考點(diǎn)一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念
2.基因工程的操作工具
(1)限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱限制酶)
①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。
②作用：識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列并切開特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
③結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶
(3)載體
①作用：攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞。
②種類：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。
③條件 eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(能自我復(fù)制,有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn),有特殊的標(biāo)記基因))
[基礎(chǔ)診斷]
1．E·cli DNA連接酶既能連接平末端，又能連接黏性末端。(選修3 P5正文)(×)
2．質(zhì)粒DNA分子上有特殊的標(biāo)記基因，如四環(huán)素合成基因、氨芐青霉素合成基因等標(biāo)記基因。(選修3 P6正文)(×)
3．在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。(選修3 P6正文)(√)
4．?dāng)y帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。(選修3 P6正文)(√)
[深度拓展]
1．(選修3 P4尋根問底)根據(jù)你所掌握的知識(shí)，你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？
提示：防止外來病原物的侵害，切割外源DNA，保護(hù)自身。
2．(選修3 P6尋根問底)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
提示：不是。DNA連接酶發(fā)揮作用時(shí)不需要模板，連接的是兩個(gè)DNA片段；DNA聚合酶發(fā)揮作用時(shí)需要模板，作用是將單個(gè)核苷酸依次連接到單鏈末端。
1．基因工程的理論基礎(chǔ)
2．與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
eq \a\vs4\al(圍繞基因工程所需工具酶，考查理解能力)
1．(2019·高考江蘇卷改編)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請(qǐng)回答下列問題：
(1)EcRⅤ酶切位點(diǎn)為 eq \(\s\up7(…GAT↓ATC…),\s\d5(…CTA↑TAG…)) ，EcRⅤ酶切出來的線性載體P1為________末端。
(2)用耐高溫的DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。
(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表所示(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________________________、________________。
解析： (1)EcRⅤ從識(shí)別序列的中心軸線處切割，所以產(chǎn)生的末端為平末端。(2)由于載體和目的基因要連接成DNA分子，因此目的基因片段的兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸時(shí)，載體P1的兩端應(yīng)各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸。在DNA連接酶的作用下，可將P2和目的基因連接，形成重組質(zhì)粒P3。(3)重組質(zhì)粒P3上有完整的氨芐青霉素抗性基因，所以含有重組質(zhì)粒P3的菌落在無抗生素和添加氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長，而在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長，所以應(yīng)選擇的是B類菌落。A類菌落在添加氨芐青霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素＋四環(huán)素的培養(yǎng)基上均能生長，說明A類菌落導(dǎo)入了P0。C類菌落在添加氨芐青霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素＋四環(huán)素的培養(yǎng)基上均不能生長，說明C類菌落未導(dǎo)入質(zhì)粒。
答案： (1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA連接 (3)B A類菌落含有P0 C類菌落未導(dǎo)入質(zhì)粒
eq \a\vs4\al(圍繞載體的作用及特點(diǎn)，考查科學(xué)思維的能力)
2．下列有關(guān)基因工程中載體的說法，正確的是( )
A．在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒
B．所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體
C．質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子
D．作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因
D [在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的，A錯(cuò)誤；具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)、具有標(biāo)記基因的質(zhì)粒才可以作為基因工程中的載體，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA外的環(huán)狀DNA分子，C錯(cuò)誤；作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因，而且能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，D正確。]
3．如圖為某一重組質(zhì)粒示意圖，下列敘述錯(cuò)誤的是( )
A．用限制酶EcRⅤ處理該質(zhì)粒得到的分子共含有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)
B．同時(shí)用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ處理該質(zhì)?？傻玫?個(gè)雙鏈DNA片段
C．在獲得目的基因時(shí)應(yīng)該使用的限制酶是BamHⅠ
D．將受體細(xì)胞培養(yǎng)于含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，可篩選出含有目的基因的細(xì)胞
C [圖中質(zhì)粒含有限制酶EcRⅤ的2個(gè)切割位點(diǎn)，因此用限制酶EcRⅤ處理該質(zhì)粒可得到2個(gè)線性DNA分子，每個(gè)線性DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，共含有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A正確；用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ在圖中共含有3個(gè)切點(diǎn)，因此同時(shí)用限制酶EcRⅤ和BamHⅠ處理該質(zhì)?？傻玫?個(gè)雙鏈DNA片段，B正確；用限制酶BamHⅠ切割會(huì)破壞目的基因，因此在獲得目的基因時(shí)不應(yīng)該使用的限制酶BamHⅠ，C錯(cuò)誤；由圖可知，標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因，因此將受體細(xì)胞培養(yǎng)于含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，可篩選出含有目的基因的細(xì)胞，D正確。]
考點(diǎn)二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的獲取
(1)從基因文庫中獲取目的基因
(2)人工合成目的基因
如果基因比較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。
①化學(xué)合成法
②反轉(zhuǎn)錄法
(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
①原理：DNA雙鏈復(fù)制。
②條件：模板DNA、引物、游離的dNTP(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
③過程
eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(變性：90～95 ℃，DNA解鏈,↓,復(fù)性：55～60 ℃，引物與單鏈DNA結(jié)合,↓,延伸：70～75 ℃，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶、（Taq酶）,作用下合成子鏈))
2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
(2)組成
(3)構(gòu)建過程
3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
4.目的基因的檢測(cè)與鑒定
[基礎(chǔ)診斷]
1．基因組文庫包含了某生物的全部基因，部分基因文庫包含某生物部分基因。(選修3 P10正文)(√)
2．基因組文庫和cDNA文庫都可以進(jìn)行物種間的基因交流。(選修3 P10正文)(×)
3．PCR操作過程中，不需要在反應(yīng)體系中加入ATP。(選修3 P10正文)(√)
4．啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于載體DNA的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。(選修3 P11正文)(×)
5．農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。(選修3 P12正文)(√)
[深度拓展]
1．(選修3 P9尋根問底)為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？
提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR直接獲得；如果目的基因序列完全不知，或只知道一段序列，或想獲得許多基因等，往往就需要構(gòu)建基因文庫。
2．(選修3 P15思考與探究2)根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理，你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？若想將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物，理論上應(yīng)該怎么做？
提示：農(nóng)桿菌具有趨化性，農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因是單子葉植物通常不能產(chǎn)生酚類誘導(dǎo)物，有一些能產(chǎn)生誘導(dǎo)物的單子葉植物也可以被農(nóng)桿菌侵染。若想將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物，應(yīng)該選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌都可侵染單子葉植物；加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏。
1．歸納概括PCR技術(shù)的操作原理和過程
(1)PCR原理：DNA復(fù)制原理，即：
(2)PCR反應(yīng)過程
(3)結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。
2．基因組文庫與cDNA文庫的比較
eq \a\vs4\al(圍繞PCR技術(shù)的應(yīng)用，考查科學(xué)思維能力)
1．下列關(guān)于PCR反應(yīng)體系中所加物質(zhì)作用的描述，錯(cuò)誤的是( )
A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成
B．引物使Taq酶能從引物的5′端延伸DNA鏈
C．目標(biāo)DNA母鏈用作DNA復(fù)制的模板
D．dATP可為PCR提供能量和原料
B [通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個(gè)脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復(fù)制時(shí)，引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯(cuò)誤；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，DNA復(fù)制時(shí)兩條鏈均作為復(fù)制的模板，C正確；由于dATP含有特殊化學(xué)鍵，可以提供能量，同時(shí)其中的特殊化學(xué)鍵全部斷裂后，形成的腺嘌呤脫氧核苷酸可以作為合成DNA的原料，故dATP可為PCR提供能量和原料，D正確。]
2．春季是皰疹性咽峽炎流行的季節(jié)，這種常見病是由柯薩奇病毒引起的，除了檢測(cè)患者體內(nèi)的抗體，還可以通過RTPCR技術(shù)進(jìn)行明確診斷，該技術(shù)的基本流程如下圖所示，下列敘述錯(cuò)誤的是( )
A．該技術(shù)要避免RNA酶和外源DNA的污染
B．PCR技術(shù)中三組不同的溫度設(shè)置目的不同
C．該技術(shù)還可用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平
D．該技術(shù)中需用到的酶有逆轉(zhuǎn)錄酶、解旋酶、耐高溫的DNA聚合酶等
D [該實(shí)驗(yàn)是通過RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA來檢測(cè)病毒RNA的存在，因此若有RNA酶將RNA水解或者外源DNA的污染就會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)錯(cuò)誤；PCR技術(shù)中不會(huì)用到解旋酶，第一次高溫的目的就是解旋，三個(gè)不同溫度的目的不同，故選D。]
eq \a\vs4\al(圍繞基因工程的操作程序，考查科學(xué)思維能力)
3．(2022·泰安模擬)B基因存在于水稻基因組中，僅在體細(xì)胞和精子中正常表達(dá)，在卵細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄。為研究B基因表達(dá)對(duì)卵細(xì)胞的影響，設(shè)計(jì)并完成了下圖實(shí)驗(yàn)來獲取能夠在卵細(xì)胞中表達(dá)B基因的轉(zhuǎn)基因植株。下列關(guān)于該實(shí)驗(yàn)的敘述，不正確的是( )
A．B基因在水稻卵細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄，可能是B基因的啟動(dòng)子在卵細(xì)胞中無法啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄
B．可利用水稻體細(xì)胞和精子中的RNA構(gòu)建cDNA文庫，從中獲得B基因中編碼蛋白的序列
C．過程②在培養(yǎng)基中應(yīng)加入卡那霉素以檢測(cè)TDNA是否整合到水稻細(xì)胞染色體DNA上
D．在鑒定和篩選轉(zhuǎn)基因植株時(shí)，可以檢測(cè)加入熒光素的該植株卵細(xì)胞中是否發(fā)出熒光
C [啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合的部位，其能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，所以B基因在水稻卵細(xì)胞中不能轉(zhuǎn)錄，可能是B基因的啟動(dòng)子在水稻卵細(xì)胞中無法啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，A正確；目的基因的獲取途徑之一是從基因文庫中獲得，即從基因組文庫或cDNA文庫中獲得，B正確；過程②農(nóng)桿菌感染水稻愈傷組織，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的TDNA可整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，檢測(cè)TDNA 是否整合到水稻細(xì)胞染色體DNA上，應(yīng)該用DNA分子雜交法，C錯(cuò)誤；由于基因表達(dá)載體上有Luc基因，其表達(dá)的熒光素酶能催化熒光素產(chǎn)生熒光，因此在鑒定和篩選轉(zhuǎn)基因植株時(shí)，可以檢測(cè)加入熒光素的該植株卵細(xì)胞中是否發(fā)出熒光，D正確。]
4．(2021·全國高考乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA鏈接酶有E·cli DNA連接酶和T4DNA連接酶。如圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA連接酶連接。如圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。
(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能____________________；質(zhì)粒DNA分子上有____________________便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)。利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是________________________。
(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指_________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)E·cli DNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接黏性末端，另外T4DNA連接酶還可以連接平末端，但連接平末端時(shí)的效率比較低。據(jù)圖可知，EcRⅠ和PstⅠ切割DNA后產(chǎn)生的是黏性末端，SmaⅠ和EcRⅤ切割DNA后產(chǎn)生的是平末端。因此圖中EcRⅠ、PstⅠ酶切割后的DNA片段可以用E·cli DNA連接酶連接，圖中EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅤ酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)目的基因片段與質(zhì)粒載體片段均是DNA片段，因此兩片段之間通過核苷酸形成磷酸二酯鍵連接。因此DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制、穩(wěn)定存在；質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，通過不同的限制酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割，以便插入外源DNA。標(biāo)記基因的作用是為了鑒定宿主細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。若質(zhì)粒DNA分子上存在某種抗生素的抗性基因，則可以用含該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，若該宿主細(xì)胞含有該質(zhì)粒，則宿主細(xì)胞可以存活，從而篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子位于目的基因首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA。
答案： (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、EcRⅤ (2)磷酸二酯鍵 (3)自我復(fù)制、穩(wěn)定存在 一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn) 用含該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞
(4)轉(zhuǎn)錄開始的地方，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)
考點(diǎn)三 基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程
1．基因工程的應(yīng)用
(1)植物基因工程：培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物、抗病轉(zhuǎn)基因植物和抗逆轉(zhuǎn)基因植物；利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)；利用植物生產(chǎn)藥物等。
(2)動(dòng)物基因工程：用于提高動(dòng)物生長速度；用于改善畜產(chǎn)品品質(zhì)；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。
(3)基因工程藥物
①來源：利用轉(zhuǎn)基因的“工程菌”來生產(chǎn)的藥物。
②種類：細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素等。
(4)基因治療
①概念：把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能， 從而達(dá)到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段。
②類型：體外基因治療和體內(nèi)基因治療。
2．蛋白質(zhì)工程
(1)概念
基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。
手段：基因修飾或基因合成。
結(jié)果：對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造出新的蛋白質(zhì)。
(2)基本途徑
[基礎(chǔ)診斷]
1．利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因?yàn)閷⑷说难灏椎鞍谆驅(qū)肓藙?dòng)物的乳腺細(xì)胞中。(選修3 P21正文)(×)
2．基因治療是把不正常基因改造成正?；颍拐；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能。(選修3 P23正文)(×)
3．體外基因治療都是先從病人體內(nèi)獲得某種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)。(選修3 P24正文)(√)
[深度拓展]
(選修3 P21正文)閱讀P21教材中用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物的一段內(nèi)容，回答下列問題：
(1)用動(dòng)物乳腺作為反應(yīng)器，生產(chǎn)高價(jià)值的蛋白質(zhì)比工廠化生產(chǎn)的優(yōu)越之處有哪些？
提示：產(chǎn)量高、質(zhì)量好、成本低。
(2)如何操作才能實(shí)現(xiàn)目的基因的產(chǎn)物在乳腺產(chǎn)生？
提示：要在編碼目的蛋白質(zhì)的基因序列前加上在乳腺組織中特意表達(dá)的啟動(dòng)子來構(gòu)建基因表達(dá)載體。
(3)用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的操作過程是怎樣的？
提示：獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體(在目的基因前加特意表達(dá)的啟動(dòng)子)→顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵中→形成胚胎→將胚胎送入母體→發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
1．比較體外基因治療與體內(nèi)基因治療
2.蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系
eq \a\vs4\al(圍繞基因工程的應(yīng)用，考查綜合運(yùn)用能力)
1．(2020·高考全國卷Ⅲ)W是一種具有特定功能的人體蛋白質(zhì)。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應(yīng)器的研究思路，制備一種膀胱生物反應(yīng)器來獲得W，基本過程如圖所示。
回答下列問題：
(1)步驟①中需要使用的工具酶有_________________________________。
步驟②和③所代表的操作分別是________和________。 步驟④稱為________。
(2)與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)W的優(yōu)勢(shì)在于不受轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的________ (答出2點(diǎn)即可)的限制。
(3)一般來說，在同一動(dòng)物個(gè)體中， 乳腺上皮細(xì)胞與膀胱上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中染色體DNA所含的遺傳信息________(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________。
(4)從上述流程可知，制備生物反應(yīng)器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技術(shù)有______________________ (答出2點(diǎn)即可)。
解析： 本題考查基因工程及胚胎工程的相關(guān)內(nèi)容。(1)題圖中步驟①表示構(gòu)建重組表達(dá)載體，所用工具酶為限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。步驟②中將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的操作方法是顯微注射，步驟③為受精卵經(jīng)早期胚胎培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎，步驟④為胚胎移植。(2)乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的蛋白質(zhì)在乳汁中，只有育齡期的雌性動(dòng)物能分泌乳汁，而膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)的蛋白質(zhì)在尿液中，只要?jiǎng)游锱拍蚣纯?，故無性別、年齡限制。(3)同一動(dòng)物個(gè)體的兩種上皮細(xì)胞都是由受精卵分裂、分化而來的體細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相同。(4)胚胎工程的主要技術(shù)包括體外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)等。
答案： (1)限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶 顯微注射 早期胚胎培養(yǎng) 胚胎移植 (2)性別、年齡 (3)相同 兩種上皮細(xì)胞都是體細(xì)胞，且來源于同一個(gè)受精卵 (4)體外受精、胚胎移植
eq \a\vs4\al(圍繞蛋白質(zhì)工程，考查科學(xué)思維)
2．(2019·海南卷)人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生某種具有臨床價(jià)值的蛋白質(zhì)(Y)，該蛋白質(zhì)由一條多肽鏈組成。目前可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)Y?；卮鹣铝袉栴}：
(1)若要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取________作為模板，在________催化下合成cDNA，再利用________技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。
(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。若將上述所得Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的________中，得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，則可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將該基因?qū)肽撤N植物的葉肉細(xì)胞中。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說明Y的基因已經(jīng)______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低溫條件下保存。假設(shè)將Y的第6位氨基酸甲改變?yōu)榘被嵋铱商岣咂錈岱€(wěn)定性，若要根據(jù)蛋白質(zhì)工程的原理對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，具體思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)由于人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)Y，要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，利用四種游離的脫氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技術(shù)(體外擴(kuò)增DNA的技術(shù))在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，T-DNA可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故需要Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA中得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，把含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，再讓含目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物的葉肉細(xì)胞。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說明Y的基因已經(jīng)整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上。(3)蛋白質(zhì)工程需要從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推出相應(yīng)的氨基酸序列，找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，故對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，需要找到第6位氨基酸甲對(duì)應(yīng)的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲對(duì)應(yīng)的堿基替換為氨基酸乙的堿基。
答案： (1)mRNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR (2)T-DNA 整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上 (3)找到第6位氨基酸甲對(duì)應(yīng)的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲對(duì)應(yīng)的堿基替換為氨基酸乙的堿基
考點(diǎn)四 DNA的粗提取與鑒定
1．實(shí)驗(yàn)原理
2．操作流程
[基礎(chǔ)診斷]
1．用不同濃度的NaCl溶液反復(fù)溶解與析出DNA可去除蛋白質(zhì)。(選修1 P55正文)(√)
2．提取DNA時(shí)，如果沒有雞血材料，可用豬血代替。(選修1 P55正文)(×)
3．在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，將絲狀物溶解在2 ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍(lán)色。(選修1 P56正文)(×)
[深度拓展]
下圖為“DNA粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)操作，請(qǐng)仔細(xì)觀察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸餾水，其目的一樣嗎？
提示：不一樣。①是使雞血細(xì)胞吸水漲破釋放出核物質(zhì)；④是稀釋NaCl溶液使其濃度接近0.14 ml/L，去除溶于低濃度NaCl溶液的雜質(zhì)。
(2)操作②中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精的目的是什么？此時(shí)攪拌要注意什么？
提示：②中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的雜質(zhì)，這時(shí)攪拌要沿一個(gè)方向，輕緩地進(jìn)行。
(3)操作③中的黏稠物是如何獲取的？加入2 ml/L NaCl的目的是什么？
提示：黏稠物是經(jīng)過單層紗布過濾獲得的； 加入2 ml/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
1．DNA和蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的比較
2．DNA的粗提取與鑒定中的“2、3、4”
3．歸納DNA粗提取中的注意事項(xiàng)
(1)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作材料。
(2)加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(3)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。
(4)提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA進(jìn)一步提純時(shí)，選用冷卻的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。
eq \a\vs4\al(明確DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)原理)
1．(2019·江蘇高考)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C．預(yù)冷的乙醇可用來進(jìn)一步純化粗提取的DNA
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱
A [哺乳動(dòng)物(如兔)成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核和細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)基本不含DNA，故兔血不宜作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料，A錯(cuò)誤；DNA析出過程中，攪拌要輕柔且沿著一個(gè)方向，以防止DNA斷裂，B正確；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入適量預(yù)冷的乙醇溶液，會(huì)使DNA析出，從而進(jìn)一步提純DNA，C正確；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱數(shù)分鐘，溶液出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。]
eq \a\vs4\al(掌握DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)操作過程)
2．(2020·石家莊質(zhì)檢)如圖為“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)操作?；卮鹣铝袉栴}：
(1)圖中實(shí)驗(yàn)材料A可以是______________等，研磨前加入的B應(yīng)該是________________。
(2)通過上述所示步驟得到濾液C后， 再向?yàn)V液中加入2 ml/L的NaCl溶液的目的是________________，再過濾得到濾液D，向?yàn)V液D中加入蒸餾水的目的是________________。
(3)在“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2 mL的4種溶液中，經(jīng)攪拌后過濾，獲得下表所示的4種濾液，含DNA最少的是濾液________。
(4)DNA鑒定的原理是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： (1)選用洋蔥、菜花等植物材料提取DNA時(shí)，要在切碎的材料中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分地?cái)嚢韬脱心ァ?2)DNA在2 ml/L的NaCl溶液中的溶解度較高，而在0.14 ml/L的NaCl溶液中的溶解度最小，向?yàn)V液中加入2 ml/L 的NaCl溶液可以使DNA溶解，過濾除去不溶的雜質(zhì)；向?yàn)V液中加入蒸餾水可降低NaCl溶液的濃度，使DNA析出，除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。(3)DNA不溶于冷酒精，所以含DNA最少的是濾液H。(4)鑒定DNA 的原理是在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。
答案： (1)洋蔥、菜花 洗滌劑和食鹽 (2)使DNA溶解 使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 (3)H (4)在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色
1．(2021·全國高考甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測(cè)。為檢測(cè)病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}：
(1)若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是________(用數(shù)字序號(hào)表示)。
(2)操作③中使用的酶是_______。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、______三步，其中復(fù)性的結(jié)果是________________________________________。
(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與_____________特異性結(jié)合。
(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指__________________________________________。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
解析： (1)利用PCR技術(shù)檢測(cè)病原菌的步驟是：采集病人組織樣本→從病人組織樣本中提取DNA→利用PCR擴(kuò)增DNA片段→分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，即④②③①。(2)利用PCR擴(kuò)增DNA片段需要耐高溫的DNA聚合酶。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性的結(jié)果是引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合。(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物必須與病原菌DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)。(4)PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。
答案： (1)④②③① (2)耐高溫的DNA聚合酶 延伸 引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合 (3)病原菌DNA (4)在生物體外大量快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)
2．(2019·全國卷Ⅰ)基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀╛_______________和________________。
(2)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是________________。上述兩個(gè)解鏈過程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(3)目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析： 本題考查基因文庫和PCR過程等知識(shí)，意在考查考生的識(shí)記能力和理解能力。(1)基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫。(2)生物體細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制開始時(shí)是利用解旋酶進(jìn)行解旋的，而在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，則是通過加熱至90～95 ℃進(jìn)行解旋的，二者都破壞了堿基對(duì)之間的氫鍵。(3)在PCR過程中，要加熱至90～95 ℃，所以使用熱穩(wěn)定性高的Taq酶，而不使用在高溫下會(huì)失活的大腸桿菌DNA聚合酶。
答案： (1)基因組文庫 cDNA文庫
(2)解旋酶 加熱至90～95 ℃ 氫鍵
(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活
1．PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。其原理是DNA的復(fù)制。
2．PCR的條件有模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)。
3．PCR共包括三步：①高溫變性：DNA解旋過程(PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開)；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。
1．(2022·天津一中模擬)Bt基因即蘇云金芽孢桿菌基因，因其表達(dá)產(chǎn)物Bt毒蛋白具有殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)殺蟲基因。如圖為培育轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉幼苗的基本操作過程，請(qǐng)分析回答：
(1)Bt基因可從構(gòu)建的Bt基因組文庫中獲取，也可以從其cDNA文庫中獲取。從前者獲取的Bt基因__________(填“含有”或“不含有”)啟動(dòng)子。
(2)若利用PCR技術(shù)從cDNA文庫中獲取Bt基因(基因序列未知)，需根據(jù)Bt蛋白中的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，引物的序列可以有多種，原因是__________________________________。在PCR體系中需加入其中的________(填“全部”“任意1種”或“其中2種”)引物。若Bt基因序列已知，則引物的序列通常為____________種。
(3)在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，為了方便篩選含有目的基因的細(xì)胞，作為運(yùn)載體的Ti質(zhì)粒應(yīng)含有________，Ti質(zhì)粒中能幫助目的基因整合到宿主細(xì)胞染色體上的序列稱為______________。
解析： (1)基因組文庫是將生物體內(nèi)的DNA全部提取，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈畈?dǎo)入受體菌形成的，含有啟動(dòng)子，cDNA文庫是由mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，沒有啟動(dòng)子。(2)一種氨基酸可能有多種密碼子，對(duì)應(yīng)生物DNA堿基序列就會(huì)有多種，因此不確定用于PCR的DNA序列，無法確定引物，因此要加入全部可能的引物；如果DNA序列確定，則每條模板鏈需要一種引物，因此是兩種。(3)標(biāo)記基因的作用是鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒可作為載體，能夠幫助目的基因整合到宿主細(xì)胞染色體上的序列成為T-DNA。
答案： (1)含有 (2)一種氨基酸可能有多種密碼子，對(duì)應(yīng)生物DNA堿基序列就會(huì)有多種 全部 2 (3)標(biāo)記基因 T-DNA(可轉(zhuǎn)移DNA)
2．(2021·江蘇調(diào)研)某植物蛋白酶抑制劑Ⅱ基因是重要的抗蟲基因，該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。現(xiàn)利用PCR等技術(shù)擴(kuò)增該基因，具體原理如圖所示，其中①～③表示有關(guān)過程，Ⅰ～Ⅲ表示有關(guān)物質(zhì)。請(qǐng)回答下列問題：
(1)過程①反應(yīng)體系中，需要加入__________種引物，還需加入______________酶，生成雜合鏈物質(zhì)Ⅰ。
(2)利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶催化過程②，使cDNA單鏈左側(cè)末端增加十多個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸序列[AAA(A)n]，其目的是__________________，進(jìn)而利于過程③擴(kuò)增獲得目的基因序列Ⅲ，過程③反應(yīng)體系需要添加的新引物序列是____________________。
(3)與物質(zhì)Ⅲ相比，物質(zhì)Ⅰ化學(xué)組成不同的是____________________________。與過程③相比，過程①中堿基配對(duì)方式的不同之處是____________。
(4)在物質(zhì)Ⅲ的兩端通常還需要增加__________________序列，以便與相應(yīng)的載體重組，再利用__________處理大腸桿菌等，以利于將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，構(gòu)建cDNA文庫。
解析： (1)過程①表示以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成DNA的過程，需要1種引物，且需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。(2)過程②在cDNA末端增加十多個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸序列[AAA(A)n]，其目的是便于設(shè)計(jì)引物，因此在過程③擴(kuò)增獲得目的基因序列Ⅲ時(shí)，反應(yīng)體系需要添加的新引物序列是[TTT(T)n]。(3)據(jù)圖分析可知，物質(zhì)Ⅲ的兩條鏈都是DNA鏈，而物質(zhì)Ⅰ的一條鏈?zhǔn)荄NA鏈、一條鏈?zhǔn)荝NA鏈，因此物質(zhì)Ⅰ化學(xué)組成與Ⅲ相比的不同之處在于物質(zhì)Ⅰ含有核糖和尿嘧啶；且與過程③相比，過程①中特有的堿基配對(duì)方式是U—A。(4)根據(jù)題意分析，過程③表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的過程，因此在目的基因(物質(zhì)Ⅲ)兩端通常還需要增加限制酶識(shí)別序列，以便限制酶的識(shí)別與切割；將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌前，需要先用Ca2＋處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞。
答案： (1)1 逆轉(zhuǎn)錄 (2)便于設(shè)計(jì)引物 TTT(T)n (3)含核糖和尿嘧啶(U) U—A (4)限制酶識(shí)別 Ca2＋
一、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
二、要語必記
1．限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別某種特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子。
2．DNA連接酶的作用部位是磷酸二酯鍵。
3．質(zhì)粒是常用的載體，它是一種小型的雙鏈環(huán)狀DNA分子，具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)及標(biāo)記基因。
4．目的基因的獲取有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成三類方法。
5．基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。
6．目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射技術(shù)，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法。
別名
基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)
原理
基因重組
操作環(huán)境
生物體外
操作水平
分子水平
結(jié)果
獲得符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品
優(yōu)點(diǎn)
克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙；定向改造生物的遺傳性狀
種類
E·cli DNA連接酶
T4DNA連接酶
來源
大腸桿菌
T4噬菌體
特點(diǎn)
只縫合黏性末端
縫合黏性末端
和平末端
作用
恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵
菌落類型
平板類型
A
B
C
無抗生素
＋
＋
＋
氨芐青霉素
＋
＋
－
四環(huán)素
＋
－
－
氨芐青霉素＋四環(huán)素
＋
－
－
限制酶的選擇技巧
(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類。
①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類。
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產(chǎn)生相同的黏性末端。
②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶Sma Ⅰ會(huì)破壞標(biāo)記基因；如果所選酶的切割位點(diǎn)不是一個(gè)，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制 eq \(。,\s\d4( ,))
生物種類
植物
動(dòng)物
微生物
常用方法
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
顯微注射技術(shù)
感受態(tài)細(xì)胞法
受體細(xì)胞
體細(xì)胞
或受精卵
受精卵
原核細(xì)胞
轉(zhuǎn)化過程
將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上→表達(dá)
將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物
Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子
過程
說明
圖解
變性
溫度上升到90 ℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈
復(fù)性
溫度下降到55 ℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合
延伸
溫度上升到72 ℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸
方法
比較
體外基因治療
體內(nèi)基因治療
不同點(diǎn)
途徑
從患者體內(nèi)獲得某種細(xì)胞→體外完成基因轉(zhuǎn)移→篩選、細(xì)胞擴(kuò)增→輸入體內(nèi)
直接向患者體內(nèi)組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因
特點(diǎn)
操作復(fù)雜，但效果可靠
方法較簡單，但效果難以控制
相同點(diǎn)
都是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正缺陷基因，目前兩種方法都處于臨床試驗(yàn)階段
1
研磨液中
攪拌研磨后過濾
濾液E
2
2 ml/L的NaCl溶液中
攪拌后過濾
濾液F
3
0.14 ml/L的NaCl溶液中
攪拌后過濾
濾液G
4
冷卻的95%的酒精溶液中
攪拌后過濾
濾液H
析個(gè)性
第1題本題考查PCR技術(shù)的相關(guān)知識(shí)，關(guān)鍵是分析檢測(cè)病原菌的方法，即PCR試劑盒；第2題基因工程的概念、PCR原理及操作步驟
找共性
兩個(gè)題目都考查PCR的過程及相關(guān)的酶等知識(shí)點(diǎn)

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