浙科版高考生物一輪復(fù)習(xí)作業(yè)58基因工程的原理和技術(shù)含答案

這是一份浙科版高考生物一輪復(fù)習(xí)作業(yè)58基因工程的原理和技術(shù)含答案，共12頁(yè)。
1.(2023浙江嘉興一模)酶具有高效性和專一性,在生物工程中被廣泛使用。下列技術(shù)中沒(méi)有酶的應(yīng)用的是( )
A.制備植物細(xì)胞原生質(zhì)體
B.PCR擴(kuò)增DNA
C.早期囊胚的胚胎分割
D.貼壁生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的解離
2.下列有關(guān)如圖所示的黏性末端的說(shuō)法,錯(cuò)誤的是( )
A.甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重組DNA分子,但甲、丙不能
C.DNA連接酶的作用位點(diǎn)是b處
D.切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段
3.(2024浙江湖州調(diào)研)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因植物,下列敘述錯(cuò)誤的是( )
A.目的基因插入Ti質(zhì)粒的位點(diǎn)是某種限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)
B.若目的基因的序列未知,可以通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)的方法從中獲取
C.采用抗原-抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞中是否表達(dá)
D.植物受體細(xì)胞必須是受精卵細(xì)胞,因其全能性最高
4.(2024浙江寧波模擬)科學(xué)家培育了一種可以生產(chǎn)人血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草。下列敘述正確的是( )
A.要獲得該轉(zhuǎn)基因煙草,首先要從人的成熟紅細(xì)胞內(nèi)獲取目的基因
B.人血紅蛋白基因?qū)霟煵菁?xì)胞可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
C.PCR不能用于鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因
D.該基因轉(zhuǎn)到煙草染色體上使煙草發(fā)生染色體畸變
5.下列有關(guān)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述,正確的是( )
A.向菜花組織中加入蒸餾水并攪拌可釋放核DNA
B.鑒定DNA時(shí),可以使用龍膽紫染液對(duì)DNA進(jìn)行染色
C.向DNA濾液中加入冷酒精緩慢攪拌,可見(jiàn)玻璃棒上有白色絮狀物
D.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)保存好剩余的二苯胺試劑,以備下次實(shí)驗(yàn)時(shí)使用
6.(2023浙江金華一模)研究發(fā)現(xiàn)OsCBL8基因在提高水稻耐受非生物逆境脅迫方面具有重要作用,為研究OsCBL8基因的作用機(jī)理,我們需要通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)該基因進(jìn)行擴(kuò)增,用于后續(xù)研究。關(guān)于PCR反應(yīng),下列敘述正確的是( )
A.通過(guò)PCR獲取目的基因的過(guò)程中,第三輪循環(huán)至少需要消耗4對(duì)引物
B.PCR過(guò)程中Taq DNA聚合酶催化相鄰的游離dNTP之間形成磷酸二酯鍵
C.PCR產(chǎn)物的大小可以直接通過(guò)亞甲基藍(lán)染色進(jìn)行鑒定
D.PCR過(guò)程中要加入緩沖液,一般添加Cu2+來(lái)激活DNA聚合酶
7.(2023浙江杭州二模)PCR技術(shù)是在DNA聚合酶作用下,在體外進(jìn)行DNA大量擴(kuò)增的一種分子生物技術(shù)。下列敘述正確的是( )
A.雙鏈DNA在高溫下氫鍵和磷酸二酯鍵斷裂形成2條DNA單鏈
B.溫度降低后,單鏈DNA和引物結(jié)合的部分堿基序列相同
C.以2條DNA單鏈為模板,以4種NTP為原料,經(jīng)耐高溫酶在高溫下合成2個(gè)新的DNA
D.設(shè)置PCR儀的溫度進(jìn)行反應(yīng)可重復(fù)循環(huán)多次,DNA呈指數(shù)式擴(kuò)增
B組 素能培優(yōu)
8.(2023浙江杭州第二次聯(lián)考)研究人員用EcRⅠ和SmaⅠ兩種限制酶處理某DNA分子,圖1為EcRⅠ切割該DNA分子后的結(jié)果;圖2是酶切后的凝膠電泳圖譜,其中1號(hào)泳道是DNA Marker,2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)分別是EcRⅠ單獨(dú)處理、SmaⅠ單獨(dú)處理、兩種酶共同處理后的電泳結(jié)果。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是( )
圖1
圖2
A.據(jù)圖1可知EcRⅠ的識(shí)別序列為-GAATTC-,切割位點(diǎn)在G和A之間
B.據(jù)圖2可知瓊脂糖凝膠的加樣孔在B端,且連著電泳槽的負(fù)極
C.據(jù)圖2可知該DNA分子最可能是含1 000個(gè)堿基對(duì)的環(huán)狀DNA
D.據(jù)圖2可知該DNA分子中兩種限制酶的酶切位點(diǎn)各有一個(gè)
9.(2024浙江北斗新盟聯(lián)考)Bt基因?yàn)樘K云金芽孢桿菌基因,因其表達(dá)產(chǎn)物Bt毒蛋白具有殺蟲(chóng)效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最為廣泛的殺蟲(chóng)基因。以下為培育轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉幼苗的基本操作過(guò)程,請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題。
(1)目的基因的獲取。從基因組文庫(kù)中獲取目的基因,建立基因組文庫(kù)需用到 酶;也可以從cDNA文庫(kù)中獲取,從其中獲取的Bt基因因?yàn)槿鄙? 而不利于其在受體細(xì)胞中表達(dá);還可以提取 作為模板,通過(guò)PCR技術(shù)獲得。
(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體?；虮磉_(dá)載體應(yīng)具有 ,有利于整合Bt基因。為了方便篩選含有Bt基因的細(xì)胞以及使Bt基因能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定存在細(xì)胞中,作為表達(dá)載體應(yīng)含有 及 。
(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞,將 的農(nóng)桿菌與棉花的愈傷組織細(xì)胞混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化,影響轉(zhuǎn)化效率的因素有 (A.重組Ti質(zhì)粒大小 B.愈傷組織的生理狀態(tài) C.培養(yǎng)基的物理性質(zhì) D.農(nóng)桿菌的活性)。然后用 處理以去除農(nóng)桿菌及篩選含有目的基因的愈傷組織細(xì)胞。也可將愈傷組織細(xì)胞放在較高滲透壓甘露醇溶液內(nèi),通過(guò)機(jī)械法或酶解法獲得 ,采用 技術(shù)將外源基因?qū)爰?xì)胞。
(4)檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物?？芍苽? 作為基因探針,利用 技術(shù)檢測(cè)棉花細(xì)胞中是否存在Bt基因。利用 作為抗原,制備單抗來(lái)檢測(cè)Bt基因是否表達(dá)。
10.(2023浙江杭州第二次聯(lián)考)草甘膦是一種非選擇性除草劑,殺死雜草的同時(shí)也殺死農(nóng)作物。它與植物體內(nèi)的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)結(jié)構(gòu)相似,可與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶,阻止PEP轉(zhuǎn)化,影響植物細(xì)胞正常代謝。我國(guó)科學(xué)家從草甘膦施用土壤中的某微生物體內(nèi)獲取GR79基因(草甘膦抗性基因),并將其導(dǎo)入植物體細(xì)胞中獲得抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物。據(jù)圖回答下列問(wèn)題。
注:BamH Ⅰ、PstⅠ、XhⅠ為識(shí)別不同序列的限制酶。
(1)GR79基因發(fā)揮抗草甘膦作用的機(jī)理可能是 。
從分離得到的某土壤微生物體內(nèi)獲取含有GR79基因的質(zhì)粒,并將其保存在某細(xì)菌群體(受體菌)中,各個(gè)受體菌分別含有該微生物的不同的基因,這些受體菌群中該微生物的所有DNA序列克隆的匯總,稱為 。
(2)據(jù)圖推測(cè),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增GR79基因時(shí),需設(shè)計(jì)能與該基因兩條模板鏈3'端 的引物;同時(shí)為構(gòu)建該基因表達(dá)載體,需在引物1和引物2的 端加上限制酶 的識(shí)別序列。
(3)實(shí)驗(yàn)中常采用 法將GR79基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物受體細(xì)胞;為避免該基因在近緣農(nóng)作物中傳播,可將其導(dǎo)入植物受體細(xì)胞的 ;除溫度、酸堿度等環(huán)境因素外,影響該基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞成功率的因素有 。
(4)為檢測(cè)GR79基因是否導(dǎo)入植物體細(xì)胞,可在培養(yǎng)基中添加 篩選含該基因的受體細(xì)胞;也可利用 技術(shù)更加精準(zhǔn)地進(jìn)行檢測(cè),若待檢DNA中含有該基因,則會(huì)發(fā)現(xiàn)硝酸纖維素膜上會(huì)出現(xiàn) 。
(5)經(jīng)檢測(cè),科研人員發(fā)現(xiàn)部分獲得GR79基因的植物幼苗不具有抗草甘膦的能力,原因可能是 。
11.(2023浙江嘉興一模)水稻是我國(guó)主要糧食作物,水稻產(chǎn)量關(guān)乎我國(guó)糧食安全。育種學(xué)家采用針刺法對(duì)水稻種子胚生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理,顯著縮短了育種時(shí)間。技術(shù)路線如下圖。
回答下列問(wèn)題。
(1)野生農(nóng)桿菌具有利福平抗性,不具有卡那霉素抗性。絕大部分細(xì)菌無(wú)利福平抗性。在篩選含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌過(guò)程中,需在固體平面培養(yǎng)基中添加利福平和卡那霉素,添加利福平的目的是 ,添加卡那霉素的目的是 。培養(yǎng)48 h后,挑取單菌落,接種到 培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
(2)胚生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞是胚芽中的細(xì)胞。用穿刺針蘸取經(jīng)篩選獲得的重組農(nóng)桿菌菌液,對(duì)萌發(fā)初期的水稻種子胚生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行針刺轉(zhuǎn)化操作。相對(duì)于傳統(tǒng)的用水稻植株體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法,針刺轉(zhuǎn)化法的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需經(jīng)歷 過(guò)程,胚可以直接發(fā)育成幼苗,縮短了培育時(shí)間。
(3)已知目的基因長(zhǎng)度為754 bp,采用PCR結(jié)合電泳的方法檢測(cè)葉肉細(xì)胞中是否含有目的基因。在提取DNA過(guò)程中需加入EDTA,EDTA的作用是 ,防止核DNA被酶解。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,結(jié)果異常,如圖所示,可能的原因是PCR過(guò)程中的引物序列存在 的問(wèn)題。
12.(2023浙江湖州教學(xué)質(zhì)量檢測(cè))野生型黑麥草細(xì)胞壁中較高的木質(zhì)素含量會(huì)降低其作為青儲(chǔ)飼料的品質(zhì)。D蛋白是催化木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶,某研究小組通過(guò)構(gòu)建含D基因部分序列正、反向片段的表達(dá)干擾載體(如下圖所示),在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA分子,誘導(dǎo)D基因的mRNA持續(xù)降解,培育得到低木質(zhì)素含量的黑麥草。
表達(dá)干擾載體局部示意圖
(1)D基因的正、反向目的片段的克隆:提取野生型黑麥草葉片全部mRNA, 成cDNA。根據(jù)cDNA序列選取合適的片段,分別設(shè)計(jì)正、反向目的片段的上下游引物,正向片段和反向片段引物的擴(kuò)增序列 (填“相同”或“不同”),酶切位點(diǎn) (填“相同”或“不同”),以使目的片段定向插入載體的特定位置。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) ,切下目的條帶回收后與載體連接,形成克隆載體以用于正、反目的片段的擴(kuò)增。
(2)構(gòu)建D基因的表達(dá)干擾載體:
①對(duì)含有正向片段的克隆載體和反向片段的克隆載體分別進(jìn)行雙酶切,將回收片段與經(jīng)相同酶切的中間載體用 酶進(jìn)行連接,獲得含有干擾片段的重組中間載體;為使干擾片段能在受體細(xì)胞中復(fù)制,中間載體需有 。
②將干擾片段和超表達(dá)啟動(dòng)子插入Ti質(zhì)粒的 得到D基因的表達(dá)干擾載體,插入超表達(dá)啟動(dòng)子的目的是 。
(3)導(dǎo)入和培養(yǎng):將D基因的表達(dá)干擾載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌。黑麥草愈傷組織在菌液中浸沒(méi)5 min,先置于無(wú)菌濾紙上吸去多余的菌液,再轉(zhuǎn)入無(wú)菌水浸潤(rùn)的濾紙上共培養(yǎng)3 d,共培養(yǎng)的目的是 。篩選得到的愈傷組織經(jīng) 過(guò)程,培育得到再生植株。
(4)鑒定和篩選:對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與 植株進(jìn)行木質(zhì)素含量測(cè)定與分析,篩選保留木質(zhì)素含量顯著 的植株。
答案：
1.C 制備植物細(xì)胞原生質(zhì)體可以使用纖維素酶和果膠酶分解細(xì)胞壁,A項(xiàng)不符合題意;PCR擴(kuò)增DNA需要耐高溫的DNA聚合酶,B項(xiàng)不符合題意;用機(jī)械方法將早期囊胚進(jìn)行胚胎分割,不能通過(guò)酶解法實(shí)現(xiàn),C項(xiàng)符合題意;貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞系的解離可以使用胰蛋白酶將細(xì)胞分散開(kāi),D項(xiàng)不符合題意。
2.C 據(jù)圖可知,切割產(chǎn)生甲、乙、丙黏性末端的限制酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)分別是、、,即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的,A項(xiàng)正確。甲、乙黏性末端可相互配對(duì),所以甲、乙可以形成重組DNA分子;甲、丙黏性末端不能相互配對(duì),所以甲、丙無(wú)法形成重組DNA分子,B項(xiàng)正確。DNA連接酶可以恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵,而b處是氫鍵,C項(xiàng)錯(cuò)誤。甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段為,其中沒(méi)有切割產(chǎn)生甲的限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn),所以切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段,D項(xiàng)正確。
3.D 植物受體細(xì)胞可以是植物的受精卵,也可以是體細(xì)胞,D項(xiàng)錯(cuò)誤。
4.B 人的成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核,無(wú)法從中獲取目的基因,A項(xiàng)錯(cuò)誤;為使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá),應(yīng)將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上,再采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法使目的基因插入煙草細(xì)胞中的染色體DNA上,B項(xiàng)正確;鑒定篩選時(shí),通過(guò)PCR技術(shù)可以檢測(cè)目的基因是否插入了受體細(xì)胞染色體DNA上,也可以檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,C項(xiàng)錯(cuò)誤;該基因轉(zhuǎn)到煙草染色體上,使控制不同性狀的基因重新組合,屬于基因重組,D項(xiàng)錯(cuò)誤。
5.C 植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁,向菜花組織中加入蒸餾水并不能使細(xì)胞吸水漲破,A項(xiàng)錯(cuò)誤;在沸水浴的條件下,DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色,B項(xiàng)錯(cuò)誤;DNA不溶于95%的冷酒精,向DNA濾液中加入冷酒精緩慢攪拌,可見(jiàn)玻璃棒上有白色絮狀物析出,C項(xiàng)正確;二苯胺試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用,D項(xiàng)錯(cuò)誤。
6.A 在PCR反應(yīng)體系中,如果擴(kuò)增1次,需要2個(gè)引物;擴(kuò)增第2次,需要4個(gè)引物;擴(kuò)增第3次,需要8個(gè)引物;因此通過(guò)PCR獲取目的基因的過(guò)程中,第三輪循環(huán)至少需要消耗8個(gè)(即4對(duì))引物,A項(xiàng)正確。dNTP有三個(gè)磷酸基團(tuán),dNMP只有一個(gè)磷酸基團(tuán),為脫氧核苷酸,延伸時(shí),在Taq DNA聚合酶催化下,dNMP作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到3'端,相鄰的dNMP間形成磷酸二酯鍵,B項(xiàng)錯(cuò)誤。PCR產(chǎn)物鑒定常用的方法是瓊脂糖凝膠電泳鑒定,C項(xiàng)錯(cuò)誤。PCR過(guò)程中要加入緩沖液,一般添加Mg2+來(lái)激活DNA聚合酶,D項(xiàng)錯(cuò)誤。
7.D 雙鏈DNA在高溫下解旋即使得DNA雙鏈打開(kāi),破壞的是堿基對(duì)之間的氫鍵,磷酸二酯鍵沒(méi)有斷裂,A項(xiàng)錯(cuò)誤;當(dāng)溫度降低時(shí),引物與模板末端結(jié)合,在DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最終合成2個(gè)DNA分子,此過(guò)程以4種脫氧核苷酸為原料,遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,單鏈DNA和引物結(jié)合的部分堿基序列互補(bǔ),B項(xiàng)錯(cuò)誤;以2條DNA單鏈為模板,以4種dNTP為原料,在耐高溫DNA聚合酶作用下合成2個(gè)新的DNA,C項(xiàng)錯(cuò)誤;PCR的反應(yīng)步驟為目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合,然后在熱穩(wěn)定DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸,如此重復(fù)循環(huán),因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍,即呈指數(shù)形式擴(kuò)增,D項(xiàng)正確。
8.B 圖1中DNA雙鏈片段被切割成兩段,該片段序列是-GAATTC-,斷開(kāi)的部位是在G和A堿基之間,A項(xiàng)正確;相對(duì)分子質(zhì)量大小會(huì)影響物質(zhì)在電泳時(shí)的遷移速率,DNA片段分子量越大,遷移就越慢,分子量越小,遷移速度越快,據(jù)圖2可知瓊脂糖凝膠的加樣孔在A端,B項(xiàng)錯(cuò)誤;2號(hào)、3號(hào)分別是EcRⅠ單獨(dú)處理、SmaⅠ單獨(dú)處理后的電泳結(jié)果,兩個(gè)泳道均只出現(xiàn)一個(gè)DNA片段,且分子量是1 000,說(shuō)明該DNA分子最可能是含1 000個(gè)堿基對(duì)的環(huán)狀DNA,C項(xiàng)正確;圖2中4號(hào)是EcRⅠ和SmaⅠ兩種酶共同處理后的電泳結(jié)果,顯示800 bp和200 bp兩個(gè)條帶,說(shuō)明在該DNA分子中,兩種限制酶的酶切位點(diǎn)各有一個(gè),D項(xiàng)正確。
9.答案 (1)DNA連接酶、限制 啟動(dòng)子和終止子 蘇云金芽孢桿菌的(總)DNA
(2)特定的限制酶識(shí)別序列 標(biāo)記基因 復(fù)制起點(diǎn)
(3)含有重組質(zhì)粒/已轉(zhuǎn)化 BCD 抗生素 原生質(zhì)體 顯微注射
(4)帶有放射性或熒光分子標(biāo)記的抗蟲(chóng)(Bt)基因中的一段特定序列 DNA分子雜交 Bt毒蛋白
解析 (1)構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí),需要用到的酶主要有限制酶和DNA連接酶,用限制酶處理蘇云金芽孢桿菌的全部DNA,用DNA連接酶將處理后的基因與相關(guān)質(zhì)粒連接起來(lái)。cDNA文庫(kù)由mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成,沒(méi)有非編碼區(qū),不含位于非編碼區(qū)的啟動(dòng)子和終止子,不利于表達(dá)。也可提取蘇云金芽孢桿菌基因的總DNA,用限制酶處理后,通過(guò)PCR技術(shù)獲得。
(2)基因表達(dá)載體應(yīng)具有特定的限制酶識(shí)別序列,便于Bt基因與之整合到一起。表達(dá)載體應(yīng)含有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn),前者的作用是用于篩選含有Bt基因的細(xì)胞,后者用于保證Bt基因能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定存在細(xì)胞中。
(3)將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與棉花的愈傷組織細(xì)胞混合,使目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。用Ca2+處理受體細(xì)胞,使其成為感受態(tài)細(xì)胞,以提高轉(zhuǎn)化效率,重組質(zhì)粒的大小不影響轉(zhuǎn)化率,而愈傷組織的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的物理性質(zhì)、農(nóng)桿菌的活性均影響轉(zhuǎn)化率,一般情況下,生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織、在液體培養(yǎng)基中、農(nóng)桿菌活性較強(qiáng)時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高,故選B、C、D?？股乜蓺⑺擂r(nóng)桿菌(原核生物)而不傷害真核生物,所以可以用抗生素處理去除農(nóng)桿菌及篩選含有目的基因的愈傷組織細(xì)胞。由于去除細(xì)胞壁后獲得的原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁保護(hù),所以要放在較高滲透壓甘露醇溶液內(nèi)培養(yǎng),然后再采用顯微注射法將外源基因?qū)爰?xì)胞中。
(4)可制備帶有放射性或熒光分子標(biāo)記的抗蟲(chóng)(Bt)基因中的一段特定序列作為基因探針,利用DNA分子雜交技術(shù)檢測(cè)棉花細(xì)胞中是否存在Bt基因,若能形成特定的雜交帶,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因成功,否則,未成功。也可再利用Bt毒蛋白作為抗原,制備單抗來(lái)檢測(cè)Bt基因是否表達(dá),其原理是抗原-抗體檢測(cè)。
10.答案 (1)GR79基因表達(dá)的產(chǎn)物阻止(抑制)草甘膦與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶 基因組文庫(kù)
(2)堿基互補(bǔ)配對(duì) 5' PstⅠ和XhⅠ
(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 細(xì)胞質(zhì)DNA上(或葉綠體DNA或線粒體DNA或葉綠體和線粒體DNA上) 農(nóng)桿菌的種類和活性、受體細(xì)胞的基因型和活性等
(4)草甘膦 核酸分子雜交(或PCR和核酸分子雜交) 放射性或熒光條帶
(5)草甘膦抗性基因轉(zhuǎn)錄或翻譯異常(或草甘膦抗性基因表達(dá)異常)
解析 (1)草甘膦與植物體內(nèi)的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)結(jié)構(gòu)相似,會(huì)與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶,影響細(xì)胞正常代謝,由此推測(cè),GR79基因表達(dá)的產(chǎn)物能阻止草甘膦與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPSP合酶,從而發(fā)揮抗草甘膦作用?；蚪M文庫(kù)能夠儲(chǔ)存一種生物的全部或者部分基因。
(2)據(jù)圖推測(cè),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增GR79基因時(shí),需設(shè)計(jì)能與該基因兩條模板鏈3'端堿基互補(bǔ)配對(duì)的引物;由題圖可知,擴(kuò)增目的基因時(shí),應(yīng)在引物的5'端添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列;由題圖中質(zhì)粒結(jié)構(gòu)可知,限制酶BamHⅠ的識(shí)別序列位于標(biāo)記基因中,不能選用,且為防止目的基因自身環(huán)化和反向插入,應(yīng)選擇兩種不同的限制酶,即PstⅠ和XhⅠ,將它們的識(shí)別序列分別加在引物1和引物2的5'端。
(3)實(shí)驗(yàn)中常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將GR79基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物受體細(xì)胞。為避免該基因在近緣農(nóng)作物中傳播,可將其導(dǎo)入植物受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)DNA上(或葉綠體DNA或線粒體DNA或葉綠體和線粒體DNA上)。除溫度、酸堿度等環(huán)境因素外,影響該基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞成功率的因素有農(nóng)桿菌的種類和活性、受體細(xì)胞的基因型和活性等。
(4)為檢測(cè)GR79基因是否導(dǎo)入植物體細(xì)胞,可在培養(yǎng)基中添加草甘膦篩選含該基因的受體細(xì)胞;也可利用核酸分子雜交技術(shù)(或PCR和核酸分子雜交技術(shù))更加精準(zhǔn)地進(jìn)行檢測(cè),若待檢DNA中含有該基因,則會(huì)發(fā)現(xiàn)硝酸纖維素膜上出現(xiàn)放射性或熒光條帶。
(5)獲得GR79基因的植物幼苗通過(guò)基因表達(dá)可以表現(xiàn)出抗草甘膦的性狀,若不具有抗草甘膦的能力,則意味著草甘膦抗性基因(GR79基因)轉(zhuǎn)錄或翻譯異常,即草甘膦抗性基因(GR79基因)表達(dá)異常。
11.答案 (1)去除雜菌 篩選含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 液體
(2)脫分化和再分化
(3)抑制DNA酶活性 特異性不強(qiáng)
解析 (1)野生農(nóng)桿菌具有利福平抗性,不具有卡那霉素抗性。絕大部分細(xì)菌無(wú)利福平抗性,所以添加利福平的目的是去除雜菌。添加卡那霉素的目的是篩選含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。液體培養(yǎng)基可以增加菌種密度,故挑取單菌落,接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
(2)相對(duì)于傳統(tǒng)的用水稻植株體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法,針刺轉(zhuǎn)化法的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需經(jīng)歷脫分化和再分化過(guò)程,胚可以直接發(fā)育成幼苗,縮短了培育時(shí)間。
(3)在提取DNA過(guò)程中需加入EDTA,可以防止核DNA被酶解,所以EDTA的作用是抑制DNA酶活性。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,結(jié)果異常,可能的原因是PCR過(guò)程中的引物序列存在特異性不強(qiáng)的問(wèn)題。
12.答案 (1)逆轉(zhuǎn)錄 相同 不同 瓊脂糖凝膠電泳(或電泳)
(2)①DNA連接 復(fù)制起點(diǎn) ②T-DNA 促進(jìn)正、反向目的片段(干擾片段)的轉(zhuǎn)錄,得到足量的相應(yīng)RNA分子
(3)使攜帶干擾片段(目的片段)的T-DNA整合到受體細(xì)胞(黑麥草愈傷組織細(xì)胞)染色體DNA上 再分化
(4)野生型(或非轉(zhuǎn)基因) 降低
解析 (1)提取野生型黑麥草葉片全部mRNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程合成cDNA。根據(jù)cDNA序列選取合適的片段,由于正、反向的D基因片段的堿基序列相同,因而設(shè)計(jì)的正、反向目的片段的上下游的引物是相同的,正向片段和反向片段插入載體的方向不同,應(yīng)設(shè)計(jì)不同的酶切位點(diǎn)使目的片段定向插入載體的特定位置。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切下目的條帶回收后與載體在DNA連接酶的作用下實(shí)現(xiàn)連接,此后可用于正、反目的片段的擴(kuò)增。
(2)①對(duì)含有正向片段的克隆載體和反向片段的克隆載體分別進(jìn)行雙酶切,將回收片段與經(jīng)相同酶切的中間載體用DNA連接酶進(jìn)行連接,獲得含有干擾片段的重組中間載體;中間載體需有復(fù)制起點(diǎn),這樣可以使干擾片段能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在。②將干擾片段和超表達(dá)啟動(dòng)子插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中得到D基因的表達(dá)干擾載體,進(jìn)而可使目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的染色體DNA上,插入的超表達(dá)啟動(dòng)子能促進(jìn)正、反向目的片段(干擾片段)的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而可得到足量的相應(yīng)RNA分子,用于抑制后續(xù)的翻譯過(guò)程,進(jìn)而使黑麥草中木質(zhì)素含量下降。
(3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因表達(dá)載體導(dǎo)入黑麥草細(xì)胞中,即將黑麥草愈傷組織在菌液中浸沒(méi)5 min,先置于無(wú)菌濾紙上吸去多余的菌液,再轉(zhuǎn)入無(wú)菌水浸潤(rùn)的濾紙上共培養(yǎng)3 d,共培養(yǎng)的目的是使攜帶干擾片段(目的片段)的T-DNA整合到受體細(xì)胞(黑麥草愈傷組織細(xì)胞)染色體DNA上,從而保證目的基因在黑麥草細(xì)胞中穩(wěn)定存在。篩選得到的愈傷組織通過(guò)再分化過(guò)程,產(chǎn)生胚狀體,進(jìn)而培育得到再生植株,即轉(zhuǎn)基因植株。
(4)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型(或非轉(zhuǎn)基因)植株進(jìn)行木質(zhì)素含量測(cè)定與分析,篩選保留木質(zhì)素含量顯著降低的植株。