(1)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物離不開培養(yǎng)基,而培養(yǎng)基中主要的四大類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是 ,常用的接種方法有 (答出兩種即可)。
(2)微生物培養(yǎng)最基本的要求是無(wú)菌操作,下列對(duì)培養(yǎng)基、接種環(huán)、雙手、牛奶所采用的滅菌消毒方法的正確順序依次是 (填序號(hào):①化學(xué)消毒、②高壓蒸汽滅菌、③灼燒滅菌、④巴氏消毒法)。
(3)為進(jìn)一步探究并比較P450/Y9和Y9兩個(gè)菌株在不同條件下降解石油的能力,研究人員選用兩種培養(yǎng)基(成分如下表)進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
步驟一,將P450/Y9、Y9兩個(gè)菌株分別接種在兩液體培養(yǎng)基Ⅰ中,得到P450/Y9、Y9菌液。
步驟二,另取培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ,添加瓊脂分別制成平板Ⅰ、Ⅱ。在平板Ⅰ上制作兩個(gè)直徑相等的孔,標(biāo)號(hào)ⅠA、ⅠB,平板Ⅱ也進(jìn)行同樣的操作,兩個(gè)孔分別標(biāo)號(hào)ⅡA、ⅡB。
步驟三,將等量等濃度的P450/Y9菌液、Y9菌液分別接種到平板Ⅰ的ⅠA、ⅠB,平板Ⅱ也進(jìn)行同樣的操作。
步驟四,相同且適宜條件下培養(yǎng)一段時(shí)間,記錄平板Ⅰ、Ⅱ的透明圈大小如下表:
注:“+”表示有透明圈,“+”越多表示透明圈越大,“-”表示無(wú)透明圈。
①培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ中提供碳源的都是 。
②本實(shí)驗(yàn)的自變量是 ,平板上出現(xiàn)透明圈的原因是 。
③本實(shí)驗(yàn)可以得出的結(jié)論是 。
答案(1)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水 平板劃線法和稀釋涂布平板法
(2)②③①④
(3)①石油 ②培養(yǎng)基的成分和菌株的類型 細(xì)菌將平板中的石油分解 ③在有氮源的培養(yǎng)基上,P450/Y9菌株降解石油的能力高于Y9菌株;在無(wú)氮源的培養(yǎng)基上,Y9菌株無(wú)降解石油的能力,P450/Y9菌株降解石油的能力減弱
解析(1)培養(yǎng)基中主要的四大類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水,常用的接種方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法。(2)培養(yǎng)基要進(jìn)行②高壓蒸汽滅菌;接種環(huán)進(jìn)行③灼燒滅菌;雙手進(jìn)行①化學(xué)消毒;牛奶采用④巴氏消毒法進(jìn)行消毒。(3)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樘骄坎⒈容^P450/Y9和Y9兩個(gè)菌株在不同條件下降解石油的能力。①培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ中提供碳源的都是石油。②本實(shí)驗(yàn)中人為改變的變量是培養(yǎng)基的成分和菌株的類型,所以培養(yǎng)基的成分和菌株的類型是本實(shí)驗(yàn)的自變量。由于細(xì)菌將平板中的石油分解,則在平板上出現(xiàn)透明圈。③培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ的區(qū)別就是培養(yǎng)基Ⅰ有氮源,培養(yǎng)基Ⅱ沒有氮源,所以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中透明圈的大小可以判斷在有氮源的培養(yǎng)基上,P450/Y9菌株降解石油的能力高于Y9菌株;在無(wú)氮源的培養(yǎng)基上,Y9菌株無(wú)降解石油的能力,但P450/Y9菌株降解石油的能力減弱。
2.(2024·廣東廣州二模)(10分)癌癥的免疫療法通過(guò)重新激活抗腫瘤的免疫細(xì)胞,克服腫瘤的免疫逃逸,科研人員在不斷研究中發(fā)現(xiàn)多種免疫治療方法的結(jié)合是提高治療效果的途徑之一。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
圖1
圖2
(1)免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除突變的細(xì)胞,這體現(xiàn)了免疫系統(tǒng)的 功能。
(2)由于基因突變,癌細(xì)胞表面物質(zhì)發(fā)生改變,如某些種類癌細(xì)胞表面高表達(dá)膜蛋白PSMA和PD-L1。圖1中PD-L1能抑制T細(xì)胞的活化,使癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。臨床上可利用PD-1的單克隆抗體進(jìn)行癌癥治療,據(jù)圖1推測(cè),其原因是 。
(3)CD28是T細(xì)胞表面受體,T細(xì)胞的有效激活依賴于CD28在癌細(xì)胞與T細(xì)胞結(jié)合部位的聚集。因此,科研人員嘗試構(gòu)建既能結(jié)合PSMA又能結(jié)合CD28的雙特異性抗體PSMA×CD28,誘導(dǎo)T細(xì)胞定向殺傷癌細(xì)胞,如圖2所示。
制備過(guò)程:先將 分別注射到小鼠體內(nèi),分離出B淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)其與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選得到 ,再誘導(dǎo)兩種細(xì)胞融合。成功融合的細(xì)胞會(huì)表達(dá)兩種L鏈和兩種H鏈,由于 會(huì)產(chǎn)生多種抗體,因此還需進(jìn)行篩選,才能獲得所需的雙特異性抗體PSMA×CD28。
(4)科研人員將癌細(xì)胞和T細(xì)胞共同培養(yǎng),加入不同抗體,比較不同抗體對(duì)T細(xì)胞活化的作用。實(shí)驗(yàn)各組由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2含量如圖3所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明 。
圖3
答案(1)免疫監(jiān)視
(2)PD-1的單克隆抗體與PD-1結(jié)合,阻斷了PD-1和PD-L1的結(jié)合,避免PD-L1抑制T細(xì)胞的活化
(3)PSMA、CD28 兩種雜交瘤細(xì)胞 L鏈和H鏈隨機(jī)組合
(4)PSMA×CD28和PD-1單抗聯(lián)合使用能夠顯著激活T細(xì)胞,且在一定范圍內(nèi)激活作用隨PSMA×CD28濃度的增加而增強(qiáng);單獨(dú)使用PSMA×CD28或PD-1單抗都不能顯著激活T細(xì)胞(合理即可)
解析(1)免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除突變的細(xì)胞,這體現(xiàn)了免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視功能。(2)圖1中癌細(xì)胞表面的PD-L1和T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合,抑制T細(xì)胞的活化。PD-1的單克隆抗體與PD-1特異性結(jié)合,阻斷了PD-L1和PD-1的結(jié)合,避免PD-L1抑制T細(xì)胞的活化。(3)制備雙特異性抗體PSMA×CD28,則抗原是CD28和PSMA,將兩種物質(zhì)分別注射到小鼠體內(nèi),分離出兩類B淋巴細(xì)胞,將這兩類B淋巴細(xì)胞分別和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合,形成雜交瘤細(xì)胞,再誘導(dǎo)雜交瘤細(xì)胞融合。成功融合的細(xì)胞會(huì)表達(dá)兩種L鏈和兩種H鏈,所需的雙特異性抗體PSMA×CD28是特定的L鏈和H鏈結(jié)合形成的,由于L鏈和H鏈隨機(jī)組合,因此還需要進(jìn)行篩選,才能獲得所需的抗體。(4)分析圖3可知,自變量是抗體種類,PSMA×CD28+PD-1單抗聯(lián)合使用能夠顯著激活T細(xì)胞,且在一定范圍內(nèi)激活作用隨PSMA×CD28濃度的增加而增強(qiáng);單獨(dú)使用PSMA×CD28或PD-1單抗都不能顯著激活T細(xì)胞。
3.(2024·江西二模)(14分)熒光蛋白GFP在紫外線或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光,這一特性可以用于檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。科研團(tuán)隊(duì)將人β-酪蛋白基因與GFP基因連接,獲得了β-酪蛋白—GFP融合基因(簡(jiǎn)稱甲),將其插入質(zhì)粒P0,構(gòu)建了基因表達(dá)載體P1,其部分結(jié)構(gòu)如圖所示,圖中E1、E2為兩種限制酶酶切位點(diǎn)?；卮鹣铝袉?wèn)題。
(1)構(gòu)建融合基因甲時(shí)需要將β-酪蛋白基因編碼鏈(轉(zhuǎn)錄時(shí)與模板鏈互補(bǔ)的DNA單鏈)的 端與GFP基因編碼鏈的 端相連。為保證甲的完整性及其與質(zhì)粒PO正確連接,實(shí)驗(yàn)中選擇的限制酶E1和E2必須滿足的條件是 (答兩點(diǎn))?；虮磉_(dá)載體P1除了具有圖示結(jié)構(gòu)外,還應(yīng)具備的結(jié)構(gòu)有 。
(2)若編碼β-酪蛋白的DNA片段序列是:5'-TTCGCTTCT……CAGGAAGGA-3',擴(kuò)增該基因時(shí),在PCR儀中加入的引物的堿基序列為 。
(3)科研團(tuán)隊(duì)將P1轉(zhuǎn)入山羊乳腺細(xì)胞后,在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光。為獲得能生產(chǎn)β-酪蛋白的山羊,還應(yīng)該完成的主要工作包括:將能夠產(chǎn)生綠色熒光的 移入 中,體外培養(yǎng)至 時(shí)期,再進(jìn)行胚胎移植等。其中,進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)時(shí)所需的氣體環(huán)境是 。
(4)檢查生產(chǎn)人β-酪蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊是否培育成功,還需要進(jìn)行分子水平的檢測(cè),利用PCR技術(shù)可以檢測(cè) (答兩點(diǎn))。
答案(1)3' 5' 甲內(nèi)部沒有E1、E2的識(shí)別序列;E1、E2酶切后形成的黏性末端不同 復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因
(2)5'-TTCGCTTCT-3'、5'-TCCTTCCTG-3'
(3)乳腺細(xì)胞細(xì)胞核 MⅡ中去核卵母細(xì)胞 桑葚胚或囊胚 95%的空氣和5%的CO2形成的混合氣體
(4)山羊的染色體DNA上是否插入了甲;甲是否轉(zhuǎn)錄出了相應(yīng)的mRNA
解析(1)構(gòu)建融合基因甲時(shí)需要將β-酪蛋白基因編碼鏈的3'端與GFP基因編碼鏈的5'端相連,以保證融合基因甲的核苷酸序列不發(fā)生改變,從而保證融合基因能夠正確表達(dá)。為保證甲的完整性,在基因甲中應(yīng)沒有E1、E2的識(shí)別序列,同時(shí)要使基因甲與質(zhì)粒PO正確連接,應(yīng)該確保E1、E2酶切后形成的黏性末端不同,這樣可以防止基因甲及質(zhì)粒PO的自身環(huán)化和反向連接。完整基因表達(dá)載體應(yīng)具有啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因、目的基因。(2)在進(jìn)行PCR擴(kuò)增β-酪蛋白的DNA片段時(shí),應(yīng)先合成2種不同的引物,在PCR擴(kuò)增時(shí)不同的引物與模板DNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì),在引物作用下,DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈,即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。所以在PCR儀中加入的引物的堿基序列為5'-TTCGCTTCT-3'、5'-TCCTTCCTG-3'。(3)若要獲得能生產(chǎn)β-酪蛋白的山羊,可采用核移植技術(shù),即將能夠產(chǎn)生綠色熒光乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核移入山羊的MⅡ中去核卵母細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞,并將該重組細(xì)胞在體外培養(yǎng)到桑葚胚或囊胚,再經(jīng)過(guò)胚胎移植等獲得能生產(chǎn)β-酪蛋白的山羊。在進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)時(shí)所需的氣體環(huán)境是95%的空氣和5%的CO2形成的混合氣體。(4)檢測(cè)目的基因甲是否導(dǎo)入成功,利用PCR技術(shù)可以檢測(cè)山羊的染色體DNA上是否插入了甲;甲是否轉(zhuǎn)錄出了相應(yīng)的mRNA。
4.(2024·湖南懷化二模)(12分)抗菌肽是一類具有廣譜抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性且無(wú)殘留等,被認(rèn)為是理想的抗生素替代品。為了突破抗菌肽在畜禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用的瓶頸,我國(guó)研究人員運(yùn)用小分子泛素蛋白(SUMO)融合技術(shù)將含有重組抗菌肽LLv基因的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌,表達(dá)融合蛋白SUMO-LLv,并優(yōu)化了表達(dá)條件,從而能高效獲得重組抗菌肽LLv。所用質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ基因及SacⅠ、XhⅠ酶切位點(diǎn)等,其結(jié)構(gòu)和構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程如圖1所示。據(jù)此分析回答以下問(wèn)題。
圖1
圖2
注:LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì),使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色;否則菌落為白色。
(1)擴(kuò)增LLv基因時(shí),PCR反應(yīng)體系中含有的酶有 ;已知該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列,為了使其能與已被酶切的質(zhì)粒連接,需根據(jù) 設(shè)計(jì)引物。
(2)LLv基因以a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?'→3'。該基因內(nèi)部沒有SacⅠ、XhⅠ這兩種酶切位點(diǎn)。圖1中酶切位點(diǎn)1和2所對(duì)應(yīng)的酶分別是 。
(3)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí),需用CaCl2處理大腸桿菌,其目的是 。
(4)為了將成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來(lái),甲同學(xué)在添加了卡那霉素、X-gal等成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行接種,結(jié)果如圖2,該同學(xué)采用的接種方法是 。圖2中出現(xiàn)的 菌落即成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落,判斷的理由是 。
答案(1)耐高溫的DNA聚合酶 LLv基因兩端的部分核苷酸序列和SacⅠ、XhⅠ的識(shí)別序列
(2)XhⅠ、SacⅠ(二者順序不可調(diào)換)
(3)使大腸桿菌變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞,便于從周圍環(huán)境吸收DNA分子
(4)稀釋涂布平板法 白色 目的基因(或LLv基因)的插入破壞了LacZ基因的結(jié)構(gòu),使其不能正常表達(dá)形成β-半乳糖苷酶,不能分解底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)
解析(1)PCR技術(shù)的基本原理是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下,依賴于TaqDNA聚合酶的酶促合成反應(yīng),即擴(kuò)增LLv基因時(shí),PCR反應(yīng)體系中含有的酶有耐高溫的DNA聚合酶。PCR過(guò)程需要兩種引物,能分別與目的基因兩條鏈的3'-端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。目的基因需要與質(zhì)粒進(jìn)行連接,但已知LLv基因序列不含圖1中限制酶(SacⅠ、XhⅠ)的識(shí)別序列,為了使LLv基因能與被酶切的質(zhì)粒連接,需要根據(jù)LLv基因兩端的部分核苷酸序列和SacⅠ、XhⅠ的識(shí)別序列設(shè)計(jì)引物。(2)LLv基因以a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?'→3',DNA模板被轉(zhuǎn)錄方向是從3'→5',即圖1中酶切位點(diǎn)1對(duì)應(yīng)的酶為XhⅠ,酶切位點(diǎn)2對(duì)應(yīng)的酶為SacⅠ。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,常用Ca2+處理微生物,使微生物細(xì)胞處于感受態(tài),便于從外界環(huán)境吸收DNA分子。(4)分析菌落分布可知,采用的接種方法是稀釋涂布平板法。為了將成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來(lái),甲同學(xué)在添加了卡那霉素、X-gal等成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行接種,目的基因(LLv基因)的插入破壞了LacZ基因的結(jié)構(gòu),使其不能正常表達(dá)形成β-半乳糖苷酶,底物X-gal不會(huì)被分解,不能產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落為白色,因此圖2中出現(xiàn)的白色菌落即成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落。
5.(2024·山東濟(jì)寧二模)(10分)某種小麥的雄性不育由核基因M控制,其整個(gè)花藥在發(fā)育早期停止發(fā)育進(jìn)程,因此其雄性不育比較徹底。研究發(fā)現(xiàn)所有的雄性不育植株都特異性地?cái)y帶了TRIM序列,且M及其等位基因的編碼區(qū)相同;為研究該序列與雄性不育之間的關(guān)系,科研人員在野生型小麥中獲得了M等位基因的啟動(dòng)子并利用Ti質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體,表達(dá)載體T-DNA部分結(jié)構(gòu)如圖1所示,GFP表達(dá)后會(huì)發(fā)出綠色熒光。將不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)入幼胚獲得轉(zhuǎn)基因小麥,分別對(duì)核不育小麥、野生型小麥及轉(zhuǎn)基因小麥的表型和M基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),部分結(jié)果如表。
圖1
注:a.通用的強(qiáng)啟動(dòng)子;b.M等位基因啟動(dòng)子;c.插入TRIM序列的M等位基因啟動(dòng)子;d.M編碼區(qū);e.僅在花藥發(fā)育早期表達(dá);f.在花藥發(fā)育各時(shí)期均不表達(dá);g.在根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá)。
(1)表中①處應(yīng)分別選擇 (填表注中字母序號(hào)),②處植株表型是 ,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在存活的轉(zhuǎn)基因小麥花藥中均能檢測(cè)到綠色熒光。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè),導(dǎo)致雄性不育的原因是 。
(2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 (填“需要”或“不需要”)設(shè)置將bd導(dǎo)入野生型小麥的實(shí)驗(yàn)組,理由是 。
(3)科研人員為檢測(cè)(1)中T-DNA插入受體細(xì)胞染色體中的位置,利用反向PCR技術(shù)對(duì)插入位點(diǎn)兩側(cè)序列進(jìn)行了分析,過(guò)程如圖2。已知T-DNA的一條單鏈序列為:5'-GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA-3'(虛線處省略了部分核苷酸序列)。應(yīng)選下列引物中的 (填序號(hào))用于步驟Ⅲ,引物的作用是 。
A.5'-CGCGAGTACT-3'
B.5'-GCGCTCATGA-3'
C.5'-CGTAGCCTCT-3'
D.5'-TACGCATTGC-3'
圖2
答案(1)c、d 雄性不育 TRIM序列的插入引起啟動(dòng)子序列改變,導(dǎo)致M基因在花藥發(fā)育早期表達(dá)
(2)不需要 野生型小麥本身具有bd,不需要另外導(dǎo)入
(3)BD 使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸
解析(1)本實(shí)驗(yàn)的目的是研究TRIM序列與雄性不育之間的關(guān)系,因此野生型小麥需要選擇插入TRIM序列的M等位基因啟動(dòng)子,即c,TRIM序列的M等位基因啟動(dòng)子的作用是啟動(dòng)M基因的表達(dá),因此在構(gòu)建載體組成Ⅰ、Ⅱ時(shí)需要在插入TRIM序列的M等位基因啟動(dòng)子之后加入M編碼區(qū),故表中①處應(yīng)分別選擇c、d。已知所有的雄性不育植株都特異性地?cái)y帶了TRIM序列,且第一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果和第四組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中M基因表達(dá)情況是相同的,因此②處植株表型是雄性不育。第二組實(shí)驗(yàn)野生型小麥M基因在花藥發(fā)育各時(shí)期均不表達(dá),在根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá),而第四組和第一組雄性不育植株中M基因僅在花藥發(fā)育早期表達(dá),在根、莖、葉、雌蕊中均不表達(dá),綜上推測(cè)導(dǎo)致雄性不育的原因是TRIM序列的插入引起啟動(dòng)子序列改變,導(dǎo)致M基因在花藥發(fā)育早期表達(dá)。(2)由于野生型小麥本身具有bd,不需要另外導(dǎo)入b和d。(3)反向PCR技術(shù)指的是擴(kuò)增T-DNA的兩側(cè)序列,以T-DNA的一條單鏈序列5'-GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA-3'為模板,擴(kuò)增其5'一側(cè)序列,因此對(duì)應(yīng)的引物是5'-TACGCATTGC-3',以T-DNA的另一條單鏈序列3'-CGTTACGCATCGGAGA……TTGATACGCGAGTACT-5'為模板,擴(kuò)增其5'一側(cè)序列,因此對(duì)應(yīng)的引物是5'-GCGCTCATGA-3',故選BD。引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'-端開始連接脫氧核苷酸。
6.(2024·福建三明一模)(10分)表觀遺傳調(diào)節(jié)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一,N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA上最常見的一種修飾。研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)過(guò)表達(dá)和STC2(癌癥相關(guān)基因)mRNA的m6A修飾水平降低的異?，F(xiàn)象?？蒲腥藛T利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)ALKBH5基因沉默和STC2基因的過(guò)表達(dá),以研究ALKBH5介導(dǎo)的m6A甲基化修飾對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響(其中STC2基因的α鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈)。研究人員分別用不同方式處理胃癌細(xì)胞,并測(cè)得胃癌細(xì)胞遷移標(biāo)志蛋白含量如圖3所示。
圖1
圖2
圖3
注:A、B、C、D為四種引物序列;BamHⅠ、Hind Ⅲ、SacⅠ為限制酶。
(1)圖1 PCR反應(yīng)體系中需加入4種dNTP、耐高溫的DNA聚合酶、模板和 ,還需加入引物 (選“A、B、C、D”)等。
(2)為達(dá)到圖1目的需要對(duì)上述引物進(jìn)行設(shè)計(jì),你的設(shè)計(jì)思路是 。
(3)為確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性,設(shè)計(jì)的引物不能太短,太短會(huì)導(dǎo)致 。
(4)據(jù)圖2可知,應(yīng)在培養(yǎng)基中添加 來(lái)初步篩選含重組DNA分子的癌細(xì)胞。
(5)據(jù)圖3可知,ALKBH5基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致 。
答案(1)擴(kuò)增緩沖液(或含Mg2+緩沖液) B、C
(2)需要在引物C的5'端添加BamHⅠ識(shí)別序列和強(qiáng)啟動(dòng)子序列,在引物B的5'端添加SacⅠ識(shí)別序列
(3)非特異性擴(kuò)增
(4)卡那霉素
(5)STC2基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的mRNA去甲基化
解析(1)圖1 PCR反應(yīng)體系中需加入4種dNTP作為原料,還需要加入耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、模板和擴(kuò)增緩沖液(或含Mg2+緩沖液),由于子鏈延伸時(shí)是從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸,因此引物需要連接在模板鏈的3'端,這樣才能保證擴(kuò)增的片段含有目的基因,據(jù)圖1可知,還需加入引物B和C。(2)利用PCR擴(kuò)增目的基因STC2時(shí),引物使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸,且STC2基因的α鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈,由于形成的mRNA與模板鏈互補(bǔ),且方向相反,并且形成mRNA時(shí)mRNA鏈的延伸是從5'→3',即圖1中基因轉(zhuǎn)錄時(shí)由右向左進(jìn)行,因此啟動(dòng)子應(yīng)在引物C的5'端,即需要在引物C的5'端添加BamHⅠ識(shí)別序列和強(qiáng)啟動(dòng)子序列,在引物B的5'端添加SacⅠ識(shí)別序列。保證擴(kuò)增的DNA片段用BamHⅠ和SacⅠ切割后形成的目的基因含有強(qiáng)啟動(dòng)子。(3)為確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性,設(shè)計(jì)的引物不能太短,因?yàn)樘虝?huì)與多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合,會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。(4)由圖可知,由于潮霉素抗性基因被破壞,因此重組質(zhì)粒的抗性基因是卡那霉素抗性基因,應(yīng)在培養(yǎng)基中添加卡那霉素來(lái)初步篩選含重組DNA分子的癌細(xì)胞。(5)根據(jù)題意“胃癌細(xì)胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)過(guò)表達(dá)和STC2(癌癥相關(guān)基因)mRNA的m6A修飾水平降低的異?，F(xiàn)象”,并結(jié)合圖示可知ALKBH5基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致STC2基因表達(dá)的mRNA去甲基化,進(jìn)而導(dǎo)致STC2基因過(guò)表達(dá)而引起癌細(xì)胞遷移。
培養(yǎng)基類型
成分
培養(yǎng)基Ⅰ
K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油
培養(yǎng)基Ⅱ
K2HPO4、MgSO4、石油
平板
平板Ⅰ
平板Ⅱ
菌株
ⅠA
ⅠB
ⅡA
ⅡB
透明圈大小
+++
++
++
-
組別
實(shí)驗(yàn)材料
載體組成
Ⅰ、Ⅱ
植株表型
M基因表
達(dá)情況
第一組
核不育小麥
無(wú)
雄性不育
eg
第二組
野生型小麥
無(wú)
可育
fg
第三組
野生型小麥
ad
死亡
第四組
野生型小麥
①
②
eg

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