酵的泡菜汁進(jìn)行過濾，然后取濾液進(jìn)行稀釋，再用涂布分離的方法在某種含牛乳的專用的培養(yǎng)基中進(jìn)行初步篩選。為了便于觀察是否產(chǎn)酸，該培養(yǎng)基必須含有酸堿指示劑。
（4）自然界中醋桿菌常與乳酸菌共同生長。由于醋酸桿菌可以利用乙醇產(chǎn)生醋酸，若要篩選出醋桿菌，則其專用的培養(yǎng)基中應(yīng)添加乙醇。
（二）
（1）為了獲取某植物葉片無菌的原生質(zhì)體，先將葉片經(jīng)表面消毒并去除下表皮，再將其置于經(jīng)過濾滅菌處理的較高滲透壓的混合酶液中。酶解后，經(jīng)多次離心獲得原生質(zhì)體?？刹捎萌旧āB透吸水或失水的方法測定該原生質(zhì)體的活性。
（2）可采用人工合成或PCR的方法獲得已知序列的抗病基因。對含目的基因的DNA片段進(jìn)行處理，為使其兩端形成不同的黏性末端，需要選擇使用兩種限制性核酸內(nèi)切酶，對質(zhì)粒也進(jìn)行相同的處理，為了提高目的基因和質(zhì)粒重組的成功率，然后用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。通過在大腸桿菌中擴(kuò)增，以獲得大量的重組質(zhì)粒，最終將其導(dǎo)入原生質(zhì)體中。
（3）原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中，只有重新形成細(xì)胞壁后，才可進(jìn)行有絲分裂。多次分裂形成的小細(xì)胞團(tuán)可通過胚胎發(fā)生或器官發(fā)生的途徑再生植株。
非選擇題
1．（2024·浙江溫州·三模）普通小麥?zhǔn)莾尚灾仓辏w細(xì)胞中染色體成對存在。條銹病由條銹菌引起，嚴(yán)重危害小麥生產(chǎn)，Yr5和Yr15基因都是有效的顯性抗條銹病基因?；卮鹣铝袉栴}：
(1)Yr5基因和Yr15基因分別在斯卑爾脫小麥和野生二粒小麥中被發(fā)現(xiàn)，兩種基因的根本區(qū)別是不同。將Yr5基因或Yr15基因?qū)肫胀ㄐ←溨校瑢?shí)現(xiàn)了物種間的 (填變異類型)，提高了小麥的抗逆性。
(2)研究者將Yr15基因整合到普通小麥1B染色體的短臂上(如圖甲)，獲得抗條銹病小麥品系F。提取抗條銹病小麥的作為PCR的模板擴(kuò)增Yr15基因，用凝膠電泳技術(shù)分離、鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。利用上述方法不能區(qū)分純合和雜合的抗條銹病小麥，因?yàn)? ，兩者電泳后DNA條帶的數(shù)量和位置相同。
(3)研究者培育了不抗條銹病小麥品系T，其1B染色體的短臂(1BS)被黑麥 1R染色體的短臂(1RS)取代，形成了B．R染色體(如圖乙)，B．R染色體形成的原因是發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)變異中的。品系T的其他染色體形態(tài)、功能與正常小麥相同。為檢測小麥細(xì)胞中的B．R染色體，研究者根據(jù)該染色體中DNA片段的特殊核苷酸序列，設(shè)計了熒光標(biāo)記的探針1RNOR，將該探針導(dǎo)入小麥的體細(xì)胞，根據(jù)觀察到熒光點(diǎn)的數(shù)目可判斷細(xì)胞中 B．R染色體數(shù)目。
注：B．R染色體可與IB染色體聯(lián)會并正常分離，但I(xiàn)RS與IBS不能發(fā)生重組。
(4)以純合的不抗條銹病小麥品系T、條銹菌、探針 1RNOR 及抗條銹病小麥品系F(含雜合子和純合子)為材料，可快速獲得大量純合的抗條銹病小麥，方法如下：讓純合小麥品系T與小麥品系F雜交得到F?代，。
(5)研究者將Yr5基因?qū)胄←溒废礣中，得到圖丙所示植株，將該植株與雜合的小麥品系F雜交，讓所有F?植株進(jìn)行自交，用探針 1RNOR 對F?植株進(jìn)行檢測，若各種基因型的植株結(jié)籽率相同，F(xiàn)?植株中抗條銹病且含熒光點(diǎn)的植株占。
【答案】(1) 堿基排列順序基因重組
(2) DNA 兩者都含 Yr15基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物類型相同
(3) 易位黑麥1R染色體短臂
(4)用條銹菌淘汰F1中不抗（條銹）病植株，讓F1自交得 F2，用探針1RNOR檢測F2植株，細(xì)胞中沒有熒光點(diǎn)的F2植株即為純合抗條銹病小麥
(5)7/16
【分析】不同基因的根本區(qū)別在于二者的堿基排列順序不同。由圖乙可知，B.R染色體形成的原因是兩條非同源染色體之間發(fā)生了易位導(dǎo)致的。抗條銹病且含熒光點(diǎn)的植株即含有Yr5或Yr15基因，又含有B.R染色體。
【詳解】（1）不同基因的根本區(qū)別在于二者的堿基排列順序不同。將Yr5基因或Yr15基因?qū)肫胀ㄐ←溨校瑢儆诨蛑亟M。
（2）利用PCR擴(kuò)增Yr15基因時，可提取抗條銹病小麥的DNA作為PCR的模板。無論純合還是雜合，兩者都含 Yr15基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物類型相同，所以利用上述方法不能區(qū)分純合和雜合的抗條銹病小麥。
（3）由題意及圖可知，B.R染色體形成的原因是兩條非同源染色體之間發(fā)生了易位導(dǎo)致的。不抗條銹病小麥品系T，其1B染色體的短臂(1BS)被黑麥 1R染色體的短臂(1RS)取代，形成了B.R染色體，欲檢測小麥細(xì)胞中的B.R染色體，設(shè)計探針時應(yīng)根據(jù)染色體黑麥1R染色體短臂中DNA片段的特殊核苷酸序列。
（4）讓純合小麥品系T與小麥品系F雜交得到F1代，由于F中含有純合子和雜合子，所以需用條銹菌淘汰F1中不抗（條銹）病植株，讓F1自交得 F2，用探針1RNOR檢測F2植株，細(xì)胞中沒有熒光點(diǎn)的F2植株即為純合抗條銹病小麥。
（5）抗條銹病且含熒光點(diǎn)的植株即含有Yr5或Yr15基因，又含有B.R染色體，丙植株與雜合的小麥品系F雜交，所得F1有B.R1B 2B2B，B.R1B 2B2BYr15，B.R1BYr52B2B，B.R1BYr52B2BYr15,上述四種基因型各占1/4，各自自交后，即含有Yr5基因，又含有B.R染色體1/4×3/4×3/4+1/4×1/2+1/4×（1/4×1/2+1/4×1/4+1/4×1）=7/16。
2．（2024·浙江金華·模擬預(yù)測）纖維素酶能將纖維素降解為單糖或寡糖，且轉(zhuǎn)化過程綠色、低碳，被認(rèn)為是纖維素資源化利用的可持續(xù)方法。在牛、羊等反芻動物的瘤胃中有能分解纖維素的微生物。某科研團(tuán)隊按照下圖所示的流程分離瘤胃中的纖維素分解菌，實(shí)驗(yàn)中需要甲、乙兩種培養(yǎng)基，并在平板上篩選到有透明降解圈的菌落。
(1)過程①中甲培養(yǎng)基中除水、無機(jī)鹽、氮源還應(yīng)有成分，培養(yǎng)基表面加入一層無菌的石蠟主要目的是。
(2)過程②中用適宜濃度NaCl溶液而不用無菌水進(jìn)行梯度稀釋的目的是。
(3)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)分離到的微生物產(chǎn)纖維素酶能力弱，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的M基因抑制了其體內(nèi)纖維素酶基因表達(dá)。某科研團(tuán)隊基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)擬對某細(xì)菌內(nèi)的M基因進(jìn)行敲除，以探究該基因?qū)ζ潴w內(nèi)纖維素酶基因表達(dá)的調(diào)控效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是其中一種能敲除特定基因的系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包含Cas9蛋白和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA兩部分組成，sgRNA能特異性識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白到相應(yīng)位置剪切DNA。
①在設(shè)計sgRNA序列時，必須事先測定M基因的，從而設(shè)計一段能得到sgRNA的DNA．在sgRNA與目的基因特定堿基序列部分結(jié)合，結(jié)合區(qū)最多含有種核苷酸，若要將M基因從目標(biāo)DNA上剪切下來，需要設(shè)計種sgRNA。
②將sgRNA基因和Cas9蛋白基因?qū)? 目標(biāo)細(xì)菌，科研人員為提高轉(zhuǎn)化效率，常常用處理目標(biāo)細(xì)菌一旦細(xì)胞中同時含有sgRNA和Cas9，Cas9就會與sgRNA結(jié)合在一起并在sgRNA的帶領(lǐng)下，來到能夠與sgRNA 的目的基因處，特異性地切割M基因。
③將CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因重組載體成功轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)菌后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組纖維素酶的表達(dá)量如圖所示，由此得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是，判斷依據(jù)是。
【答案】(1) 纖維素創(chuàng)設(shè)無氧環(huán)境，有利于厭氧微生物生長
(2)擴(kuò)大培養(yǎng)
(3) 兩端特定的堿基序列轉(zhuǎn)錄 8 2 感受態(tài) CaCl2 堿基互補(bǔ)配對 M基因?qū)ζ潴w內(nèi)纖維素酶基因起抑制表達(dá)作用敲除細(xì)胞株中纖維素酶表達(dá)量明顯比對照組高
【分析】培養(yǎng)基的成分有碳源、氮源、水和無機(jī)鹽，如果是固體培養(yǎng)基還需要添加瓊脂作為凝固劑。
【詳解】（1）過程①中甲培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，除水、無機(jī)鹽、氮源還應(yīng)有碳源，而本實(shí)驗(yàn)是分離能分解纖維素的微生物，所以添加的碳源為纖維素，培養(yǎng)基表面加入一層無菌的石蠟主要目的是創(chuàng)設(shè)無氧環(huán)境，有利于厭氧微生物生長。
（2）過程②中用適宜濃度NaCl溶液而不用無菌水進(jìn)行梯度稀釋的目的是擴(kuò)大培養(yǎng)。
（3）①M(fèi)基因抑制了其體內(nèi)纖維素酶基因表達(dá)，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)擬對某細(xì)菌內(nèi)的M基因進(jìn)行敲除，sgRNA能特異性識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白到相應(yīng)位置剪切DNA，在設(shè)計sgRNA序列時，必須事先測定M基因的兩端特定的堿基序列，從而設(shè)計一段能轉(zhuǎn)錄得到sgRNA的DNA。在sgRNA與目的基因特定堿基序列部分結(jié)合，結(jié)合區(qū)既有DNA，也有RNA，故最多含有8種核苷酸，若要將M基因從目標(biāo)DNA上剪切下來，需要有兩個切口，而sgRNA的識別具有特異性，故需要2種sgRNA。
②將基因?qū)胛⑸锛?xì)胞，常使用CaCl2處理，使其成為感受態(tài)，所以將sgRNA基因和Cas9蛋白基因?qū)敫惺軕B(tài)目標(biāo)細(xì)菌，一旦細(xì)胞中同時含有sgRNA和Cas9，Cas9就會與sgRNA結(jié)合在一起并在sgRNA的帶領(lǐng)下，來到能夠與sgRNA堿基互補(bǔ)配對的目的基因處，特異性地切割M基因。
③將CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因重組載體成功轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)菌后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組纖維素酶的表達(dá)量如圖所示，由此得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是M基因?qū)ζ潴w內(nèi)纖維素酶基因起抑制表達(dá)作用，判斷依據(jù)是敲除細(xì)胞株中纖維素酶表達(dá)量明顯比對照組高。
3．（2024·浙江紹興·模擬預(yù)測）A型塞內(nèi)卡病毒(SVA)會導(dǎo)致豬患水皰傳染病，癥狀與豬口蹄疫等傳染病非常相似，增加了臨床鑒別診斷的難度。VP1蛋白是SVA核衣殼的主要成分，可作為SVA診斷的靶蛋白。研究人員嘗試制備抗VP1蛋白單克隆抗體，以便快速、準(zhǔn)確檢測SVA病毒。回答下列問題：
(一)基因工程抗原的制備
(1)提取病毒RNA，經(jīng) 形成cDNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的VP1蛋白基因序列，設(shè)計一對特異性引物，在引物的 (5’或3’)端引入限制酶BamHⅠ和XhI的識別序列，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。考慮一個模板DNA分子的擴(kuò)增，PCR第四次循環(huán)時，需要消耗對引物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分析正確后，通常還需進(jìn)行序列測定，原因是。
(2)將回收后的VP1基因片段及pET-28a載體經(jīng)酶切和連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，接種至LB固體培養(yǎng)基。37℃恒溫箱培養(yǎng)，挑取至LB液體培養(yǎng)基，置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株。擴(kuò)增成功轉(zhuǎn)化的菌株，最后經(jīng) 后收集菌體沉淀，并細(xì)菌，純化得到VP1蛋白。
(二)抗VP1蛋白單克隆抗體的制備
(3)用純化的VPl蛋白多次免疫小鼠，然后誘導(dǎo)小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合，推測SP2/0細(xì)胞的生長特點(diǎn)是。常用方法有PEG融合法、電融合法和。通過選擇培養(yǎng)的方法篩選出雜交瘤細(xì)胞，再經(jīng)過96孔板培養(yǎng)和抗體檢測篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。將篩選到的2個雜交瘤細(xì)胞株分別注射到小鼠腹腔中，從腹水中成功提取得到了2種鼠源單克隆抗體—2E10和3E4。
(4)為進(jìn)一步確定2E10和3E4在VP1蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，將VP1蛋白截為4段(VP1-1~VP1-4)，電泳后分別用2E10和3E4為探針進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可判斷2E10和3E4與VP1的結(jié)合位點(diǎn)是 (填“相同”或“不同”)的，依據(jù)是。
【答案】(1) 逆轉(zhuǎn)錄 5’ 8 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測 DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列
(2) 單菌落離心破碎
(3) 體外無限增殖滅活病毒誘導(dǎo)法克隆
(4) 不同 2E10僅與 VP1-1結(jié)合，而3E4僅與VP1-3結(jié)合
【分析】1、基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。
2、動物細(xì)胞工程常用的技術(shù)有動物細(xì)胞培養(yǎng)、動物細(xì)胞融合和動物細(xì)胞核移植等。動物細(xì)胞培養(yǎng)是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)；動物細(xì)胞融合技術(shù)是單克隆抗體制備的重要技術(shù)
【詳解】（1）以RNA為模板合成DNA的過程叫逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物為DNA。因此，提取病毒RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。PCR過程中，子鏈的延伸方向是5’端向3’端，因此，限制酶BamHⅠ和XhI的識別序列應(yīng)設(shè)計在5’端。PCR第四次循環(huán)時以第三次循環(huán)的產(chǎn)物為模板，第三次循環(huán)結(jié)束后得到個DNA分子，每個模板DNA消耗一對引物。因此，PCR第四次循環(huán)時，需要消耗8對引物。經(jīng)擴(kuò)增得到的DNA分子經(jīng)電泳后，可以區(qū)分不同產(chǎn)物的大小但無法經(jīng)電泳結(jié)果知道堿基序列。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分析正確后，通常還需進(jìn)行序列測定。
（2）將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的子細(xì)胞群體稱為單菌落。要分離獲得含基因表達(dá)載體的菌株，要在固體培養(yǎng)基上挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。VP1基因在大腸桿菌中表達(dá)出VP1蛋白，要提取VP1蛋白，先要經(jīng)離心獲得菌體，菌體再經(jīng)破碎處理后純化得到VP1蛋白。
（3）脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合后要用于制備單克隆抗體，融合細(xì)胞要即能產(chǎn)生抗體，又能在體外無限增殖。脾細(xì)胞可以產(chǎn)生抗體，由此推測SP2/0細(xì)胞的生長特點(diǎn)是能在體外無限增殖。誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的常用方法有PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導(dǎo)法等。經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞，克隆化培養(yǎng)過程通常用96孔板。
（4）抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，結(jié)合電泳結(jié)果圖，2E10僅與VP1-1結(jié)合，而3E4僅與VP1-3結(jié)合，可判斷2E10和3E4與VP1的結(jié)合位點(diǎn)是不同的。
4．（2024·浙江紹興·模擬預(yù)測）紹興腐乳，又叫“霉豆腐”，具有酒醉醇香、細(xì)膩松酥、入口即化等特點(diǎn)，是浙江地區(qū)的傳統(tǒng)名菜。其制作的流程是：讓豆腐表面長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制。腐乳味道鮮美的主要原因是微生物產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶等將豆腐中的蛋白質(zhì)和脂肪等分解成小分子的肽、氨基酸、脂肪酸等，其中的氨基酸與鈉鹽作用形成氨基酸鈉（其中的谷氨酸鈉是味精的主要成分）。研究人員欲從自然發(fā)酵的傳統(tǒng)“霉豆腐”中篩選出新的毛霉菌株以進(jìn)一步改良風(fēng)味。
(1)腐乳發(fā)酵過程中所用的毛霉菌株是一種菌。腌制完成后需要加鹵湯裝瓶，鹵湯中酒精的含量一般控制在12%左右，從發(fā)酵角度分析主要原因是酒精含量過高，導(dǎo)致；過低，導(dǎo)致雜菌生長，引起變質(zhì)。
(2)酪素培養(yǎng)基的原理是在培養(yǎng)基中添加酪素，如果菌株能產(chǎn)生蛋白酶并分泌到胞外，則能將酪素降解形成透明圈，從培養(yǎng)基的用途上分，該培養(yǎng)基屬于（填“選擇”或“鑒別”）培養(yǎng)基。Hc值是透明圈直徑與菌落直徑的比值，據(jù)Hc值初步篩選出三種具有高蛋白酶活力的菌株編號為M2、M3、M4，原人工接種發(fā)酵工藝所用的毛霉菌株編號為M1。將各組毛霉孢子以1：1的比例兩兩混合，接種于豆腐小塊表面，分別以接種為對照，培養(yǎng)后測定各組蛋白酶活力和脂肪酶活力如圖1所示（柱狀圖上的誤差線“I”代表數(shù)據(jù)的波動范圍）。根據(jù)下圖1數(shù)據(jù)，最優(yōu)的毛霉菌株組合是。
(3)根據(jù)以上研究，研究者想通過以下細(xì)胞工程的方案獲得M2M3雜種菌株，以期獲得優(yōu)質(zhì)毛霉菌株。
處理③過程可選擇、離心等物理方法，也可選擇合適的化學(xué)方法；在此處理前需要先對原生質(zhì)體2和3進(jìn)行。在獲得雜種毛霉后，往往還需要經(jīng)過和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用細(xì)胞工程得到的雜種毛霉并沒有達(dá)到預(yù)期的效果，其原因可能之一是。
(4)另一研究小組想通過改造M4菌株形成新的單菌株毛霉發(fā)酵工藝，圖3為M4菌株改造的基本思路。
圖3的流程是利用工程對毛霉進(jìn)行改造，A是指活力更高的（蛋白質(zhì)）。
若圖4為目的基因的部分序列：
現(xiàn)需要在目的基因上游添加EcRⅠ識別序列（5'-G↓AATTC-3'），下游添加BamHⅠ識別序列（5’-G↓GATCC-3'）以便與載體正確鏈接，利用PCR擴(kuò)增目的基因應(yīng)選擇的一對引物是。
【答案】(1) 真毛霉菌死亡，腐乳發(fā)酵時間延長或失敗
(2) 鑒別單一毛霉孢子/單獨(dú)接種M1、M2、M3和M4毛霉孢子的豆腐 M2M3
(3) 電融合活力鑒定分離純化染色體丟失或基因選擇性表達(dá)
(4) 蛋白質(zhì)/第二代基因蛋白酶或脂肪酶 A
【分析】1、制作腐乳的主要微生物是毛霉，毛霉是異養(yǎng)需氧型真菌，孢子生殖。毛霉能產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，脂肪在脂肪酶的作用下被分解生成脂肪酸和甘油，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解生成小分子肽和氨基酸。
2、蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。它是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是涉及多學(xué)科的綜合科技工程。
【詳解】（1）毛霉是異養(yǎng)需氧型真菌。酒精對細(xì)胞生長有抑制作用，所以鹵湯中的酒精含量不能過高，否則會到導(dǎo)致毛霉菌死亡，腐乳發(fā)酵時間延長或?qū)е赂橹谱魇　?br>（2）微生物產(chǎn)生蛋白酶并分泌到胞外后，能將酪素培養(yǎng)基中的酪素降解后形成透明圈，所以在酪素培養(yǎng)基上生長，且菌落周圍有透明圈的微生物，就是能產(chǎn)生蛋白酶并分泌到胞外的微生物，酪素培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基。根據(jù)圖1，接種的菌種有單一毛霉孢子M1、M2、M3、M4，也有各組毛霉孢子以1：1的比例兩兩混合的菌種，本實(shí)驗(yàn)以各組毛霉孢子以1：1的比例兩兩混合、接種于豆腐小塊表面的為實(shí)驗(yàn)組，接種單一毛霉孢子M1、M2、M3和M4的豆腐小塊為對照組，培養(yǎng)后測定各組蛋白酶活力和脂肪酶活力。根據(jù)下圖1數(shù)據(jù)，M2M3組蛋白酶和脂肪酶的活力均較高，是本實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的毛霉菌株組合。
（3）處理③過程為誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，常用的物理方法有：電融合法、離心法；也可選擇合適的化學(xué)方法如PEG誘導(dǎo)法。在誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合前，需要對原生質(zhì)體進(jìn)行活力鑒定。由于原生質(zhì)體融合是隨機(jī)的且達(dá)不到100%，所以在獲得雜種毛霉后，往往還需要經(jīng)過分離、純化和鑒定。若用細(xì)胞工程得到的雜種毛霉沒有達(dá)到預(yù)期的效果，其原因可能是融合后部分染色體丟失，或者是基因選擇性表達(dá)導(dǎo)致的。
（4）圖3的流程從預(yù)期M4菌株的功能出發(fā)→預(yù)期的蛋白質(zhì)A功能→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→構(gòu)建表達(dá)載體→改造M4菌株形成新的單菌株毛霉→獲得預(yù)期產(chǎn)品，這屬于蛋白質(zhì)工程的范疇，蛋白質(zhì)工程又稱為第二代基因工程。改造M4菌株目的是為了獲得活力更高的蛋白酶和脂肪酶，以更好的進(jìn)行腐乳制作，所以A是指活力更高的蛋白酶或脂肪酶。PCR擴(kuò)增時，引物與DNA模板的3’端結(jié)合，使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸；若要在目的基因兩端添加限制酶識別序列，可在設(shè)計引物時在引物的5'端加入相應(yīng)限制酶的識別序列。圖4中目的基因模板鏈的3'端應(yīng)與啟動子相連，是目的基因的上游，模板鏈的5'端應(yīng)與終止子相連，是目的基因的下游，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，上游引物與模板鏈的3'端互補(bǔ)，且引物的5'端含有EcRⅠ識別序列，為5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3'；下游引物與編碼鏈的3'端互補(bǔ)，且引物的5'端含有BamHⅠ識別序列，為5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3'，故選A。
5．（2024·浙江紹興·模擬預(yù)測）葉酸是生物體內(nèi)極其重要的維生素，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，部分植物和微生物可以合成葉酸，人類則需額外補(bǔ)充。GCHI和ADCS是葉酸合成途徑中兩種重要的酶。研究人員通過RACE技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄因子APBP2基因，并將其在糧食作物小麥中過量表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小麥中葉酸量顯著提高，人類有望通過食用面包補(bǔ)充部分葉酸?；卮鹣铝袉栴}：
(1)RACE技術(shù)是一種基于PCR技術(shù)利用低含量的mRNA快速擴(kuò)增DNA的有效方法，通過此技術(shù)獲取大量APBP2基因需經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和兩個基本過程，這兩個過程需要逆轉(zhuǎn)錄和酶。
(2)PCR的產(chǎn)物可通過凝膠電泳鑒定，由于APBP2基因在電泳緩沖液中帶電，電泳時加樣孔一端應(yīng)該靠近極。電泳結(jié)果如圖甲，其中1號泳道是DNAMarker的電泳結(jié)果，DNAMarker是一組已知長度和的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段混合物，2號泳道是以為材料做的陽性對照組，3號泳道為實(shí)驗(yàn)組。含有APBP2基因條帶的凝膠可以用刀片切割下來，回收凝膠中的DNA片段，從而達(dá)到目的。

(3)為提高轉(zhuǎn)錄因子APBP2的表達(dá)量，研究人員構(gòu)建了攜帶特異性強(qiáng)啟動子的APBP2基因表達(dá)載體，如圖乙。強(qiáng)啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，能被識別并結(jié)合，驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄，該特異性啟動子能使APBP2基因在小麥植株的部位表達(dá)。
(4)將含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和小麥愈傷組織混合培養(yǎng)一段時間，經(jīng)過后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入進(jìn)行篩選，此物質(zhì)能抑制葉綠體和線粒體中蛋白質(zhì)的合成，從而引起植物細(xì)胞死亡。愈傷組織是一種相對沒有的薄壁細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細(xì)胞可以發(fā)育成，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小麥株系。
(5)在小麥內(nèi)過量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子APBP2可提高小麥葉酸量，推測APBP2基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的作用可能是。
【答案】(1) DNA復(fù)制 TaqDNA聚合酶
(2) 負(fù) 負(fù) 含量 (提純的)APBP2基因片段提純
(3) RNA聚合酶種子(胚乳)
(4) 去菌 G418 分化胚狀體
(5)增強(qiáng)GCHI和ADCS等基因的表達(dá)，促進(jìn)葉酸合成
【分析】由題意可知，GCHI和ADCS是葉酸合成途徑中兩種重要的酶，在在小麥內(nèi)過量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子APBP2可提高小麥葉酸量，水命APBP2基因過量表達(dá)可能增強(qiáng)GCHI和ADCS等基因的表達(dá)，促進(jìn)葉酸合成。
【詳解】（1）由題意可知，該技術(shù)用低含量的mRNA快速擴(kuò)增DNA，理論上需經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和（DNA）復(fù)制兩個基本過程。逆轉(zhuǎn)錄需要逆轉(zhuǎn)錄酶催化，PCR（實(shí)質(zhì)是體外DNA復(fù)制）需要TaqDNA聚合酶催化。
（2）在電泳緩沖液會使APBP2基因帶負(fù)電，PCR擴(kuò)增結(jié)束后需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，常采用電泳的方法，將裝有凝膠的膠托從膠盒中取出，放入電泳槽內(nèi)，加樣孔一端朝向負(fù)極。DNAMarker是一組已知長度和含量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段混合物，為陰性對照組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目芍?號泳道是以提純的APBP2基因片段為材料做的陽性對照組，3號泳道為實(shí)驗(yàn)組，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，經(jīng)PCR后獲得了APBP2基因片段。含有APBP2基因條帶的凝膠可以用刀片切割下來，回收凝膠中的DNA片段，從而達(dá)到提純目的。
（3）啟動子能被RNA聚合酶識別并結(jié)合，驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄，由題意可知，APBP2基因在小麥中過量表達(dá)，人類有望通過食用面包（其食材來源于植株的種子部分）補(bǔ)充部分葉酸，說明該特異性啟動子能使APBP2基因在小麥植株的種子部分表達(dá)。
（4）將含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和小麥愈傷組織混合培養(yǎng)一段時間，經(jīng)過去除農(nóng)桿菌后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，由圖可知，重組質(zhì)粒中含有G418抗性基因，所以在培養(yǎng)基中加入G418進(jìn)行篩選，此物質(zhì)能抑制葉綠體和線粒體中蛋白質(zhì)的合成，從而引起植物細(xì)胞死亡。愈傷組織是一種相對沒有分化的薄壁細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)誘導(dǎo)分化，愈傷組織可發(fā)育成胚狀體，再發(fā)育為轉(zhuǎn)基因植株。
（5）由題意可知，GCHI和ADCS是葉酸合成途徑中兩種重要的酶，在在小麥內(nèi)過量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子APBP2可提高小麥葉酸量，推測APBP2基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的作用可能是增強(qiáng)GCHI和ADCS等基因的表達(dá)，促進(jìn)葉酸合成。
6．（2024·浙江·模擬預(yù)測）CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是由Cas9蛋白和向?qū)NA構(gòu)成的復(fù)合體，可利用向?qū)NA識別并結(jié)合特定DNA序列，引導(dǎo)Cas9蛋白對目標(biāo)DNA進(jìn)行編輯，其過程如下圖所示。利用該系統(tǒng)對某種野生食用真菌進(jìn)行了DNA編輯，培育出轉(zhuǎn)基因真菌。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的相關(guān)基因能否成功轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞是遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的重要前提。
(1)將真菌細(xì)胞置于一定濃度的PEG溶液中，一段時間后再與重組DNA混合可以提高轉(zhuǎn)化效率，其中PEG的作用是。在轉(zhuǎn)基因真菌的培育中，一般以原生質(zhì)體為主，極少嘗試菌絲體和孢子，說明遺傳轉(zhuǎn)化體系中的選擇是制約轉(zhuǎn)化效率的另一重要因素。
(2)野生型核基因組中含有pyrg、ura3基因，這兩類基因表達(dá)可產(chǎn)生乳清核苷-5’-磷酸脫羧酶，參與催化尿嘧啶的合成，通過CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中的向?qū)NA與基因中的序列進(jìn)行，將Cas9蛋白帶到靶基因附近并對基因進(jìn)行剪切。當(dāng)目標(biāo)基因序列被破壞后，菌體表現(xiàn)為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷，只能在含有和5-氟乳清酸的培養(yǎng)基上正常生長，利用這種選擇作用可以初步區(qū)分出野生型真菌及完成了轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因品系。研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中的向?qū)NA序列長度應(yīng)當(dāng)適中否則極易脫靶即難以精準(zhǔn)找到目標(biāo)DNA序列，脫靶最可能的原因是。
(3)Cas9蛋白和向?qū)NA基因在真菌細(xì)胞中表達(dá)水平低，可通過在基因一端添加合適的來構(gòu)建高表達(dá)基因編輯系統(tǒng)，還可以通過基因優(yōu)化，使其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中含有真菌細(xì)胞高頻使用，以此來提高翻譯效率。
(4)該食用菌是某種逆轉(zhuǎn)錄病毒的特定宿主，侵染時，病毒將（填物質(zhì)）注入食用菌細(xì)胞合成雙鏈DNA片段，說明注入的酶可能具有①以病毒核酸為模板，催化鍵的形成、②解開的作用。這些功能的實(shí)現(xiàn)由酶分子相應(yīng)的結(jié)構(gòu)區(qū)域完成，體現(xiàn)了酶的以及酶功能的復(fù)雜性。食用菌細(xì)胞中合成的這些DNA片段通過進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并（選填“隨機(jī)”或者“定向”）整合到食用菌的核基因組中，使其發(fā)生（填變異類型），進(jìn)而引發(fā)食用菌減產(chǎn)。
(5)某些食用菌具有天然抗擊該種逆轉(zhuǎn)錄病毒的能力，有同學(xué)指出，可能是因?yàn)檫@些食用菌中含有限制性內(nèi)切核酸酶切割了病毒核酸，你認(rèn)為這種推測合理嗎？，請說明原因。
【答案】(1) 增加細(xì)胞膜的通透性受體細(xì)胞
(2) pyrg、ura3 互補(bǔ)（或特異性識別并結(jié)合）尿嘧啶其他基因序列中也有與向?qū)NA互補(bǔ)配對的序列，造成向?qū)NA錯誤結(jié)合到有關(guān)基因區(qū)域
(3) 啟動子密碼子
(4) 病毒RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶磷酸二酯 DNA與RNA雜交片段中氫鍵酶的專一性核孔隨機(jī) 基因重組
(5) 不合理因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，而限制酶只能識別DNA中的特定堿基序列
【分析】根據(jù)題意分析可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)，是利用該基因表達(dá)系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA能識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實(shí)現(xiàn)對靶基因序列的編輯。由于其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)配對的序列，造成引導(dǎo)RNA錯誤結(jié)合而出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。
【詳解】（1）將真菌細(xì)胞置于一定濃度的PEG溶液中，一段時間后再與重組DNA混合可以提高轉(zhuǎn)化效率，其中PEG的作用是增加細(xì)胞膜的通透性。在轉(zhuǎn)基因真菌的培育中，一般以原生質(zhì)體為主，極少嘗試菌絲體和孢子，說明遺傳轉(zhuǎn)化體系中受體細(xì)胞的選擇是制約轉(zhuǎn)化效率的另一重要因素。
（2）基因編輯系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA能識別并通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合特定的DNA序列，野生型核基因組中含有pyrg、ura3基因，這兩類基因表達(dá)可產(chǎn)生乳清核苷-5’-磷酸脫羧酶，參與催化尿嘧啶的合成，通過CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中的向?qū)NA與pyrg、ura3基因中的序列進(jìn)行互補(bǔ)（或特異性識別并結(jié)合），將Cas9蛋白帶到靶基因附近并對基因進(jìn)行剪切。當(dāng)目標(biāo)基因序列被破壞后，菌體表現(xiàn)為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷，所以只能在含有尿嘧啶和5-氟乳清酸的培養(yǎng)基上正常生長，利用這種選擇作用可以初步區(qū)分出野生型真菌及完成了轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因品系。研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中的向?qū)NA序列長度應(yīng)當(dāng)適中否則極易脫靶即難以精準(zhǔn)找到目標(biāo)DNA序列，脫靶最可能的原因是其他基因序列中也有與向?qū)NA互補(bǔ)配對的序列，造成向?qū)NA錯誤結(jié)合到有關(guān)基因區(qū)域。
（3）Cas9蛋白和向?qū)NA基因在真菌細(xì)胞中表達(dá)水平低，啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn)，起始轉(zhuǎn)錄，所以可通過在基因一端添加合適的啟動子來構(gòu)建高表達(dá)基因編輯系統(tǒng)，還可以通過基因優(yōu)化，使其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中含有真菌細(xì)胞高頻使用密碼子，以此來提高翻譯效率。
（4）該食用菌是某種逆轉(zhuǎn)錄病毒的特定宿主，侵染時，病毒將病毒RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶注入食用菌細(xì)胞合成雙鏈DNA片段，說明注入的酶可能具有①以病毒核酸為模板，催化磷酸二酯鍵的形成、②解開DNA與RNA雜交片段中氫鍵的作用。這些功能的實(shí)現(xiàn)由酶分子相應(yīng)的結(jié)構(gòu)區(qū)域完成，體現(xiàn)了酶的專一性以及酶功能的復(fù)雜性。食用菌細(xì)胞中合成的這些DNA片段通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并隨機(jī)整合到食用菌的核基因組中，使其發(fā)生基因重組，進(jìn)而引發(fā)食用菌減產(chǎn)。
（5）某些食用菌具有天然抗擊該種逆轉(zhuǎn)錄病毒的能力，有同學(xué)指出，可能是因?yàn)檫@些食用菌中含有限制性內(nèi)切核酸酶切割了病毒核酸，這種推測不合理，原因是因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，而限制酶只能識別DNA中的特定堿基序列。
7．（2024·浙江·三模）天冬氨酸激酶（AK）和二氫吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）是玉米賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶。野生型玉米賴氨酸含量很低，科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)將天冬氨酸激酶第352位蘇氨酸替換為異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶第104位天冬酰胺替換為異亮氨酸，顯著提高兩種酶的活性，使玉米中賴氨酸含量提高數(shù)倍?；卮鹣铝袉栴}：
(1)將天冬氨酸激酶基因模板鏈中的單個堿基替換為，可得到改造后的基因（蘇氨酸的密碼子為ACU、ACC、ACA、ACG，異亮氨酸的密碼子為AUU、AUC、AUA）。將改造后的基因?qū)胗衩准?xì)胞中，使玉米獲得高活性天冬氨酸激酶。用（寫出1點(diǎn)即可）等物理或化學(xué)因素處理玉米種子也可能得到類似結(jié)果，但該育種方式具有一定的盲目性，因?yàn)榛蛲蛔兙哂? 的特點(diǎn)。
(2)將改造后的AK基因（記為基因A）和改造后的DHDPS基因（記為基因D）導(dǎo)入玉米細(xì)胞，經(jīng)組培獲得高賴氨酸含量的植株甲、乙、丙，已知三個植株中的每個細(xì)胞中僅導(dǎo)入一個基因A和1個基因D。讓植株甲、乙、丙分別自交，所得子代表型及比例如下：
（注：不考慮基突變和交叉互換）
①植株甲的子代中，低賴氨酸含量植株基因型有種，高賴氨酸含量植株中純合子占。
②為快速獲得穩(wěn)定遺傳的高賴氨酸含量玉米，應(yīng)取植株（“乙”或“丙”）的置于適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對全部幼苗進(jìn)行染色體加倍處理，最終所得純合植株中高賴氨酸含量個體占。
③若植株乙和植株丙進(jìn)行雜交，所得子代表型及比例為。
(3)分別提取野生型玉米和第（2）小題中植株甲的DNA，用下圖所示引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制酶A充分切割擴(kuò)增產(chǎn)物，之后進(jìn)行凝膠電泳，已知圖乙泳道1對應(yīng)野生型玉米，請在圖乙泳道2中畫出植株甲對應(yīng)的結(jié)果。

【答案】(1) G A 射線X射線/γ射線/紫外線/激光/溫度劇變/亞硝酸/堿基類似物/硫酸二乙酯/苯/石棉/砷化物等（注：不能寫生物因素）多方向性/不定向性
(2) 5 1/9 乙花藥/花粉 1/2 高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=1：1
(3)
【分析】蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。也就是說，蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程領(lǐng)域。
【詳解】（1）蘇氨酸的密碼子為ACU、ACC、ACA、ACG，異亮氨酸的密碼子為AUU、AUC、AUA，蘇氨酸替換為異亮氨酸，且只替換一個堿基，蘇氨酸的密碼子可寫為ACU（C、A），異亮氨酸的密碼子可寫為AUU（C、A），故只用替換中間的堿基就可以，蘇氨酸對應(yīng)模板鏈的堿基為TGA（G、T），異亮氨酸對應(yīng)模板鏈的堿基為TAA（G、T），故將天冬氨酸激酶基因模板鏈中的單個堿基G替換為A，改造后得到基因。將改造后的基因?qū)胗衩准?xì)胞中，使玉米獲得高活性天冬氨酸激酶。用射線X射線/γ射線/紫外線/激光/溫度劇變/亞硝酸/堿基類似物/硫酸二乙酯/苯/石棉/砷化物等等物理或化學(xué)因素處理玉米種子也可能得到類似結(jié)果，但該育種方式具有一定的盲目性，因?yàn)榛蛲蛔兙哂卸喾较蛐?不定向性的特點(diǎn)。
（2）若將沒有A、D的染色體上的基因表示為a、d
①甲自交子代中高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=9：7，說明甲中A、D基因位于非同源染色體上，獨(dú)立遺傳，遵循基因的自由組合定律，則植株甲的基因型為AaDd,子代中高賴氨酸含量的基因型為A-D-，低賴氨酸含量的基因型為AAdd，Aadd、aaDD、aaDd、,aadd共5種，高賴氨酸含量中只有AADD一種純合子，純合子植株占1/9。
②乙自交子代中高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=3：1，由此可推斷出乙中A、D位于一對同源染色體上，且A、D在一條染色體，a、d在一條染色體；丙自交子代中高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=1：1，由此可推斷出乙中A、D位于一對同源染色體上，且A、d在一條染色體，a、D在一條染色體，為快速獲得穩(wěn)定遺傳的高賴氨酸含量玉米，應(yīng)取植株乙的花藥/花粉置于適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對全部幼苗進(jìn)行染色體加倍處理，乙的花粉的類型為AD、ad=1:1,故最終所得純合植株中高賴氨酸含量個體占1/2。
③乙自交子代中高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=3：1，由此可推斷出乙中A、D位于一對同源染色體上，且A、D在一條染色體，a、d在一條染色體；丙自交子代中高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=1：1，由此可推斷出乙中A、D位于一對同源染色體上，且A、d在一條染色體，a、D在一條染色體，植株乙產(chǎn)生的配子為AD：ad=1:1，植株丙產(chǎn)生的配子為Ad:aD=1:1，子代為AaDD（高賴氨酸含量）：aaDd（低賴氨酸含量）：AADd（高賴氨酸含量）：Aadd（低賴氨酸含量）=1:1:1:1，故后代的表型及比例為高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=1：1。
（3）若將沒有A、D的染色體上的基因表示為a、d，甲自交子代中高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=9：7，說明甲中A、D基因位于非同源染色體上，獨(dú)立遺傳，遵循基因的自由組合定律，則植株甲的基因型為AaDd,本小題，只針對DHDPS基因，故甲的基因型為Dd，對甲植株的DNA，用下圖所示引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制酶A充分切割擴(kuò)增產(chǎn)物，之后進(jìn)行凝膠電泳，已知圖乙泳道1對應(yīng)野生型玉米，植株甲中有d基因故有一條與野生型玉米一樣的條帶，限制酶A的位點(diǎn)位于基因的中間將D基因進(jìn)行了切割產(chǎn)生了小片段，故遷移的速度要快，出現(xiàn)另外兩條遷移速度不同的條帶，且比野生型的遷移速度快。
8．（2024·浙江紹興·模擬預(yù)測）果蔬生產(chǎn)過程中，農(nóng)藥、化肥、土壤微生物等均可產(chǎn)生NO（一氧化氮），NO作為一種氣體信號分子對植物的生命活動產(chǎn)生一定影響；NO同時也是重要的環(huán)境響應(yīng)因子，在植物的抗逆境生理中發(fā)揮重要作用。某研究小組為探究NO對某果蔬植株光合作用強(qiáng)度的影響進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中用SNP（硝普鈉）作為NO的供體?；卮鹣铝袉栴}。
(1)實(shí)驗(yàn)中測定了葉片的NO含量、葉綠素和類胡蘿卜素含量、氣孔導(dǎo)度，結(jié)果如圖1。測定色素含量時，需用提取色素并測定含量。提取液中的葉綠素主要吸收光。相較于甲組，推測乙組葉片的光合作用強(qiáng)度較弱，依據(jù)是。
(2)進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子（HY5）基因敲除的植株葉綠素含量下降。PORC基因是葉綠素合成的關(guān)鍵基因，推測HY5蛋白可直接結(jié)合PORC基因的啟動子調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。為研究HY5基因與PORC基因的關(guān)系，研究者利用亮氨酸合成缺陷型酵母菌進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，其操作步驟如下。
①先將載體1導(dǎo)入亮氨酸缺陷型酵母細(xì)胞，但始終無法在添加金擔(dān)子素（AbA，一種抗生素）和亮氨酸的培養(yǎng)基上獲得重組酵母菌菌落，因此，可采過技術(shù)篩選出重組酵母細(xì)胞。
②再將載體2導(dǎo)入①步驟獲得的重組酵母細(xì)胞，接種到選擇培養(yǎng)基上，能篩選獲得如圖2所示的重組酵母細(xì)胞。關(guān)于該選擇培養(yǎng)基的配方正確是。
A．加亮氨酸和AbA B．不加亮氨酸加AbA
C．不加亮氨酸和AbA D．加亮氨酸不加AbA
③據(jù)此分析步驟①中培養(yǎng)基上無法培養(yǎng)得到菌落的原因是。
(3)已知NO不直接影響PORC基因的表達(dá)也不影響其表達(dá)產(chǎn)物的活性，綜合上述研究，闡明NO降低植物葉綠素的可能機(jī)制：葉綠素合成減少。
(4)NO作為環(huán)境響應(yīng)因子，還能通過抑制需氧呼吸中、三羧酸（TCA）循環(huán)、電子傳遞鏈途徑中關(guān)鍵酶的活性，抑制了呼吸速率，延緩了植物衰老，此功能與（植物激素）的作用相互拮抗。
【答案】(1) 有機(jī)溶劑紅光和藍(lán)紫光葉綠素和類胡蘿卜素含量較低，光反應(yīng)較弱；氣孔導(dǎo)度小影響CO2吸收，碳反應(yīng)弱
(2) PCR/核酸分子雜交和電泳 B 無HY5蛋白作用于PORC基因啟動子，導(dǎo)致AbAr基因無法表達(dá)對/金擔(dān)子素?zé)o抗性
(3)NO抑制HY5基因的表達(dá)，導(dǎo)致P0RC基因轉(zhuǎn)錄減少/PORC含量下降
(4) 糖酵解乙烯
【分析】1、葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)：①提取色素原理：色素能溶解在酒精或丙酮等有機(jī)溶劑中，所以可用無水乙醇等提取色素。②分離色素原理：各色素隨層析液在濾紙上擴(kuò)散速度不同，從而分離色素。溶解度大，擴(kuò)散速度快；溶解度小，擴(kuò)散速度慢。③各物質(zhì)作用：無水乙醇或丙酮：提取色素；層析液：分離色素；二氧化硅：使研磨得充分；碳酸鈣：防止研磨中葉綠素被破壞。④結(jié)果：濾紙條從上到下依次是：胡蘿卜素（最窄）、葉黃素、葉綠素a（最寬）、葉綠素b（第2寬），色素帶的寬窄與色素含量相關(guān)。
2、色素的作用：葉綠素主要吸收紅光和藍(lán)紫光，類胡蘿卜素主要吸收藍(lán)紫光。
【詳解】（1）色素能溶解在酒精或丙酮等有機(jī)溶劑中，所以可用無水乙醇等提取色素。葉綠素主要吸收紅光和藍(lán)紫光，類胡蘿卜素主要吸收藍(lán)紫光。根據(jù)圖示結(jié)果可知，與甲組相比，乙組葉片中光合色素含量低，抑制光反應(yīng)，氣孔導(dǎo)度變小，可以減少水分的蒸發(fā)，響應(yīng)干旱脅迫，但是會抑制二氧化碳的吸收，影響暗反應(yīng)過程，從而直接影響光合速率。
（2）①篩選出重組酵母細(xì)胞的方法是DNA分子雜交技術(shù)或PCR或電泳。
②如果H基因的表達(dá)產(chǎn)物是D基因的轉(zhuǎn)錄因子，該細(xì)胞亮氨酸缺陷型酵母細(xì)胞，因此培養(yǎng)基中不加亮氨酸，而加入AbA（金擔(dān)子素），由于H基因存在，H基因表達(dá)的產(chǎn)物啟動D基因表達(dá)，進(jìn)而使金擔(dān)子素抗性基因表達(dá)，對金擔(dān)子素表現(xiàn)出抗性而出現(xiàn)菌落，B正確。
故選B。
③先將載體1導(dǎo)入亮氨酸缺陷型酵母細(xì)胞，但始終無法在添加金擔(dān)子素和亮氨酸的培養(yǎng)基上獲得重組酵母菌菌落，這是因?yàn)橹亟M酵母菌菌落中無HY5蛋白作用于PORC基因啟動子，導(dǎo)致AbAr基因無法表達(dá)，對金擔(dān)子素?zé)o抗性。
（3）NO不直接影響PORC基因的表達(dá)也不影響其表達(dá)產(chǎn)物的活性，但NO可能會抑制HY5基因的表達(dá)，導(dǎo)致PORC基因轉(zhuǎn)錄減少，使PORC含量下降，這可能是NO降低植物葉綠素的可能機(jī)制。
（4）糖酵解是需氧呼吸的第一階段，NO通過抑制需氧呼吸中糖酵解、三羧酸（TCA）循環(huán)、電子傳遞鏈途徑中關(guān)鍵酶的活性，抑制了呼吸速率。乙烯主要作用是促進(jìn)果實(shí)成熟，促進(jìn)老葉等器官脫落的作用，NO能夠延緩植物衰老，此功能與乙烯的作用相互拮抗。
9．（2024·浙江杭州·模擬預(yù)測）為使甘藍(lán)具有抗除草能力，科研人員將除草劑草甘膦抗性基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)植株，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。（見圖1，注：BamHI識別的序列是G↓GATCC；BgⅢ識別的序列是A↓GATCT，EcRI識別的序列是C↓AATTC）

(1)利用PCR擴(kuò)增草甘膦抗性基因時，需要在引物的（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶識別序列，若產(chǎn)物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，原因可能是（答2條）。
(2)構(gòu)建表達(dá)載體時切割質(zhì)粒應(yīng)選擇酶切。酶切后的目的基因存在正向與反向兩種連接方式，可用酶對兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行剪切，再通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)分析產(chǎn)物大小進(jìn)行區(qū)分，電泳結(jié)果出現(xiàn)長度為的片段即為所需基因表達(dá)載體。
(3)步驟②將重組質(zhì)粒與經(jīng) 處理農(nóng)桿菌的混合，完成轉(zhuǎn)化后先置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其目的是。再將菌液涂布在含有抗生素的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。步驟③將農(nóng)桿菌與甘藍(lán)愈傷組織共培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基中添加以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)愈傷組織。
(4)基因芯片技術(shù)是一種能有效地對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測的新技術(shù)，通常被檢測的特定DNA序列包括兩類：一類是非目的基因序列，主要為載體上通常具有的各種組成元件；另一類則是目的基因序列本身。使用方法如下：第一步，針對待測的特定DNA片段設(shè)計引物，擴(kuò)增出的特定DNA片段帶上標(biāo)記制成探針，經(jīng)變性后通過芯片點(diǎn)樣儀固定到雜交膜上，再經(jīng)過一定的處理，便得到可用于檢測的DNA芯片（見圖2）；第二步，從待測植物中提取DNA作為模板，加入引物進(jìn)行擴(kuò)增；第三步，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過變性處理后鋪于芯片表面，放入雜交盒中，在適宜條件下進(jìn)行雜交；第四步，待反應(yīng)結(jié)束后，對芯片進(jìn)行清洗等處理，用儀器檢測芯片上的雜交結(jié)果。

利用基因芯片可檢測特定DNA序列依據(jù)的是原則。對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)進(jìn)行檢測的基因芯片的陣列設(shè)計為：第1列為空白對照，第2列固定甘藍(lán)植株的內(nèi)源基因作為陽性對照，第3列固定與甘藍(lán)DNA序列高度（填“同源”或“非同源”）的DNA片段作為陰性對照，第4~6列可分別固定、和潮霉素抗性基因進(jìn)行檢測，每列重復(fù)多次以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。若該基因芯片檢測有效，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的樣本在芯片的第列上均應(yīng)出現(xiàn)檢測信號。
(5)葉綠體轉(zhuǎn)化是植物基因工程的新熱點(diǎn)，葉綠體的諸多特點(diǎn)為葉綠體轉(zhuǎn)化提供優(yōu)勢，如葉綠體基因組小，功能清晰，使基因操作方便；葉綠體細(xì)胞具有自我復(fù)制功能，一個植物細(xì)胞可含有多個葉綠體，每個葉綠體中含有多個基因組，可大大提高；另外，葉綠體基因位于細(xì)胞質(zhì)中，可有效避免。
【答案】(1) 5'端引物較短，特異性較低，同時擴(kuò)增出目的基因和其他DNA片段；復(fù)性溫度過低，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶；雜DNA污染
(2) BamHI BamHI和EcRI 45kb
(3) CaCl2 LB液使處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)，便于篩選潮霉素
(4) 堿基互補(bǔ)配對非同源草甘膦抗性基因啟動子（或終止子） 2456
(5) 目的基因的表達(dá)量基因污染
【分析】PCR原理:在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈。
【詳解】（1）在利用PCR擴(kuò)增草甘膦抗性基因時，需要在引物的5′端添加限制酶識別序列，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物能與載體正確連接。如果產(chǎn)物中除了目的基因外還有其他DNA片段存在，可能的原因包括引物較短，特異性較低，同時擴(kuò)增出目的基因和其他DNA片段；復(fù)性溫度過低，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶；雜DNA污染。
（2）據(jù)圖表可知，BamHI酶切割得到的黏性末端為-GATC，BgⅢ酶切割得到的黏性末端為-GATC，其黏性末端相同，故剪切后的目的基因能與質(zhì)粒連接在一起，重組質(zhì)粒形成后，在重組質(zhì)粒上，不再有BgⅢ酶的識別位點(diǎn)，質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)會有EcRI酶和BamHI酶，目的基因的編碼順序是從BamHⅠ酶到BgⅢ酶，用EcRⅠ酶和BamHⅠ酶會將正向連接的目的基因片段剪切去除；正向連接的重組質(zhì)粒會被切去20+25=45kb長度的片段，反向連接的重組質(zhì)粒會被切去20kb長度的片段，根據(jù)電泳凝膠時，DNA分子量越大，在凝膠中收到的阻力越大，遷移距離越短的特點(diǎn)，故正向連接的重組質(zhì)粒被切割后兩個片段的大小介于反向連接的重組質(zhì)粒被切割后兩個片段的大小之間，所以電泳結(jié)果出現(xiàn)長度為45kb長度的片段即為所需基因表達(dá)載體。
（3）據(jù)圖分析可知，步驟②是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌的過程，需要使用CaCl2處理微生物細(xì)胞使之成為易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)。當(dāng)將重組質(zhì)粒與經(jīng)CaCl2處理農(nóng)桿菌的混合，完成轉(zhuǎn)化后先置于LB液培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)，便于篩選。由圖可知，標(biāo)記基因是潮霉素抗性基因，因此要篩選獲得含有基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌需要在培養(yǎng)基中添加潮霉素，才能篩選出含目的基因的甘藍(lán)愈傷組織。
（4）利用基因芯片可檢測特定DNA序列依據(jù)的是堿基互補(bǔ)配對原則。對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)進(jìn)行基因檢測時，需要設(shè)置不含草甘膦抗性基因的對照組，由于啟動子可調(diào)控草甘膦抗性基因的表達(dá)，故啟動子的序列也需要檢測，因此基因芯片的陣列設(shè)計為：第1列為空白對照，第2列固定甘藍(lán)植株的內(nèi)源基因作為陽性對照，第3列固定與甘藍(lán)DNA序列高度非同源的DNA片段作為陰性對照，第4~6列可分別固定草甘膦抗性基因、啟動子（或終止子、標(biāo)記基因）和潮霉素抗性基因進(jìn)行檢測，每列重復(fù)多次以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。若該基因芯片檢測有效，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的樣本在芯片的第2456列上均應(yīng)出現(xiàn)檢測信號。
（5）因每個葉綠體中含有多個基因組，可大大提高目的基因的表達(dá)量；且葉綠體基因位于細(xì)胞質(zhì)中，一般不能穩(wěn)定遺傳，因此可避免基因污染。
10．（2024·浙江·模擬預(yù)測）小麥?zhǔn)谴菩弁ㄖ参?。科研人員偶然發(fā)現(xiàn)一株高稈雄性不育小麥（甲），其雄性不育受顯性基因M控制，另有一株矮稈可育小麥（乙），株高由A、a基因控制。科研人員進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：
雜交一：甲×乙→F1矮稈雄性不育：矮稈雄性可育=1∶1
雜交二：F1中的矮稈雄性不育×高稈雄性可育（野生型）→F2矮稈雄性可育：高稈雄性不育=1：1回答下列問題：
(1)A、a基因的根本區(qū)別是，其顯性現(xiàn)象的表現(xiàn)形式是。
(2)雜交一實(shí)驗(yàn)中甲作為（父本/母本）。根據(jù)雜交一、二實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，甲和乙的基因型分別為、，兩對等位基因的遺傳（遵循/不遵循）自由組合定律。
(3)假設(shè)讓實(shí)驗(yàn)二的F2自由交配，后代中高稈雄性可育植株占。
(4)研究發(fā)現(xiàn)所有的雄性不育植株都特異性地攜帶了TRIM序列，且M及其等位基因的編碼區(qū)相同；為研究該序列與雄性不育之間的關(guān)系，科研人員在野生型小麥中獲得了M等位基因的啟動子并利用Ti質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，部分結(jié)構(gòu)如下圖所示，GFP表達(dá)后會發(fā)出綠色熒光。將載體轉(zhuǎn)入小麥幼胚，獲得轉(zhuǎn)基因植株，對植株表型和M基因表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。
a．通用的強(qiáng)啟動子b．M等位基因啟動子c．插入TRIM序列的M等位基因啟動子d．M編碼區(qū)e．M基因f．無關(guān)基因
（1）表中①處轉(zhuǎn)入的載體組成為（從a~f中選擇），②處植株表型為。
（2）在存活的轉(zhuǎn)基因小麥花藥中特異性檢測到綠色熒光。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測導(dǎo)致雄性不育的原因是。
【答案】(1) 堿基序列不同完全顯性
(2) 母本 aaMm AAmm 不遵循
(3)1/4
(4) cd 雄性不育 TRIM插入引起啟動子序列改變，導(dǎo)致M基因在花藥發(fā)育的早期表達(dá)
【分析】據(jù)題干信息分析，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯縏RIM序列與雄性不育之間的關(guān)系，自變量是野生型小麥?zhǔn)欠駭y帶有TRIM序列，檢測指標(biāo)是植株的表型（雄性是否不育）以及M基因的表達(dá)情況。
【詳解】（1）A、a為等位基因，等位基因的區(qū)別在于堿基的排列順序不同。株高由A、a基因控制，只有高桿和矮桿性狀，說明A對a為完全顯性。
（2）甲為高稈雄性不育，只能作為母本。高桿和矮桿雜交后代都是矮桿，則矮桿為顯性，因此甲的基因型是aaMm，乙的基因型為AAmm。雜交二中親本的基因型為AaMm×aamm，后代的表現(xiàn)型及比例為1:1，沒有表現(xiàn)出1:1:1:1，說明兩對等位基因位于同源染色體上，A與m基因連鎖，兩對等位基因不遵循基因的自由組合定律。
（3）實(shí)驗(yàn)二的F2的基因型及比例為Aamm：aaMm=1:1，自由交配產(chǎn)生的雌配子及比例為Am：am：aM=1：2：1，產(chǎn)生的雄配子及比例為Am：am=1:1，則后代中高稈雄性可育植株（aamm）占1/2×1/2=1/4。
（4）本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯縏RIM序列與雄性不育之間的關(guān)系，因此野生型小麥需要選擇插入TRIM序列的M等位基因啟動子，即c，TRIM序列的M等位基因啟動子的作用是啟動M基因的表達(dá)的，因此在構(gòu)建載體組成I、Ⅱ時需要在插入TRIM序列的M等位基因啟動子之后加入M編碼區(qū)，故表中①處應(yīng)分別選擇c、d。已知所有的雄性不育植株都特異性地攜帶了TRIM序列，且第一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果和第四組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中M基因表達(dá)情況是相同的，因此②處植株表型是雄性不育。第二組實(shí)驗(yàn)野生型小麥M基因在花藥發(fā)育各時期均不表達(dá)，在根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá)，而第四組和第一組雄性不育植株中M基因僅在花藥發(fā)育早期表達(dá)，在根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá)，綜上推測導(dǎo)致雄性不育的原因是TRIM序列的插入引起啟動子序列改變，導(dǎo)致M基因在花藥發(fā)育早期表達(dá)。
11．（2024·浙江·三模）干旱脅迫會引起植物細(xì)胞內(nèi)重要生理代謝途徑紊亂，如細(xì)胞呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)軗p、光反應(yīng)中電子散逸，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）積累等，因此干旱脅迫下ROS對膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等的氧化損傷是植物損傷的重要方式。Ln1蛋白具有降低葉綠體和線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生，維護(hù)細(xì)胞正常代謝的功能。某研究團(tuán)隊以耐干旱脅迫突出的“夏普藍(lán)”藍(lán)莓為材料，構(gòu)建了如下圖所示表達(dá)載體，導(dǎo)入煙草后以研究Ln1蛋白在植物應(yīng)對干旱脅迫時的相關(guān)功能?；卮鹣铝袉栴}：
注：1.KpnⅠ和SmaⅠ為限制酶，CaMV35S表示啟動子，Ln1為目的基因。2.Gus基因表達(dá)產(chǎn)物能催化無色X-Gluc生成藍(lán)色物質(zhì)，植物無此基因。3.左右邊界之間的區(qū)段表示T-DNA片段。
(1)獲取目的基因及構(gòu)建重組表達(dá)載體。通過檢索基因數(shù)據(jù)庫，獲得藍(lán)莓，以此設(shè)計引物并在引物的5’端添加。由圖可知，SmaⅠ識別位點(diǎn)位于目的基因模板鏈的端。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳技術(shù)分離后將含有切割下來以便回收并提純。
(2)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞及培育轉(zhuǎn)基因植株。使用的外植體是帶有傷口的葉圓片，將重組的農(nóng)桿菌和葉圓片共培養(yǎng)一段時間，該過程需控制好（答兩點(diǎn)）和pH、溫度等環(huán)境條件，以保證外植體的存活率和轉(zhuǎn)化率均較高。將共培養(yǎng)后的葉圓片轉(zhuǎn)入添加適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，目的是。培養(yǎng)基中還含有（答兩點(diǎn)）等有機(jī)成分及植物生長調(diào)節(jié)劑來調(diào)控葉圓片細(xì)胞脫分化、再分化過程，從而得到轉(zhuǎn)基因煙草植株。
(3)篩選轉(zhuǎn)基因煙草植株及耐旱特性觀察鑒定。選取轉(zhuǎn)基因煙草葉片，將其置于含的鑒別培養(yǎng)基中染色，若葉片出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)即為轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)化成功。染色前需對葉片進(jìn)行處理，以防對結(jié)果產(chǎn)生干擾。將轉(zhuǎn)基因煙草葉片，一組置于添加10% PEG的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另一組置于未添加PEG的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。添加10% PEG的作用是。另取野生型煙草葉片作為對照。
(4)電鏡下顯示正常培養(yǎng)的煙草細(xì)胞葉綠體、線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。添加PEG的野生型煙草細(xì)胞出現(xiàn)葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)模糊，線粒體變形嵴斷裂等現(xiàn)象，而添加PEG的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞未出現(xiàn)上述現(xiàn)象；檢測各組植株葉綠素相對含量，結(jié)果如下圖。推測干旱脅迫下Ln1蛋白可能是通過，來維護(hù)光合作用的正常進(jìn)行，從而抵御干旱。
【答案】(1) Ln1基因序列相應(yīng)的限制酶識別序列 3’ 目的基因條帶的凝膠
(2) 農(nóng)桿菌的濃度、共培養(yǎng)的時間等殺死農(nóng)桿菌并篩選含有目的基因的植物細(xì)胞糖類、氨基酸、維生素等
(3) X-Gluc 脫色模擬干旱環(huán)境/提供干旱脅迫環(huán)境
(4)穩(wěn)定葉綠體基粒片層的結(jié)構(gòu)/減少對葉綠體基粒結(jié)構(gòu)的破壞、維持葉綠素含量/減緩葉綠素含量下降
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】（1）結(jié)合題干可知，基因工程需要導(dǎo)入的目的基因?yàn)樗{(lán)莓的Ln1基因序列，以此設(shè)計引物并在引物的5’端添加相應(yīng)的限制酶識別序列，使得目的基因和載體能從產(chǎn)生相同的黏性末端進(jìn)行互補(bǔ)配對。轉(zhuǎn)錄的方向是從啟動子到終止子，結(jié)合題圖中限制酶識別序列的順序可知SmaⅠ識別位點(diǎn)位于目的基因模板鏈的3’端（轉(zhuǎn)錄出來的mRNA安5，→3，方向進(jìn)行）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳技術(shù)分離后將含有目的基因條帶的凝膠切割下來以便回收并提純。
（2）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞及培育轉(zhuǎn)基因植株。使用的外植體是帶有傷口的葉圓片，將重組的農(nóng)桿菌和葉圓片共培養(yǎng)一段時間，該過程需控制好農(nóng)桿菌的濃度、共培養(yǎng)的時間、和pH、溫度等環(huán)境條件，以保證外植體的存活率和轉(zhuǎn)化率均較高。將共培養(yǎng)后的葉圓片轉(zhuǎn)入添加適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，目的是殺死農(nóng)桿菌并篩選含有目的基因的植物細(xì)胞。培養(yǎng)基中還含有糖類、氨基酸、維生素等等有機(jī)成分及植物生長調(diào)節(jié)劑來調(diào)控葉圓片細(xì)胞脫分化、再分化過程，從而得到轉(zhuǎn)基因煙草植株。
（3）Gus基因表達(dá)產(chǎn)物能催化無色X-Gluc生成藍(lán)色物質(zhì)，植物無此基因，故篩選轉(zhuǎn)基因煙草植株及耐旱特性觀察鑒定。選取轉(zhuǎn)基因煙草葉片，將其置于含X-Gluc的鑒別培養(yǎng)基中染色，若葉片出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)即為轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)化成功。染色前需對葉片進(jìn)行脫色處理，以防對結(jié)果產(chǎn)生干擾。將轉(zhuǎn)基因煙草葉片，一組置于添加10% PEG的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另一組置于未添加PEG的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。添加10% PEG的作用是模擬干旱環(huán)境（提供干旱脅迫環(huán)境）。另取野生型煙草葉片作為對照。
（4）添加PEG的野生型煙草細(xì)胞出現(xiàn)葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)模糊，線粒體變形嵴斷裂等現(xiàn)象，而添加PEG的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞未出現(xiàn)上述現(xiàn)象，葉綠素含量：正常組的野生型煙草葉綠素含量高于轉(zhuǎn)基因煙草，PEG處理組的野生型煙草葉綠素含量少于轉(zhuǎn)基因煙草，經(jīng)PEG處理后野生型煙草葉綠素含量減少，轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量增加，推測干旱脅迫下Ln1蛋白可能是通過穩(wěn)定葉綠體基粒片層的結(jié)構(gòu)/減少對葉綠體基粒結(jié)構(gòu)的破壞、維持葉綠素含量（減緩葉綠素含量下降），來維護(hù)光合作用的正常進(jìn)行，從而抵御干旱。
12．（2024·浙江·模擬預(yù)測）莫內(nèi)林是從一種西非植物的漿果中分離提純到的甜味蛋白，甜度是蔗糖的3000倍左右。下圖1所示利用大腸桿菌生產(chǎn)莫內(nèi)林，其中M基因可表達(dá)合成莫內(nèi)林。表1是為PCR擴(kuò)增M基因設(shè)計的引物，畫線部分是所需使用的限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。
Ampr為氨芐青霉素抗性基因，氨芐青霉素可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，對真核生物生長無影響
限制性內(nèi)切核酸酶識別序列及切割位點(diǎn)：BamHI：5’-G↓GATCC-3’ XhI：5’-C↓TCGAG-3’ Sau3AI：5’-↓GATC-3’ SacI：5’-GAGCT↓C-3’
(1)若選用XhI和Sau3AI對質(zhì)粒A進(jìn)行切割，為實(shí)現(xiàn)其與目的基因的連接，可在目的基因兩端添加。引物1的結(jié)合位點(diǎn)可能在（選填圖1中的編號）。引物1的畫線部分序列在A中（有/沒有），引物2畫線部分的序列在B中（有/沒有）的可能性較高。
(2)已知C中的培養(yǎng)基成分有水、酵母粉、蛋白胨和氯化鈉，并按一定比例添加氨芐青霉素。將C中有生長優(yōu)勢的菌落經(jīng)多次后作為菌種在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，積累產(chǎn)物，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基成分與C中培養(yǎng)基相較可不添加，并采用的方法對裝填在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基滅菌。
(3)通過大腸桿菌生產(chǎn)的莫內(nèi)林甜度較天然莫內(nèi)林大為降低，天然莫內(nèi)林也易因溫度等因素導(dǎo)致甜度降低甚至甜味消失，科學(xué)家分析其中的原因并進(jìn)行了后續(xù)的工程學(xué)改造，請結(jié)合所學(xué)知識，分析兩種莫內(nèi)林甜度降低的原因分別是。
(4)針對上述問題，從分子水平對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造是解決莫內(nèi)林甜度降低的工程學(xué)思路。以甜味蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，選擇影響其與受體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，進(jìn)行定點(diǎn)突變，將獲取的新基因與酵母質(zhì)粒中構(gòu)建，導(dǎo)入到真核細(xì)胞如甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母中，并評價突變體的功能，篩選能產(chǎn)生等優(yōu)良性能的甜味蛋白質(zhì)的菌種。研究結(jié)果表明，相對于天然的野生型甜味蛋白質(zhì)mnellin，突變體E2N/E23A的甜味均提高了約3倍左右，而突變體E2N/E23A的熱穩(wěn)定性(Tm值)提高了約10℃。
(5)接上題，與大腸桿菌轉(zhuǎn)化不同，畢赤酵母轉(zhuǎn)化前一般先用低溫山梨醇溶液處理，使其處于一種的生理狀態(tài)；同時需將外源DNA處理成線性，分析原因可能是。轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)分為兩個階段：生長階段，以甘油為碳源、獲取大量的功能性細(xì)胞；誘導(dǎo)階段，通過添加甲醇來誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。培養(yǎng)基中除加入甘油、甲醇外，還需要提供的營養(yǎng)物質(zhì)有。
【答案】(1) ①XhI和BamHI的識別序列 ②或③ 有沒有
(2) 擴(kuò)大培養(yǎng) 氨芐青霉素和瓊脂從底部通入高溫蒸汽/（通入）高溫蒸汽
(3)大腸桿菌生產(chǎn)的莫內(nèi)林甜度降低，可能是因其為原核生物，細(xì)胞無法加工修飾合成的莫內(nèi)林，分子結(jié)構(gòu)與植物中的天然莫內(nèi)林有差異。因天然莫內(nèi)林是蛋白質(zhì)，容易受到溫度等條件的影響改變結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甜度下降甚至甜味消失。
(4) 表達(dá)載體/重組DNA/重組質(zhì)粒甜味度好、穩(wěn)定性強(qiáng)
(5) 能吸收周圍環(huán)境中DNA分子（感受態(tài)）將環(huán)狀質(zhì)粒（表達(dá)載體、重組DNA）酶切成線性，便于整合在酵母染色體上且穩(wěn)定存在氮源、無機(jī)鹽、水
【分析】PCR原理:在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。
【詳解】（1）若選用XhI和Sau3AI對質(zhì)粒A進(jìn)行切割，為實(shí)現(xiàn)其與目的基因的連接，需要用XhI和Sau3AI對目的基因進(jìn)行切割，但是目的基因內(nèi)部存在Sau3AI的識別序列無法使用，因此可采用BamHI代替Sau3AI，因此可在目的基因兩端添加XhI和BamHI的識別序列。
DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸子鏈，因此要想PCR擴(kuò)增出M基因，引物1的結(jié)合位點(diǎn)可能在②或③。
畫線部分是所需使用的限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，PCR出的M基因中含有該限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，那么要想M基因能連接在質(zhì)粒中，那么質(zhì)粒A中也應(yīng)該有該序列，因?yàn)镸基因和質(zhì)粒用同種限制酶切割，因此連接之后的重組質(zhì)粒B中也含有該酶的識別序列。
（2）在工業(yè)化生產(chǎn)時發(fā)酵罐中需要大量菌種，因此需要再接種之前，對生長優(yōu)勢的菌落經(jīng)多次擴(kuò)大培養(yǎng)。
氨芐青霉素屬于抗菌藥物，但在發(fā)酵過程中培養(yǎng)基和發(fā)酵罐已經(jīng)滅菌，且發(fā)酵條件只適合發(fā)酵所需菌種生長，因此發(fā)酵罐中培養(yǎng)基成分可去掉氨芐青霉素，發(fā)酵過程要得到大量發(fā)酵產(chǎn)物，常用液體培養(yǎng)基，因此也可以去掉瓊脂。對裝填在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基滅菌可以采用從底部通入高溫蒸汽/（通入）高溫蒸汽。
（3）根據(jù)原核生物沒有復(fù)雜的細(xì)胞器，并且莫內(nèi)林化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，可推測兩種莫內(nèi)林甜度降低的原因分別是大腸桿菌生產(chǎn)的莫內(nèi)林甜度降低，可能是因其為原核生物，細(xì)胞無法加工修飾合成的莫內(nèi)林，分子結(jié)構(gòu)與植物中的天然莫內(nèi)林有差異。因天然莫內(nèi)林是蛋白質(zhì)，容易受到溫度等條件的影響改變結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甜度下降甚至甜味消失。
（4）根據(jù)基因工程操作過程，在導(dǎo)入受體細(xì)胞之前需要將獲取的新基因與酵母質(zhì)粒中構(gòu)建表達(dá)載體/重組DNA/重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入到真核細(xì)胞如甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母中，并評價突變體的功能，篩選能產(chǎn)生甜味度好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)良性能的甜味蛋白質(zhì)的菌種。
（5）可根據(jù)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化條件，猜測畢赤酵母轉(zhuǎn)化前一般先用低溫山梨醇溶液處理，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子（感受態(tài)），因?yàn)榻湍妇钦婧松铮薉NA分子是線狀，因此需將外源DNA處理成線性，便于整合在酵母染色體上且穩(wěn)定存在。培養(yǎng)基中除加入甘油、甲醇外，還需要提供的營養(yǎng)物質(zhì)有氮源、無機(jī)鹽、水。
13．（2024·浙江·三模）葡萄是兩性花植株。無核葡萄品質(zhì)優(yōu)良，但抗寒性差，中國野生山葡萄具有較強(qiáng)抗寒性。回答下列問題：
Ⅰ．利用中國野生山葡萄培育抗寒無核葡萄品種
(1)人工雜交。研究者對無核種子敗育型（經(jīng)過授粉受精，胚和胚乳一段時間后停止發(fā)育）葡萄植株進(jìn)行、套袋、掛牌，一段時間后授以野生山葡萄的，完成雜交。
(2)胚離體培養(yǎng)。雜交后7-10天，剪取子房經(jīng)75%乙醇或消毒后，用多次沖洗，用解剖針將其剝開，取胚珠接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、篩選獲得抗寒無核葡萄植株。
Ⅱ．利用基因工程技術(shù)對抗寒相關(guān)D基因的功能展開相關(guān)研究
(3)科研人員利用pG載體首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒，導(dǎo)入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中，如下圖所示。GAL4基因可編碼酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白，AH109菌株為色氨酸、組氨酸缺陷型菌株，只有在添加相應(yīng)氨基酸的培養(yǎng)基中才能生長。
①為了能夠篩選得到重組酵母，培養(yǎng)基的配方為下列選項中的組，此外還需額外添加，通過顯色反應(yīng)做進(jìn)一步驗(yàn)證。
A組：加色氨酸和組氨酸
B組：不加色氨酸和組氨酸
C組：加組氨酸，不加色氨酸
D組：加色氨酸，不加組氨酸
②實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗寒相關(guān)D基因編碼的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄激活功能，完善實(shí)驗(yàn)分組及預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
對照組1：酵母菌導(dǎo)入pG-GAL4重組載體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：有菌落，變藍(lán)。
對照組2：酵母菌導(dǎo)入，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：。
實(shí)驗(yàn)組：酵母菌導(dǎo)入，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：。
(4)將抗寒相關(guān)D基因?qū)霟o核葡萄植株中，研究者常構(gòu)建含D基因和抗除草劑基因的穩(wěn)定表達(dá)載體，用含的培養(yǎng)基篩選愈傷組織，用PCR方法篩選出植株，72小時誘導(dǎo)培養(yǎng)，檢測植株中D蛋白的含量以判斷抗寒能力。
【答案】(1) 去雄成熟花粉
(2) 次氯酸鈉或氧化汞無菌水
(3) B X-a-gal pG載體無菌落，不變藍(lán) pG-D重組載體有菌落，變藍(lán)
(4) 除草劑含D基因陽性低溫
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不—樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測和個體水平上的鑒定。
【詳解】（1）葡萄植株在開花前進(jìn)行去雄、套袋、掛牌，一段時間后授以野生山葡萄的成熟花粉，完成雜交。
（2）胚離體培養(yǎng)。雜交后7-10天，剪取子房經(jīng)75%乙醇或次氯酸鈉或氧化汞消毒后，用無菌水多次沖洗，用解剖針將其剝開，取胚珠接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、篩選獲得抗寒無核葡萄植株。
（3）①依據(jù)題干信息，AH109菌株為色氨酸、組氨酸缺陷型菌株，為了能夠篩選得到重組酵母，重組的載體中含有編碼色氨酸合成酶的基因和具有轉(zhuǎn)錄激活功能的Va基因，AH109菌株的基因中含有HIS3基因可以編碼組氨酸合成酶，所以若重組成功，就可以合成色氨酸和組氨酸，所以培養(yǎng)基配方中無需添加色氨酸和組氨酸，即B組；若用顯色反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，依據(jù)題干信息，MEL1基因可以編碼α-半乳糖苷酶，可分解X-α-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，所以培養(yǎng)基中需額外添加X-α-gal。②依據(jù)圖示信息，實(shí)驗(yàn)分為三組：對照組1是導(dǎo)入pG-GAL4重組載體，對照組2是只導(dǎo)入PG載體，實(shí)驗(yàn)組是導(dǎo)入pG-Va重組載體，對照組1導(dǎo)入pG-GAL4重組載體，含有MEL1基因、HIS3基因及編碼色氨酸的基因，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)藍(lán)色，有菌落；對照組2只導(dǎo)入PG載體，無菌落接種，且不含有MEL1基因，所以不會出現(xiàn)藍(lán)色物質(zhì)，也無菌落生長；實(shí)驗(yàn)組導(dǎo)入pG-Va重組載體，也含有MEL1基因、HIS3基因及編碼色氨酸的基因，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)藍(lán)色，有菌落。
（4）構(gòu)建了含D基因和抗除草劑基因的穩(wěn)定表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作（即目的基因的檢測與鑒定）為：用含除草劑的培養(yǎng)基篩選愈傷組織，用PCR方法篩選出含D基因陽性植株，72小時低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)，檢測植株中D蛋白的含量以判斷抗寒能力。
14．（2024·浙江·三模）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法存在單個Ti質(zhì)粒可承載外源基因大小有限的不足，研究人員通過改進(jìn)轉(zhuǎn)化過程，獲得了抗蟲牧草。表為實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒特性，圖為質(zhì)粒2的T-DNA片段基因和限制酶識別序列分布。
實(shí)驗(yàn)農(nóng)桿菌和質(zhì)粒特性
備注：利福平、鏈霉素和卡那霉素都是抗生素， Vir 基因在特定物質(zhì)下表達(dá)，其產(chǎn)物是 T-DNA 片段轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的必需物質(zhì)。有無 T-DNA 片段不影響質(zhì)粒其他基因的表達(dá)。
回答下列問題：
(1)愈傷組織獲取。選取牧草種子后，剝?nèi)ネ鈿ぃ?0%乙醇消毒后，用沖洗，接種在培養(yǎng)基中，通過和細(xì)胞增殖，獲得愈傷組織。
(2)構(gòu)建重組載體和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。選用限制酶對質(zhì)粒2進(jìn)行酶切，目的是保留潮霉素抗性和。用處理農(nóng)桿菌后，將其與質(zhì)粒1和質(zhì)粒2共培養(yǎng)一段時間。將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌接種到含有的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時間后，挑取單克隆培養(yǎng)物，接種到不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間。采用雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的優(yōu)點(diǎn)是。
(3)轉(zhuǎn)基因愈傷組織的獲取。將重組農(nóng)桿菌分別接種至含乙酰丁香酮（AS）和不含AS的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，再與愈傷組織共培養(yǎng)3天，然后取少量愈傷組織接種到不同濃度潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30分鐘，結(jié)果如表所示。
表不同濃度潮霉素對愈傷組織存活率的影響
由表2可知，AS的作用是，應(yīng)選用的潮霉素濃度作為篩選濃度對所有轉(zhuǎn)化后愈傷組織進(jìn)行篩選。
(4)抗蟲牧草的鑒定。將愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基培養(yǎng)至幼苗，經(jīng)煉苗后，轉(zhuǎn)移至移植到土壤中培育，獲得抗蟲牧草甲、乙、丙。取三組牧草的適量葉片細(xì)胞，提取總DNA。以抗蟲基因的特異序列和葉肉細(xì)胞自身基因的特異序列分別做2對引物，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行，結(jié)果顯示植株甲、丙成功導(dǎo)入抗蟲基因，組1和組2分別是陰性對照和陽性對照，請在電泳結(jié)果圖2上繪制組1和組2的電泳結(jié)果。植株甲和丙不能立即推廣種植，原因是。
【答案】(1) 無菌水脫分化
(2) NcI和BstEII 確保目的基因與載體的正確連接（防止自身環(huán)化或防止反向拼接）（低濃度）CaCl2（氯化鈣）利福平、鏈霉素和卡那霉素能導(dǎo)入長度更長的外源基因
(3) 促使Vir基因表達(dá)，使T-DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到植物細(xì)胞中 40mg/L
(4) 凝膠電泳甲丙含有抗蟲基因，但不一定表達(dá)抗蟲性狀；甲丙抗蟲性狀不一定能穩(wěn)定遺傳；可能出現(xiàn)基因漂移；轉(zhuǎn)基因植株的存活能力可能較弱等
【分析】基因工程的操作步驟：
1、目的基因的獲取方法。
2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建。
3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。
4、目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】（1）外植體消毒后，需要用無菌水清洗，一方面去除消毒劑，另一方面也避免病原微生物的污染。接種后，外植體需要通過脫分化，然后進(jìn)行細(xì)胞增殖過程，才能形成愈傷組織。
（2）依據(jù)圖1信息，T-DNA中的潮霉素抗性基因需保留，用于篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織，同時為了確保外源目的基因的正確連接，所以選用NcI和BstEⅡ兩種酶進(jìn)行酶切。為提高外源基因的轉(zhuǎn)化成功率，常使用低濃度的氯化鈣溶液處理細(xì)菌。根據(jù)表1信息，所用農(nóng)桿菌自帶利福平抗性基因，質(zhì)粒1帶有鏈霉素抗性基因，質(zhì)粒2帶有卡那霉素抗性基因，因此最后篩選導(dǎo)入了2種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌時，需接種到含有利福平、鏈霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基上。雖然具有抗生素抗性，但抗生素仍舊會對農(nóng)桿菌產(chǎn)生不利影響，因此需要將篩選出來的重組農(nóng)桿菌在不含抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恢復(fù)活性。依據(jù)題干和表格信息，質(zhì)粒1的作用是提供Vir蛋白，質(zhì)粒2的作用是提供T-DNA，因此質(zhì)粒2不需要Vir基因片段，從而增加了可承載的外源基因的長度。
（3）依據(jù)題干和表2信息，潮霉素用于篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織，因此不抗潮霉素的愈傷組織即為未導(dǎo)入外源基因的愈傷組織。表中信息表示不含AS的愈傷組織只能在無潮霉素或較低潮霉素濃度下存活（說明植物自己有一點(diǎn)潮霉素抗性），說明未導(dǎo)入外源基因，而含有AS組的愈傷組織，在較高潮霉素濃度下也能存活，再結(jié)合表1備注的相關(guān)信息，可以得出AS的作用，即AS的作用是促使Vir基因表達(dá)，使T-DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到植物細(xì)胞中。同時潮霉素的作用是篩選導(dǎo)入外源基因的外植體，因此需要一定的濃度，但濃度也不能過高，避免轉(zhuǎn)基因愈傷組織也死亡，即應(yīng)選用40mg/L的潮霉素濃度作為篩選濃度對所有轉(zhuǎn)化后愈傷組織進(jìn)行篩選。
（4）鑒定轉(zhuǎn)基因牧草中是否含有目的基因，可以通過PCR的方式進(jìn)行檢測，PCR的結(jié)果需用凝膠電泳的方式獲得。依據(jù)題目信息，甲乙丙三組都有葉肉細(xì)胞自身基因，甲丙兩組含有外源基因，因此電泳結(jié)果圖上方條帶為葉肉細(xì)胞自由基因，下方條帶為外源基因。陰性對照應(yīng)使用未導(dǎo)入外源基因的該植株細(xì)胞使用葉肉細(xì)胞自身引物進(jìn)行PCR，所以應(yīng)該獲得一條上方的條帶，陽性對照應(yīng)使用含有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行PCR，因此獲得的是下方的條帶。則組1和組2的電泳結(jié)果為：；甲丙含有抗蟲基因，但不一定表達(dá)抗蟲性狀；甲丙抗蟲性狀不一定能穩(wěn)定遺傳；可能出現(xiàn)基因漂移；轉(zhuǎn)基因植株的存活能力可能較弱等，故植株甲和丙不能立即推廣種植。
15．（2024·浙江寧波·二模）草甘膦是一種除草劑，但會影響水稻產(chǎn)量。水稻產(chǎn)量與高產(chǎn)基因有關(guān)，研究人員擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對水稻高產(chǎn)基因進(jìn)行定位，并進(jìn)一步培育能穩(wěn)定遺傳的抗草甘膦高產(chǎn)水稻新品種?；卮鹣铝袉栴}：
Ⅰ.水稻高產(chǎn)基因定位水稻穗粒數(shù)可影響水稻產(chǎn)量。農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒的 T－DNA 可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入野生型水稻基因組中（可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時插入多個位點(diǎn)），導(dǎo)致被插入的基因功能喪失，從而得到一系列水稻突變體。研究者從中篩選得到一株穗粒數(shù)異常突變體，并進(jìn)行下列研究。
(1)提取 DNA。采集適量突變體和野生型水稻的幼嫩葉片，分別冷凍后研磨成粉末狀，依次加入SDS、RNA酶等試劑，去除蛋白質(zhì)和等大分子雜質(zhì)。提取過程中需加入酶抑制劑并保持輕柔操作，以避免，從而提高總 DNA提取率。
(2)PCR擴(kuò)增。對提取獲得的兩組總DNA分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。為避免外源DNA等因素的污染，微量離心管、槍頭和蒸餾水等在 PCR 前需進(jìn)行處理。可以通過在紫外燈下直接觀察電泳結(jié)果中DNA條帶的及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增是否成功。
(3)結(jié)果鑒定。分別用EcRI、Hind Ⅲ、BamHI三種限制酶處理突變體總DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物，處理后進(jìn)行電泳，并與野生型 DNA 和 Ti質(zhì)粒對照。電泳后的 DNA 與含放射性同位素標(biāo)記的 DNA 探針（T－DNA的一條單鏈）進(jìn)行雜交，得到突變體總 DNA 不同酶切處理后的放射性檢測結(jié)果如圖1所示。
①不同酶切結(jié)果的雜交帶位置不同的原因是：不同酶切后含的片段長度不同，因此各組 DNA片段在凝膠中電泳時的不同，最終導(dǎo)致分布于不同位置。
②若雜交結(jié)果顯示突變體在不同限制酶處理時均出現(xiàn)雜交帶，野生型組（填“有”或“無”）雜交帶， Ti質(zhì)粒組（填“有”或“無”）雜交帶，則表明T－DNA 成功插入水稻染色體基因組中，且可判斷突變體為T－DNA 位點(diǎn)插入，依據(jù)是。（注：T－DNA 上沒有 EcRI、HindⅢ、BamHI三種限制酶的酶切位點(diǎn)）。
(4)用某種限制酶處理突變體的DNA（如圖2所示），斷開DNA 分子中的個磷酸二酯鍵，再用將兩端的黏性末端連接成環(huán)，以此為模板，利用下表中的引物①②進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出序列，擴(kuò)增產(chǎn)物（填“不含”或“含”）T－DNA 完整序列。經(jīng)過與野生型水稻基因組序列比對，確定T－DNA 插入2號染色體上的B基因中。
(5)研究發(fā)現(xiàn)，該突變體產(chǎn)量明顯低于野生型，據(jù)此推測 B基因可（填“促進(jìn)”或“抑制”）水稻穗粒的形成，可控制高產(chǎn)性狀。
Ⅱ.抗草甘膦高產(chǎn)水稻培育，研究者構(gòu)建如圖3所示的Ti表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗草甘膦基因R 和基因B轉(zhuǎn)入野生型水稻中，培育穩(wěn)定遺傳的抗草甘膦高產(chǎn)水稻新品種。
(6)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)有：T－DNA 和水稻 DNA 均為結(jié)構(gòu)、生物界共用一套等。
(7)根據(jù)基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)組成分析，Ti質(zhì)粒中的CaMV35S 是，其功能是酶的識別和結(jié)合部位。Ti 表達(dá)載體中，B基因和R基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈的方向（填“相同”或“相反”）。
(8)現(xiàn)需選出單一位點(diǎn)插入R基因和B基因且穩(wěn)定遺傳的水稻新品種，篩選方案如下：
①轉(zhuǎn)基因后的水稻植株自交，收獲種子（F?）并播種在含的選擇培養(yǎng)基上，若能夠萌發(fā)并生長的個體即為的個體；
②F?存活個體自交所得種子（F?）按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，選擇存活率約的培養(yǎng)基中的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)獲得F?植株；
③將F?植株自交所得種子（F?）按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，選擇種子全部存活的培養(yǎng)基中的幼苗即為單一位點(diǎn)插入且的抗草甘膦植株。
④為實(shí)現(xiàn)最終育種目標(biāo)，研究人員還需檢測。
【答案】(1) RNA DNA DNA被分解或斷裂
(2) 高壓蒸汽滅菌位置
(3) T-DNA 遷移速率無有單一用三種不同限制酶處理都只得到一條雜交帶，而野生型無雜交帶
(4) 4 DNA連接酶 T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的突變體DNA未知序列不含
(5)促進(jìn)
(6) 雙螺旋遺傳密碼
(7) 啟動子 RNA聚合相反
(8) 草甘膦成功表達(dá)R基因 75% 穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因水稻植株的產(chǎn)量是否增加
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等；
（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；
（4）目的基因的檢測與鑒定：
分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)；
個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】（1）采集適量突變體和野生型水稻的幼嫩葉片，分別冷凍后研磨成粉末狀，依次加入SDS、RNA酶等試劑，去除蛋白質(zhì)和RNA等大分子雜質(zhì)。提取過程中需加入DNA酶抑制劑并保持輕柔操作，以避免DNA被分解或斷裂，從而提高總 DNA提取率；
（2）PCR是進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，為避免外源DNA等的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的相關(guān)器具如微量離心管、槍頭、緩沖液和蒸餾水等應(yīng)提前進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，可以通過在紫外燈下直接觀察電泳結(jié)果中DNA條帶的位置及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增是否成功；
（3）①不同酶切結(jié)果，雜交帶的位置不同，這是由于不同酶切后含T-DNA的片段長度不同，因此各組 DNA片段在凝膠中電泳時的遷移速率不同，最終導(dǎo)致分布于不同位置；②若雜交結(jié)果顯示突變體在不同限制酶處理時均出現(xiàn)雜交帶，野生型組無雜交帶， Ti質(zhì)粒組有雜交帶，則表明T－DNA 成功插入水稻染色體基因組中，且可判斷突變體為T－DNA單一位點(diǎn)插入，依據(jù)是用三種不同限制酶處理都只得到一條雜交帶，而野生型無雜交帶；
（4）用某種限制酶處理突變體的DNA，斷開DNA 分子中的4個磷酸二酯鍵，再用DNA連接酶將兩端的黏性末端連接成環(huán)，以此為模板，利用引物①②進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的突變體DNA未知序列，擴(kuò)增產(chǎn)物不含T－DNA 完整序列；
（5）由于該突變體產(chǎn)量明顯低于野生型，而突變體內(nèi)B基因由于插入了T-DNA導(dǎo)致功能喪失，據(jù)此推測B基因促進(jìn)水稻穗粒的形成；
（6）轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)有：T－DNA 和水稻 DNA 均為雙螺旋結(jié)構(gòu)、生物界共用一套密碼子等；
（7）基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)應(yīng)該包括啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因等，由圖可知CaMV35S是啟動子，功能是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)。RNA聚合酶的移動方向是從啟動子移向終止子，故兩個基因編碼鏈方向相反；
（8）①轉(zhuǎn)基因后的水稻植株自交，收獲種子（F?）并播種在含草甘膦的選擇培養(yǎng)基上，若能夠萌發(fā)并生長的個體即為成功表達(dá)R基因；②F?存活個體自交所得種子（F?）按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，選擇存活率約75%的培養(yǎng)基中的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)獲得F?植株；③將F?植株自交所得種子（F?）按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，選擇種子全部存活的培養(yǎng)基中的幼苗即為單一位點(diǎn)插入且穩(wěn)定遺傳的抗草甘膦植株；④為實(shí)現(xiàn)最終育種目標(biāo)，研究人員還需檢測轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量。
16．（2024·浙江金華·二模）組培再生體系是進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化、開展功能基因組學(xué)研究的前提條件，然而目前羊角蜜的組培再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系仍不成熟?？蒲腥藛T研究了外植體類型、激素濃度和農(nóng)桿菌菌株等因素對其組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化的影響。請回答下列問題：
(1)切取播種后2d子葉節(jié)（子葉節(jié)-2DAS），播種后5d子葉節(jié)（子葉節(jié)-5DAS）和下胚軸（下胚軸-5DAS），置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+0.5mg·L-16-BA+1mg·L-1ABA+30g·L-1蔗糖+9g·L-1瓊脂）進(jìn)行愈傷和不定芽誘導(dǎo)，結(jié)果如圖1、圖2所示；并進(jìn)行了不同濃度6-BA[0（L1）、0.25（L2）、0.375（L3）、0.5（L4）、1（L5）和2（L6），各組單位均為mg·L-1]對不定芽誘導(dǎo)效果的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

由于所取的外植體具有，因此可在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)發(fā)芽。根據(jù)圖1、圖2可得出的結(jié)論是。圖3結(jié)果（填“能”或“不能”）表明6-BA對誘導(dǎo)不定芽形成具有兩重性。然后切取具有明顯生長點(diǎn)的不定芽，置于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，2周后觀察并統(tǒng)計生根情況。生根培養(yǎng)基與發(fā)芽培養(yǎng)對比，主要的區(qū)別是。
(2)通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將外源基因?qū)氲窖蚪敲奂?xì)胞中，以改造其遺傳特性。農(nóng)桿菌能將T質(zhì)粒中的片段轉(zhuǎn)移并整合到羊角蜜細(xì)胞的染色體上。轉(zhuǎn)化操作前，需要對野生農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒進(jìn)行T-DNA基因改造，改造后的質(zhì)粒如圖4所示，其中啟動子來源于（填“農(nóng)桿菌”或“羊角蜜細(xì)胞”）；標(biāo)記基因1的作用是；標(biāo)記基因2的作用是。據(jù)圖可知，標(biāo)記基因2與報告基因的模板鏈不在同一條DNA條鏈上，原因是。利用報告基因（本研究用綠色熒光蛋白基因GFP基因）與目的基因相連形成融合基因，用于鑒定目的基因是否在角蜜細(xì)胞中表達(dá)。

(3)農(nóng)桿菌侵染外植體后，需在培養(yǎng)基中加入以抑制農(nóng)桿菌生長。而后將不含農(nóng)桿菌的外植體組培至幼苗。統(tǒng)計熒光幼苗數(shù)與幼苗總數(shù)，并計算出侵染效率1；并利用PCR技術(shù)鑒定并統(tǒng)計含有CFP基因的幼苗數(shù)，并計算出侵染效率2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵染效率2大于侵染效率1，推測可能原因是。用PCR技術(shù)鑒定時，科研人員設(shè)計了正向引物（與模板鏈結(jié)合的引物）GFP-F和反向引物GFP-R進(jìn)行基因鑒定，請在下圖方框中標(biāo)出兩種引物在GFP基因上結(jié)合的位置。

為了更準(zhǔn)確地鑒定出GFP基因，設(shè)計引物時需考慮的因素有。
【答案】(1) 分生組織/生長點(diǎn) 羊角蜜子葉節(jié)和下胚軸（不同外植體）的愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著而不定芽誘導(dǎo)率差異顯著，綜合來看以播種后2d的子葉節(jié)效果最佳不能營養(yǎng)物質(zhì)與激素配比不同
(2) T-DNA 羊角蜜細(xì)胞篩選成功導(dǎo)入目的基因的農(nóng)桿菌選成功導(dǎo)入T-DNA的植物細(xì)胞啟動轉(zhuǎn)錄的方向不同
(3) 抗生素 GFP基因反向連接到質(zhì)粒上/GFP在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)率低引物長度/特異性高等
【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA—分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—抗原—抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】（1）需要選取分裂能力強(qiáng)的組織作為外植體，所以選取分生組織/生長點(diǎn)，可在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)發(fā)芽。根據(jù)圖2可知，羊角蜜子葉節(jié)和下胚軸（不同外植體）的愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著而不定芽誘導(dǎo)率差異顯著，綜合來看以播種后2d的子葉節(jié)效果最佳。根據(jù)圖3可知，6-BA濃度為L5時不定根誘導(dǎo)率小于L1，L2、L3、L4、L6的不定根誘導(dǎo)率高于L1，所以不能表明6-BA對誘導(dǎo)不定芽形成具有兩重性。利用營養(yǎng)物質(zhì)與激素配比不同分別用于誘導(dǎo)生根和發(fā)芽。
（2）農(nóng)桿菌能將T質(zhì)粒中的T-DNA片段轉(zhuǎn)移并整合到羊角蜜細(xì)胞的染色體上，所以用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將外源基因?qū)氲窖蚪敲奂?xì)胞中，以改造其遺傳特性。為了使外源基因在羊角蜜細(xì)胞中表達(dá)，則重組質(zhì)粒中的啟動子來源于羊角蜜細(xì)胞。標(biāo)記基因1可用于篩選成功導(dǎo)入目的基因的農(nóng)桿菌。標(biāo)記基因2可用于篩選成功導(dǎo)入T-DNA的植物細(xì)胞。由于啟動轉(zhuǎn)錄的方向不同，所以標(biāo)記基因2與報告基因的模板鏈不在同一條DNA條鏈上。
（3）農(nóng)桿菌是原核生物，可用抗生素抑制農(nóng)桿菌的生長。GFP基因反向連接到質(zhì)粒上/GFP在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)率低，所以侵染效率2大于侵染效率1。用PCR技術(shù)鑒定時，科研人員設(shè)計了正向引物（與模板鏈結(jié)合的引物）GFP-F和反向引物GFP-R進(jìn)行基因鑒定，則引物需要與模板鏈反向平行，且需要為DNA鏈的延伸提供3’末端，所以設(shè)計的引物如圖。

為了更準(zhǔn)確地鑒定出GFP基因，設(shè)計引物時需考慮引物長度/特異性高等因素。
17．（2024·浙江臺州·二模）家蠶核型多角體病毒可侵染BmN細(xì)胞，其基因組中的Bm90基因在病毒感染周期中的表達(dá)以及對病毒增殖和組裝均有一定作用。為進(jìn)一步研究其功能，科學(xué)家構(gòu)建了Bm90基因缺失型病毒（簡稱缺失型病毒）及Bm90基因補(bǔ)回型病毒（簡稱補(bǔ)回型病毒）2種重組病毒，與野生型病毒一起進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。回答下列問題：
(1)自然界中病毒粒子的構(gòu)造簡單，通常包含一個外殼和核衣殼包裹的。精確有效地研究某病毒特定基因的功能，往往需要在該病毒的基因組中誘變或該基因。
(2)為了獲取大量的Bm90基因，可通過檢索基因數(shù)據(jù)庫獲取序列，利用法合成，再根據(jù)合成的序列設(shè)計，在酶的作用下，通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)Bm90基因的體外擴(kuò)增；也可將Bm90基因與載體連接，導(dǎo)入到大腸桿菌實(shí)現(xiàn)Bm90基因的菌體內(nèi)擴(kuò)增。
(3)構(gòu)建Bm90基因表達(dá)載體后，需導(dǎo)入（狀態(tài)）的大腸桿菌細(xì)胞中，培養(yǎng)后收集菌體經(jīng)超聲波處理使細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析鑒定。得到電泳條帶后在相應(yīng)部位割膠以純化Bm90蛋白。再以Bm90蛋白為，注射到大白兔體內(nèi)，利用相關(guān)技術(shù)制備Bm90蛋白的單克隆抗體，可用于Bm90基因表達(dá)的研究。
(4)將3種病毒的基因組DNA經(jīng)脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后24、48、72和96h的BmN細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和制備蛋白質(zhì)樣品，以未轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞總蛋白質(zhì)為陰性對照，利用蛋白質(zhì)凝膠電泳檢測Bm90蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖。從表達(dá)時相來看，Bm90蛋白的表達(dá)特點(diǎn)是。
CK：正常BmN細(xì)胞1-4：野生型病毒轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h；5-8：缺失型病毒轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h； 9-12：補(bǔ)回型病毒轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h；Bm90基因缺失型和補(bǔ)回型病毒轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞后Bm90蛋白的表達(dá)情況
(5)為進(jìn)一步研究Bm90 基因在病毒增殖中的作用，取3種病毒的基因組DNA經(jīng)脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后24、48、72和96h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測定病毒濃度。結(jié)果表明Bm90基因是病毒增殖的必需基因，Bm90 基因缺失使病毒失去了產(chǎn)生子代病毒粒子的能力，而Bm90基因的補(bǔ)回可使病毒恢復(fù)產(chǎn)生子代病毒粒子的能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論，用坐標(biāo)曲線圖表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【答案】(1) 核酸分子敲除
(2) 化學(xué)合成引物 TaqDNA聚合克隆（復(fù)制）
(3) 感受態(tài) 破碎抗原
(4) 蛋白酶抑制劑病毒轉(zhuǎn)染后72h有表達(dá)，96h表達(dá)水平明顯上升
(5)
【分析】1、基因工程技術(shù)的基本步驟：目的基因的獲?。换虮磉_(dá)載體的構(gòu)建；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；目的基因的檢測與鑒定。
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。
（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
（3）運(yùn)載體：常用的運(yùn)載體有質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。
【詳解】（1）病毒結(jié)構(gòu)簡單，外殼和核衣殼包裹的遺傳物質(zhì)即核酸分子，要研究某基因的特定功能，可以使得該基因被誘變，或者敲除該基因，以觀察給基因缺失后病毒的性狀，從而推知該基因的功能。
（2）獲取大量的Bm90基因，可在獲取序列后利用化學(xué)合成法合成，然后利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR技術(shù)使用時先設(shè)計引物，然后在TaqDNA聚合酶的作用下，進(jìn)行體外擴(kuò)增；也可將Bm90基因與克?。◤?fù)制）載體連接，進(jìn)行體內(nèi)擴(kuò)增。
（3）感受態(tài)細(xì)胞能夠吸收遺傳物質(zhì)，因此構(gòu)建Bm90基因表達(dá)載體后，需導(dǎo)入感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞中，培養(yǎng)后收集菌體經(jīng)超聲波處理使細(xì)胞破碎，再然后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析鑒定，以測定轉(zhuǎn)入的基因是否被正常表達(dá)；要制備Bm90蛋白的單克隆抗體，則以Bm90蛋白為抗原注射入大白兔體內(nèi)，得到的是能抗Bm90蛋白的抗體。
（4）將3種病毒的基因組DNA經(jīng)脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后24、48、72和96h的BmN細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，以防止表達(dá)的Bm90蛋白被酶水解；根據(jù)圖示，野生型病毒轉(zhuǎn)染后72h、96h和補(bǔ)回型病毒轉(zhuǎn)染后72、96h的電泳檢測結(jié)果表明，這兩種情況下Bm90蛋白被表達(dá)，從表達(dá)時相來看，Bm90蛋白的表達(dá)特點(diǎn)是病毒轉(zhuǎn)染后72h有表達(dá)，96h表達(dá)水平明顯上升。
（5）結(jié)果表明Bm90基因是病毒增殖的必需基因，Bm90 基因缺失使病毒失去了產(chǎn)生子代病毒粒子的能力，而Bm90基因的補(bǔ)回可使病毒恢復(fù)產(chǎn)生子代病毒粒子的能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論，用坐標(biāo)曲線圖表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖：
18．（2024·浙江·二模）野生型果蠅的眼色為暗紅眼（++），現(xiàn)有兩個純合突變品系朱砂眼（cc）和猩紅眼（ss）。為進(jìn)一步研究其眼色的遺傳機(jī)制，進(jìn)行了三組雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表。
回答下列問題：
(1)雌果蠅的生殖器官中有貯精囊，一次交配可保留大量精子，供多次受精使用。進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)選擇的雌果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料。
(2)由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該果蠅的突變眼色為性狀，控制突變品系的c基因與s基因（“可能”或“不可能”）是等位基因。
(3)若c基因與s基因位于一對同源染色體上，則實(shí)驗(yàn)③F1相互交配產(chǎn)生的F2，其眼色表型及比例為。
(4)若c基因與s基因位于兩對同源染色體上，請嘗試寫出實(shí)驗(yàn)③親本雜交得到F1過程的遺傳圖解：（要求寫配子）。
(5)為探究s基因的分子作用機(jī)制，研究者分別提取品系果蠅的基因組，設(shè)計特異性引物，對+和s基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳，并對其表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1和圖2所示。推測+基因發(fā)生了堿基對的而突變?yōu)閟基因，導(dǎo)致其基因表達(dá)量，從而引起了果蠅體內(nèi)色素的含量變化。
【答案】(1)未交配過（未受精）
(2) 隱性不可能
(3)朱砂眼：暗紅眼〈野生型〉：猩紅眼=1：2：1
(4)2種遺傳圖解任選其一
(5) 野生型和猩紅眼缺失下降（減少）
【分析】根據(jù)題圖分析，野生型基因型為C-S-，朱砂眼基因型ccS-，猩紅眼C-ss。
【詳解】（1）雌果蠅的生殖器官中有貯精囊，一次交配可保留大量精子，供多次受精使用。進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)選擇未受精的雌果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料。
（2）由實(shí)驗(yàn)①和②可知，親本雜交后，F(xiàn)1都是暗紅色，該果蠅的突變眼色為隱性性狀。根據(jù)組合丙的F1可知，朱砂眼和猩紅眼雜交，后代表現(xiàn)為暗紅眼，朱砂眼和猩紅眼為隱性突變體，若一對等位基因控制，不可能出現(xiàn)暗紅眼，因此c、s為非等位基因。
（3）實(shí)驗(yàn)③親本朱砂眼×猩紅眼即ccSS×CCss，F(xiàn)1為CcSs，若c基因與s基因位于一對同源染色體上，則F1為CcSs產(chǎn)生的配子為cS、Cs。則實(shí)驗(yàn)③F1相互交配產(chǎn)生的F2，其眼色表型及比例為朱砂眼：暗紅眼〈野生型〉：猩紅眼=1：2：1。
（4）實(shí)驗(yàn)③親本朱砂眼×猩紅眼即ccSS×CCss，F(xiàn)1為CcSs，若c基因與s基因位于兩對同源染色體上，遺傳圖解如下圖所示：
（5）野生型和猩紅眼可能含有s基因，探究s基因的分子作用機(jī)制，研究者分別提取野生型和猩紅眼品系果蠅的基因組，設(shè)計特異性引物，對+和s基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳，并對其表達(dá)量進(jìn)行測定。根據(jù)圖1和2分析，+基因的電泳片段大于s基因的，故推測+基因發(fā)生了堿基對的缺失而突變?yōu)閟基因，導(dǎo)致其基因表達(dá)量下降，從而引起了果蠅體內(nèi)色素的含量變化。
考向
五年考情
考情分析
生物技術(shù)與工程綜合
2024年6月浙江卷第23題
2024年1月浙江卷第22題
2023年6月浙江卷第23題
2023年1月浙江卷第24題
2022年6月浙江卷第29題
2022年1月浙江卷第29題
2021年6月浙江卷第29題
2021年1月浙江卷第29題
2020年7月浙江卷第29題
2020年1月浙江卷第29題
選擇性必修3模塊的綜合考查，以發(fā)酵工程、細(xì)胞工程的真實(shí)情景為引入，結(jié)合多個工程的知識進(jìn)行解答，其中基因工程基本上年年考查，這一模塊考查學(xué)生基礎(chǔ)知識掌握程度、知識綜合應(yīng)用能力、分析和獲取信息的能力。
上游引物
下游引物
A
5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3'
5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3'
B
5'-…GGATCCATGACAGTTAGT…-3'
5'-…GAATTCTCACCGGCAGTA…-3'
C
5'-…GAATTCTACTGTCAATCA…-3'
5'-…GGATCCAGTGGCCGTCAT…-3'
D
5'-…GAATTCAGTGGCCGTCAT…-3'
5'-…GGATCCTACTGTCAATCA…-3'
親本
子代表型及比例
甲
高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=9：7
乙
高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=3：1
丙
高賴氨酸含量：低賴氨酸含量=1：1
實(shí)驗(yàn)材料
轉(zhuǎn)入載體組成I、II
植株表型
M基因表達(dá)情況
雄性不育小麥
-
雄性不育
僅在花藥發(fā)育早期表達(dá)，在根、
莖、葉、雌蕊中均不表達(dá)
野生型小麥
-
可育
在花藥發(fā)育各時期均不表達(dá)，在
根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá)
野生型小麥
ad
死亡
-
野生型小麥
①________
②________
僅在花藥發(fā)育早期表達(dá)，在
根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá)
引物1
5’GGAATTCCTCGAGGGCGAATGGGAAATTATCG3’
引物2
5’TTTGGATCCTTACGGCGGCGGAACCGGAC3’
菌株 E
含有利福平抗性基因
質(zhì)粒 1
質(zhì)粒 2
含有鏈霉素抗性基因和 Vir基因，無T-DNA 片段
含有卡那霉素抗性基因，無Vir基因，有T-DNA 片段
潮霉素濃度（mg/L）
0
20
40
60
80
不含 AS 組存活率（%）
93
86
23
0
0
含 AS 組存活率（%）
93
90
77
15
0
T-DNA序列
引物序列
5ˊ-AACTATGCGC…….CGTAGCCTAT-3ˊ
①5ˊ-GCGCATAGTT-3ˊ
3ˊ-TTGATACGCG…….GCATCGGATA-5ˊ
②5ˊ-CGTAGCCTAT-3ˊ
實(shí)驗(yàn)
P
F1
①
朱砂眼×野生型
野生型
②
猩紅眼×野生型
野生型
③
朱砂眼×猩紅眼
野生型

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