1．PCR原理
（1）細胞內(nèi)DNA復(fù)制條件
（2）細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程
= 1 \* GB3 ①DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將DNA的羥基末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸。
= 2 \* GB3 ②在DNA的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是雙鏈解開。在體外可通過控制溫度來實現(xiàn)。在80~100 ℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。
= 3 \* GB3 ③PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進行，需提供：DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。
2．PCR的反應(yīng)過程
PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴增。
3．實驗操作
（1）PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、兩種RNA引物、水。
（2）實驗操作步驟
①按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；
②將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5 mL）中；
③將微量離心管放到PCR儀中；
④設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)；
⑤DNA在PCR儀中大量擴增。
考向 PCR的反應(yīng)過程
1．聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述30多次循環(huán)：95 ℃下使模板DNA變性、解鏈→55 ℃下復(fù)性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72 ℃下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是
A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn)
B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補配對原則完成的
C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸
D．PCR與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需酶的最適溫度較高
【參考答案】C
【試題解析】變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，解旋酶也具有該作用，A正確。復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補配對原則完成的，B正確。延伸是合成DNA的過程，所以該過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種脫氧核糖核苷酸，C錯誤。PCR與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需酶的最適溫度較高，因為PCR過程需要高溫變性，即使在復(fù)性時的溫度也比較高，D正確。
2．利用PCR技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯誤的是
A．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列
B．設(shè)計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連
C．退火溫度過高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物
D．第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16
【答案】D
1．PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))技術(shù)是一項在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，如圖表示合成過程。下列說法錯誤的是
A．甲過程高溫使DNA變性解旋，該過程不需要解旋酶的作用
B．丙過程用到的酶在高溫下失活，因此在PCR擴增時需要再添加
C．如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記，循環(huán)3次后，在形成的子代 DNA中含有15N標記的DNA占25%
D．PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變
2．下列有關(guān)PCR技術(shù)中引物的敘述，正確的是
A．引物是一小段DNA分子或雙鏈RNA分子
B．擴增一個DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目
C．兩種引物之間能夠發(fā)生堿基互補配對
D．DNA聚合酶只能從引物的5＇端連接脫氧核苷酸
3．利用PCR技術(shù)將某DNA分子擴增n代的過程中，下列敘述錯誤的是
A．引物越短，PCR出來的非目標DNA就越多
B．適溫延伸過程中，需要提供ATP
C．引物中G/C含量越高，退火溫度越高
D．共有2n-1對引物參與子代DNA分子的合成
4．多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，其簡要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是
A．PCR技術(shù)是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù)
B．反應(yīng)中新合成的DNA可以作為下一輪反應(yīng)的模板
C．每擴增一次溫度發(fā)生90℃→75℃→55℃變化
D．應(yīng)用PCR技術(shù)與DNA分子雜交技術(shù)可以檢測基因突變
5．小鼠雜交瘤細胞表達的單克隆抗體用于人體試驗時易引起過敏反應(yīng)，為了克服這個缺陷，可選擇性擴增抗體的可變區(qū)基因（目的基因）后再重組表達。下列相關(guān)敘述正確的是
A．設(shè)計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列
B．用PCR方法擴增目的基因時需要知道基因的全部序列
C．PCR體系中G—C堿基對含量將影響使DNA解鏈的所需溫度
D．PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶
6．用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進行擴增，設(shè)計了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，x為某限制酶識別序列。擴增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的
A． B．
C． D．
7．用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜。其中：1號為DNA標準樣液（Marker），10號為蒸餾水，PCR過程中加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析不合理的是
A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250~500 bp之間
B．3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C．9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株
D．10號可確定反應(yīng)體系等對結(jié)果沒有干擾
8．根據(jù)某基因上游和下游的堿基序列，設(shè)計合成了用于該基因PCR的兩段引物（單鏈DNA)。引物與該基因變性DNA(單鏈DNA)結(jié)合為雙鏈DNA的過程稱為復(fù)性。下圖是兩引物的Tm（引物熔解溫度，即50%的引物與其互補序列形成雙鏈DNA分子時的溫度）測定結(jié)果，下列敘述錯誤的是
A．通常引物1和引物2不能有堿基互補配對關(guān)系
B．兩引物分別是子鏈延伸的起點，并可以反復(fù)利用
C．若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同，推測引物2的GC含量較高
D．復(fù)性所需溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素
9．以下為形成cDNA過程和PCR擴增過程示意圖。據(jù)圖分析，下列說法正確的是
A．④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合
B．催化①過程的酶是DNA聚合酶
C．催化①②⑤過程的酶都必須能耐高溫
D．過程③需要解旋酶
10．在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進行分析，PCR技術(shù)能快速擴增DNA片段，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題。
（1）在相應(yīng)的橫線上寫出引物Ⅱ，并在復(fù)性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。__________________。
（2）在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。________。
（3）若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記，請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點：________，循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為________。
（4）PCR反應(yīng)過程的前提條件是________，PCR技術(shù)利用了DNA的________原理解決了這個問題。
（5）在對樣品DNA分析過程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是___________________。
11．（2018·江蘇卷）為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個堿基對），利用基因工程大量制備琢α-淀粉酶，實驗流程見下圖。請回答下列問題：
（1）利用PCR技術(shù)擴增α-淀粉酶基因前，需先獲得細菌的＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（2）為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的＿＿＿＿端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）進行擴增時，反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定，下列選項中＿＿＿＿＿＿＿的設(shè)定與引物有關(guān)，＿＿＿＿＿＿＿＿的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。（填序號）
①變性溫度 ②退火溫度 ③延伸溫度 ④變性時間 ⑤退火時間 ⑥延伸時間
（4）下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：
圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含＿＿＿個密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測虛線框后的第一個密碼子最多有＿＿種。
（5）獲得工程菌表達的α-淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結(jié)果如下：
根據(jù)上述實驗結(jié)果，初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為＿＿＿＿＿＿。
12． (2016·天津卷)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的醫(yī)用價值，只能從人血漿中制備。下圖是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA（rHSA）的兩條途徑。
（1）獲取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成總cDNA，然后以cDNA為模板，采用PCR技術(shù)擴增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴增方向，請用箭頭在方框內(nèi)標出另一條引物的位置及擴增方向。

（2）啟動子通常具有物種及組織特異性，構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體，需要選擇的啟動子是_____________（填寫字母，單選）。
A．人血細胞啟動子 B．水稻胚乳細胞啟動子 C．大腸桿菌啟動子 D．農(nóng)桿菌啟動子
（3）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞的過程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是_____________________。
（4）人體合成的初始HSA多肽，需要經(jīng)過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結(jié)構(gòu)才能有活性。與途徑II相比，選擇途徑I獲取rHSA的優(yōu)勢是_______________________________________。
（5）為證明rHSA具有醫(yī)用價值，須確認rHSA與_________________的生物學(xué)功能一致。
條件
組分
作用
模板
DNA的兩條單鏈
提供復(fù)制的模板
原料[來源:學(xué)§科§網(wǎng)Z§X§X§K]
四種脫氧核苷酸
合成DNA子鏈的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
xxk.Cm][來源:學(xué)科打開DNA雙螺旋
催化合成DNA子鏈
能量
Z ATP
為解螺旋和合成子鏈供能
引物
RNA
為DNA聚合酶提供合成的3’端起點
緩沖液
50 mml/LNa2HPO4-KH2PO4
50 mml/LTris-HCl
50 mml/LGly-NaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相對活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8
1．【答案】B
【解析】PCR中解旋是通過高溫進行的，故甲過程高溫使DNA變性解旋，該過程不需要解旋酶的作用，A正確；丙過程用到的酶為耐高溫的DNA聚合酶，在高溫下不會失活，因此在PCR擴增時不需要再添加，B錯誤；如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記，循環(huán)3次后，形成的DNA分子為8個，而含有15N標記的DNA分子為2個，故在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占25%，C正確；PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變，D正確。
2．【答案】B
3．【答案】B
【解析】引物越短，PCR出來的非目標DNA就越多，A正確；適溫延伸過程中，不需要提供ATP，B錯誤；引物中G/C含量越高，則DNA模板中G/C的含量也高，高溫變性的溫度就越高，退火溫度也越高，C正確；PCR技術(shù)的原理是DNA復(fù)制，根據(jù)DNA分子半保留復(fù)制特點可知，共有2n-1對引物參與子代DNA分子的合成，D正確。
4．【答案】C
【解析】PCR技術(shù)是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，能以少量DNA為模板，在短時間內(nèi)復(fù)制出大量的DNA，A正確；PCR技術(shù)需要模板DNA，且反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，B正確；每擴增一次溫度發(fā)生95℃→55℃→72℃變化，C錯誤；應(yīng)用PCR技術(shù)與DNA分子雜交技術(shù)可以檢測基因突變，D正確。
5．【答案】C
【解析】設(shè)計擴增目的基因的引物時，要考慮表達載體相關(guān)序列，從而保證目的的基因能與表達載體相連接及正常表達，A錯誤；用PCR方法擴增目的基因的前提是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，因此不需要知道基因的全部序列，B錯誤；在每個雙鏈DNA分子中，堿基對A與T之間有2個氫鍵，C與G之間有3個氫鍵，且DNA分子含有的氫鍵數(shù)越多，其熱穩(wěn)定性就越高，因此PCR體系中G—C堿基對含量將影響使DNA解鏈的所需溫度，C正確；PCR體系中一定要添加耐高溫的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，而從受體細胞內(nèi)提取的DNA聚合酶不耐高溫，D錯誤。
6．【答案】D
【解析】利用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進行擴增，當引物與母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，子鏈延伸的方向總是從5′端到3′端，據(jù)此依題意和圖示分析可知，A、B、C均錯誤，D正確。
7．【答案】B
8．【答案】B
【解析】通常引物1和引物2不能有堿基互補配對關(guān)系，以免二者結(jié)合，A項正確；兩引物參與構(gòu)成子鏈，不能反復(fù)利用，B項錯誤；若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同，引物2的熔解溫度較高，推測其GC含量較高，C項正確；結(jié)合以上分析可知，復(fù)性所需溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素，D項正確。
9．【答案】A
【解析】分析題圖：圖示為形成cDNA過程和PCR擴增過程示意圖，其中①是由RNA形成單鏈DNA的過程，為逆轉(zhuǎn)錄過程；②是由單鏈DNA合成雙鏈DNA的過程，是DNA分子復(fù)制過程；③④⑤是多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段，其中③是變性、④是復(fù)性、⑤是延伸階段。④為復(fù)性過程，發(fā)生的變化是引物與互補DNA鏈結(jié)合，A正確；①為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，B錯誤；圖中②⑤過程為DNA復(fù)制，這兩個過程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤過程進行的溫度是70～75℃，因此催化該過程的DNA聚合酶能耐高溫，但催化②過程的酶不耐高溫，C錯誤；過程③為高溫解鏈，該過程不需要解旋酶，D錯誤。
10．【答案】（1）5′—G—A—OH(或HO—A—G—5′)
（2）
（3）每個DNA分子各有一條鏈含32P 1/2n
（4）DNA解旋 熱變性
（5）蛋白酶
【解析】（1）由圖可知，引物Ⅱ為5’-G-A-OH。（2）循環(huán)一次后生成的DNA分子如下：。（3）若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記，根據(jù)DNA半保留復(fù)制特點可知，循環(huán)一次后，每個DNA分子各有一條鏈含32P，循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為2/2n+1=1/2n。（4）PCR反應(yīng)過程的前提條件是DNA解旋，PCR技術(shù)利用DNA的熱變性原理解決了這個問題。（5）在對樣品DNA進行分析的過程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，根據(jù)酶的專一性原理，要去除這些組蛋白可加入蛋白酶。
11．【答案】（1）基因組DNA
（2）5’ 使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連
（3）② ⑥
（4）8 13
（5）pH為8.5，緩沖液為50mml/LTris-HCl
12．【答案】（1）總RNA（或mRNA）
（2）B
（3）吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化
（4）水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對初始rHSA多肽進行高效加工
（5）HSA

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