考點(diǎn)一　基因工程的基本工具
【精梳·攻教材】一、基因工程概述1.基因工程概念:
二、重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”):
【名師點(diǎn)睛】　限制酶的切割結(jié)果將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來需要切兩處,同時(shí)產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端。
【辨·清易錯(cuò)】1.切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個(gè)核苷酸序列。( )分析:不同種類限制酶識別序列不同。 DNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端。( )分析:E.cli DNA連接酶只能連接黏性末端。3.DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來。( )分析:DNA連接酶形成磷酸二酯鍵。4.載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,使之穩(wěn)定存在并表達(dá)。( )
【寫·練表達(dá)】1.(選擇性必修3P71“旁欄思考”拓展)原核生物中存在限制酶的意義是:_____________________________。 2.(選擇性必修3P74拓展應(yīng)用)限制酶不切割細(xì)菌自身DNA的原因是:(1)限制酶識別的DNA序列主要出現(xiàn)在________________________。(2)______________________________________________,這使得限制酶無法識別和切割自身基因組。
外源核酸上而不是自身上
細(xì)菌自身的核酸中相應(yīng)的可以被識別的序列被修飾
【精研·破疑難】【命題研究】【典例】圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn),AmpR表示氨芐青霉素抗性基因,ne表示新霉素抗性基因。(1)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí),若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段,會(huì)導(dǎo)致_______________________________________________________。?(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí),限制酶應(yīng)該選___________________,原因是 ______________________________________________________________________________。?聚焦考查點(diǎn):限制酶的選擇。
目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,或目的基因和質(zhì)粒的反向連接　
　PstⅠ和HindⅢ　
基因和質(zhì)粒的正向連接,并且質(zhì)粒上保留新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因 　
【解析】切割目的基因時(shí),用BamHⅠ切割會(huì)破壞目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體,會(huì)出現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,或目的基因和質(zhì)粒的反向連接,而用PstⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切,能確保目的基因和質(zhì)粒的正向連接,并且質(zhì)粒上保留新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因。
【破解策略】限制酶的選擇四要求1.位置要求:限制酶的酶切位點(diǎn)不能位于啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因當(dāng)中,所選酶切位點(diǎn)應(yīng)位于啟動(dòng)子和終止子之間,若載體有多個(gè)標(biāo)記基因,并非都不能破壞,要至少保留一個(gè),用于重組DNA的鑒定和篩選。另外,目的基因上如果有該酶的酶切位點(diǎn),不能選擇。
2.酶切要求:(1)單酶切:為使目的基因與載體形成的DNA片段末端能夠連接,通常使用同一種限制酶將兩者切割(如下圖,選用XhⅠ),但單酶切會(huì)出現(xiàn)目的基因與質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,還可造成目的基因的多拷貝插入。
(2)雙酶切:雙酶切可以確保目的基因的正確插入,要求兩個(gè)酶切位點(diǎn)位于目的基因的兩側(cè),如下圖可選擇PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位點(diǎn)個(gè)數(shù)和相對位置,如:不能選擇XhⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切。另外,不同的限制酶所產(chǎn)生的末端相同,兩端也可連接,因MunⅠ和EcRⅠ酶切后產(chǎn)生的末端相同,可選擇XhⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhⅠ和EcRⅠ酶切質(zhì)粒。
3.數(shù)量要求:如果所選限制酶的切割位點(diǎn)不止一個(gè),如選擇SmaⅠ進(jìn)行酶切,則切割重組后會(huì)丟失復(fù)制原點(diǎn),那么載體進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制,所選限制酶在載體上最好只有一個(gè)酶切位點(diǎn)。4.特殊要求:例如根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶,假設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ,則甲、乙、丁質(zhì)粒均不宜選取,丙質(zhì)粒宜選取。
【方法規(guī)律】DNA分子切割片段分析(1)對于鏈狀DNA分子,如果用限制酶切割后形成2個(gè)片段,則其上有1個(gè)酶切割位點(diǎn);如果形成3個(gè)片段,則其上有2個(gè)酶切割位點(diǎn),以此類推。(2)對于環(huán)狀DNA分子,如果用限制酶切割后形成1個(gè)片段,則其上有1個(gè)酶切割位點(diǎn);如果形成2個(gè)DNA片段,則其上有2個(gè)酶切割位點(diǎn),以此類推。
【精練·提能力】(多選)(2023·石家莊統(tǒng)考)圖1為某種質(zhì)粒簡圖,圖2表示某外源DNA上的目的基因,小箭頭所指位置分別為限制性內(nèi)切核酸酶EcR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)A.在基因工程中若只用一種限制酶完成對質(zhì)粒和外源DNA的切割,則可選EcRⅠB.如果將一個(gè)外源DNA分子和一個(gè)質(zhì)粒分別用EcRⅠ酶切后,再用DNA連接酶連接,形成一個(gè)含有目的基因的重組DNA,此重組DNA中的EcRⅠ酶切位點(diǎn)有1個(gè)C.為了防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,酶切時(shí)可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理D.一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)EcRⅠ切割后,含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)
【解析】選A、C、D。目的基因兩側(cè)都有,且質(zhì)粒也有的限制酶是EcRⅠ,所以在基因工程中若只用一種限制酶完成對質(zhì)粒和外源DNA的切割,可選EcRⅠ,A正確;如果將一個(gè)外源DNA分子和一個(gè)質(zhì)粒分別用EcRⅠ酶切后,再用DNA連接酶連接,形成一個(gè)含有目的基因的重組DNA,此重組DNA中EcRⅠ酶切位點(diǎn)有2個(gè),B錯(cuò)誤;為了防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,酶切時(shí)可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理,C正確;一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)EcRⅠ切割后,產(chǎn)生兩個(gè)黏性末端,含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán),D正確。
【加固訓(xùn)練】圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點(diǎn),圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcRⅠ、Sau 3AⅠ的切點(diǎn)是唯一的)。根據(jù)基因工程的有關(guān)知識,回答下列問題:(1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被_____________酶切后的產(chǎn)物連接,理由是?____________________________________________。?【解析】(1)由于限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同,所以經(jīng)BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。
?兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　
(2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子,如圖(c)所示,這三種重組子中,不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有______________,不能表達(dá)的原因是______________________________________________________________________________________________。?
【解析】(2)在基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子應(yīng)位于目的基因的首端,終止子應(yīng)位于目的基因的尾端,這樣目的基因才能表達(dá)。圖中甲、丙均不符合,所以不能表達(dá)目的基因產(chǎn)物。
　?甲中目的基因插在啟動(dòng)子的上游,丙中目的
基因插入在終止子的下游,二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄　
(3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來的酶,常見的有______________________　　　　和__________________________,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是___________________________。?【解析】(3)常見的DNA連接酶有E.cli DNA連接酶和T4 DNA連接酶,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4 DNA連接酶。
　E.cli DNA連接酶　
　　　T4 DNA連接酶　　　
　　　 T4 DNA連接酶　　　
【知識縱橫】四種酶比較
考點(diǎn)二　DNA的粗提取與鑒定
【精梳·攻教材】一、DNA的粗提取與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理:
【名師點(diǎn)睛】　攪拌注意事項(xiàng)加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí),動(dòng)作要輕緩,且要向同一個(gè)方向攪拌,以免DNA分子斷裂,導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。
二、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ):
2.PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟:
3.DNA的電泳鑒定:凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為________的紫外燈下被檢測出來。?
【名師點(diǎn)睛】　DNA提取過程中避免污染的兩種措施(1)高壓滅菌:為避免外源DNA等因素的污染,PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。(2)更換槍頭:在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí),每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換,避免試劑的污染。
【辨·清易錯(cuò)】1.進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)所需的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在20 ℃條件下儲(chǔ)存。( )分析:緩沖液和酶應(yīng)在-20 ℃條件下儲(chǔ)存。2.在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(guān)。( )分析:在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。3.為了節(jié)約資源,移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過程中不必更換。( )分析:移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過程中必須更換,避免試劑的污染。
4.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要設(shè)計(jì)兩種引物。( )5.凝膠電泳時(shí),電泳緩沖液不要沒過凝膠。( )分析:電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜。
【寫·練表達(dá)】1.(選擇性必修3 P74“探究·實(shí)踐”拓展)DNA粗提取實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料,原因是:_____________________________________。2.(選擇性必修3 P74“探究·實(shí)踐”改編)提取植物細(xì)胞的DNA時(shí),加入的洗滌劑目的是____________________________;加入研磨液的目的是____________________;加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是__________。
哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)
溶解細(xì)胞膜,有利于DNA的釋放
防止DNA酶降解DNA
【精練·提能力】1.(多選)(2024·滄州模擬)從目標(biāo)生物體內(nèi)提取分離出DNA是進(jìn)行基因工程操作的基礎(chǔ)。下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述,錯(cuò)誤的是(　　)A.豬血可以作為“DNA的粗提取和鑒定”的實(shí)驗(yàn)材料B.若以新鮮洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料,則研磨液過濾后保留濾液C.實(shí)驗(yàn)過程中加入預(yù)冷酒精溶液的作用是純化DNAD.DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱,冷卻后呈紫色
【解析】選A、D。哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞中不含DNA,豬屬于哺乳動(dòng)物,豬血不適合選作“DNA的粗提取和鑒定”的實(shí)驗(yàn)材料,A錯(cuò)誤;若以新鮮洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料,則研磨液過濾后保留濾液,B正確;DNA不溶于酒精溶液,實(shí)驗(yàn)過程中加入預(yù)冷酒精溶液的作用是純化DNA,C正確;DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱,冷卻后呈藍(lán)色,D錯(cuò)誤。
2.下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖,相關(guān)敘述正確的是(　　)A.圖1中溶液a是去掉上清液的研磨液B.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤,可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯C.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶D.圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色
【解析】選B。圖1中溶液a是研磨液靜置幾分鐘后取的上清液,A錯(cuò)誤;圖2所示實(shí)驗(yàn)的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面,可能導(dǎo)致加熱不充分,試管2中藍(lán)色變化不明顯,B正確;圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精,C錯(cuò)誤;圖2試管1起對照作用,目的是證明沸水浴下物質(zhì)的量濃度為2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色,而DNA遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色,D錯(cuò)誤。
3.下列有關(guān)電泳的敘述,錯(cuò)誤的是(　　)A.電泳是指帶電分子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B.待測樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA的遷移速率C.進(jìn)行電泳時(shí),帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相同的電極移動(dòng)D.PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定
【解析】選C。DNA分子具有可解離的基團(tuán),在一定的pH下,這些基因可以帶上正電荷或負(fù)電荷,在電場的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng),這個(gè)過程是電泳,即帶電分子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程,A正確,C錯(cuò)誤;待測樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA分子在電泳中的遷移速率,B正確;PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定,D正確。
考點(diǎn)三　基因工程的操作程序
【精梳·攻教材】一、目的基因的篩選與獲取1.目的基因:用于__________________或獲得______________等的基因。2.目的基因篩選方法:
3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因:
【名師點(diǎn)睛】PCR過程中的溫度控制(1)變性溫度:90 ℃以上使得DNA熱變性,打開雙鏈間的氫鍵,而體內(nèi)DNA復(fù)制靠的是解旋酶。(2)復(fù)性溫度:復(fù)性溫度在50 ℃左右,溫度過高,則引物難以與模板鏈結(jié)合,溫度過低則易使兩條母鏈配對結(jié)合,均無法獲得PCR產(chǎn)物。(3)延伸溫度:溫度在72 ℃左右,在DNA聚合酶和引物的作用下形成子鏈,方向?yàn)? '到3 '。?
二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1.構(gòu)建目的:使目的基因__________________________________________,同時(shí),使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的組成及作用:
在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代
三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
【名師點(diǎn)睛】農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入(1)第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。(2)第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌,第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
四、目的基因的檢測與鑒定
【辨·清易錯(cuò)】1.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)必須知道基因的全部序列。( )分析:PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不需要知道基因的全部序列。2.外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制。( )分析:外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行表達(dá)。3.將目的基因?qū)腚p子葉植物一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。( )
4.抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)。( )5.應(yīng)用DNA探針技術(shù),可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)。( )分析:應(yīng)用DNA探針技術(shù)可以檢測目的基因是否存在。
【寫·練表達(dá)】1.(選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”)引物是一小段_________________________________________________;引物在PCR中發(fā)揮的作用是:作為新子鏈的合成起點(diǎn),只能結(jié)合在母鏈的_____,使_____________________________________________。2.(選擇性必修3 P81“資料卡”延伸)導(dǎo)入的目的基因,可能存在于細(xì)胞的哪些部位?可能存在于__________,也可能____________________。
能與DNA母鏈的一段堿基序列互
DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸
【精研·破疑難】【命題研究】【典例】某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn),同時(shí)還含有四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程,如圖所示。請回答下列問題:(1)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖,農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因?________(填“是”或“否”)。為什么?____________________________________________________________________________。?【解析】(1)含有目的基因的質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因被破壞,在四環(huán)素培養(yǎng)基中不能生存。
　??含有目的基因的質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因被破壞,
在四環(huán)素培養(yǎng)基中不能生存 　
(2)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作,篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A(含氨芐青霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng),長出菌落后,用無菌牙簽挑取A培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落,分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上,一段時(shí)間后,菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C培養(yǎng)基上的哪些菌落中?請?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來。聚焦考查點(diǎn):標(biāo)記基因作用。
【解析】(2)含有目的基因的菌落能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中生長,不能在四環(huán)素培養(yǎng)基中生存。
【破解策略】標(biāo)記基因的分類和應(yīng)用分類:標(biāo)記基因可分為選擇基因和報(bào)告基因,它們都起著標(biāo)記目的基因是否成功轉(zhuǎn)化的作用,但是又有著各自的特點(diǎn)。
1.選擇基因:(1)直接選擇:載體上的選擇基因一般是一些抗生素的抗性基因,當(dāng)含有抗生素基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后,抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素,所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素,就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞,原理如圖所示:
(2)間接選擇:將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí),如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部,則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。常用方法——“影印法”篩選含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞①將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌,如圖1、2、3、4、5菌落。②再利用無菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上,如圖能生長的菌落為2、3、4,則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落,如圖1、5菌落。③最后,可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
2.報(bào)告基因:報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定,且實(shí)驗(yàn)材料原本不會(huì)產(chǎn)生的性狀的基因。常用的報(bào)告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。常用方法——“藍(lán)白斑”篩選含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì),在經(jīng)人工插入外源基因后,大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切斷,無法形成完整的β-半乳糖苷酶基因,故不能對無色化合物X-gal進(jìn)行切割,菌落呈白色。
【精練·提能力】1.(2023·邢臺模擬)PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基,5'端無嚴(yán)格限制,可用于添加限制酶切割位點(diǎn)等序列。下列敘述正確的是(　　)A.PCR第五次循環(huán),消耗了16對引物B.脫氧核苷酸作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到5'端C.PCR反應(yīng)體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、Ca2+等D.圖中引物擴(kuò)增至少四次循環(huán)后才能獲得兩端均能添加限制酶切點(diǎn)的目的產(chǎn)物
【解析】選A。該DNA是雙鏈,第一次循環(huán)要1對引物,第二次要2對,第三次4對,第四次要8對,第五次要16對,即PCR第五次循環(huán),消耗了16對引物,A正確;進(jìn)行PCR時(shí),擴(kuò)增是從引物的3'端開始延伸,因此脫氧核苷酸作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到3'端,B錯(cuò)誤;PCR反應(yīng)體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶和擴(kuò)增緩沖液(含Mg2+)等物質(zhì),不需要加入Ca2+,C錯(cuò)誤;在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中才開始出現(xiàn)完整的X基因(目的基因),D錯(cuò)誤。
【知識縱橫】(1)在PCR過程中實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的原料,又可為DNA的合成提供能量。(2)引物既可以為DNA單鏈,也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí),也需要引物,一般為RNA片段。
【從教材走向高考】2.(選擇性必修3 P83練習(xí)與應(yīng)用T1改編)我國科研人員將寒帶地區(qū)海魚中的抗凍基因轉(zhuǎn)入千禧果(番茄品種)細(xì)胞中,成功培育出抗凍千禧果。如圖為培育過程使用的Ti質(zhì)粒示意圖,Vir區(qū)的基因活化能促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移。(1)利用PCR從海魚基因組中擴(kuò)增抗凍基因需要添加一對特異性引物,目的是_______________________________________________________;利用抗凍基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后PCR也可獲得抗凍基因。通過瓊脂糖凝膠電泳,____________(填“能”或“不能”)區(qū)分兩種方法獲得的抗凍基因,理由是____________________________________________________________________________________________________________________________。?
　使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核
　????利用抗凍基因的mRNA
逆轉(zhuǎn)錄后PCR獲得的抗凍基因中不含啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子等序列,DNA分子較小,
在凝膠中的遷移速率較大　
【解析】(1)PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的技術(shù),引物使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸,合成子鏈DNA。利用抗凍基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后PCR獲得的抗凍基因中不含啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子等序列,DNA分子較小,在凝膠中的遷移速率較大;而利用PCR從海魚基因組中獲得的抗凍基因含啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子等序列,DNA分子相對較大,在凝膠中的遷移速率較小。因此,可以通過瓊脂糖凝膠電泳,區(qū)分兩種方法獲得的抗凍基因。
2.(選擇性必修3 P83練習(xí)與應(yīng)用T1改編)我國科研人員將寒帶地區(qū)海魚中的抗凍基因轉(zhuǎn)入千禧果(番茄品種)細(xì)胞中,成功培育出抗凍千禧果。如圖為培育過程使用的Ti質(zhì)粒示意圖,Vir區(qū)的基因活化能促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移。(2)選擇圖示Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體,應(yīng)選擇限制酶________　(填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”),理由是__________________________________________________________________________________________________________________。?【解析】(2)選擇圖示Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),限制酶Ⅰ會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因影響后續(xù)的篩選,限制酶Ⅱ會(huì)破壞Vir區(qū)基因影響目的基因的轉(zhuǎn)移,因此選擇限制酶Ⅲ。
　?限制酶Ⅰ會(huì)破壞四環(huán)素抗
性基因,不利于含目的基因的受體細(xì)胞的篩選;限制酶Ⅱ會(huì)
破壞Vir區(qū)基因,影響目的基因的轉(zhuǎn)移　
2.(選擇性必修3 P83練習(xí)與應(yīng)用T1改編)我國科研人員將寒帶地區(qū)海魚中的抗凍基因轉(zhuǎn)入千禧果(番茄品種)細(xì)胞中,成功培育出抗凍千禧果。如圖為培育過程使用的Ti質(zhì)粒示意圖,Vir區(qū)的基因活化能促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移。(3)為篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的千禧果細(xì)胞,要在培養(yǎng)基中添加______________。成功轉(zhuǎn)化的千禧果細(xì)胞經(jīng)脫分化形成愈傷組織后,再使用________________________誘導(dǎo)培育成植株,最后在_________________條件下篩選出具有抗凍性狀的千禧果植株。?
【解析】(3)在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素,可以篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的千禧果細(xì)胞;將千禧果細(xì)胞經(jīng)脫分化形成愈傷組織后,再通過再分化過程培育成植株,再分化過程通過調(diào)節(jié)生長素和細(xì)胞分裂素的比值誘導(dǎo)愈傷組織分化出根或芽。新形成的植株含有抗凍基因,在低溫/寒冷條件下篩選出具有抗凍性狀的千禧果植株。
【加固訓(xùn)練】1.煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,其栽培容易受到氣候、土壤等諸多生態(tài)因子的制約,因而煙草的栽培區(qū)域受到限制。土壤中的鹽分是制約煙草生長的重要因素,它的含量過高不僅造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)降低,同時(shí)還使土壤板結(jié)。某科研團(tuán)隊(duì)為獲得抗逆性強(qiáng)的耐鹽煙草品種,將抗鹽基因H與質(zhì)粒重組,再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。請回答:?(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具,應(yīng)具備的基本條件有　　　　　　　　　　　______________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。而作為目的基因的表達(dá)載體,除滿足上述基本條件外,還需要有啟動(dòng)子和終止子,其中啟動(dòng)子的作用是____________________________________________。?
　能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個(gè)至多個(gè)限制
　　RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn),驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄　　
【解析】(1)質(zhì)粒作為基因工程的工具,應(yīng)具備的基本條件有能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)等;啟動(dòng)子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn),用以驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。
1.煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,其栽培容易受到氣候、土壤等諸多生態(tài)因子的制約,因而煙草的栽培區(qū)域受到限制。土壤中的鹽分是制約煙草生長的重要因素,它的含量過高不僅造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)降低,同時(shí)還使土壤板結(jié)。某科研團(tuán)隊(duì)為獲得抗逆性強(qiáng)的耐鹽煙草品種,將抗鹽基因H與質(zhì)粒重組,再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。請回答:(2)對圖中的質(zhì)粒和外源DNA進(jìn)行切割時(shí),所用的限制酶是________________________________________。圖中的質(zhì)粒A還應(yīng)含有T-DNA,T-DNA的作用是_____________________________________________________________。?
　　BamHⅠ和HindⅢ或EcRⅠ和HindⅢ　　
　　攜帶目的基因進(jìn)入煙草細(xì)胞并整合到煙草細(xì)胞的染色體DNA上　
【解析】(2)據(jù)圖分析可知,因SmaⅠ會(huì)破壞目的基因,故不能選用該限制酶進(jìn)行切割,故構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要限制酶HindⅢ和BamHⅠ或HindⅢ和EcRⅠ;Ti質(zhì)粒上含有T-DNA,T-DNA的作用是攜帶目的基因進(jìn)入煙草細(xì)胞并整合到煙草細(xì)胞的染色體DNA上。
1.煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,其栽培容易受到氣候、土壤等諸多生態(tài)因子的制約,因而煙草的栽培區(qū)域受到限制。土壤中的鹽分是制約煙草生長的重要因素,它的含量過高不僅造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)降低,同時(shí)還使土壤板結(jié)。某科研團(tuán)隊(duì)為獲得抗逆性強(qiáng)的耐鹽煙草品種,將抗鹽基因H與質(zhì)粒重組,再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。請回答:(3)將抗鹽基因H插入T-DNA上,導(dǎo)入用_________處理過的農(nóng)桿菌。篩選轉(zhuǎn)基因成功的煙草細(xì)胞,經(jīng)過⑤和⑥過程得到轉(zhuǎn)基因抗鹽的煙草幼苗,該過程所應(yīng)用的原理是__________________________。?
　植物細(xì)胞具有全能性　　
【解析】(3)農(nóng)桿菌為微生物細(xì)胞,作為受體細(xì)胞時(shí),應(yīng)讓其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),通常用Ca2+進(jìn)行處理;經(jīng)過⑤脫分化和⑥再分化過程得到轉(zhuǎn)基因抗鹽的煙草幼苗,該過程所應(yīng)用的原理是植物細(xì)胞具有全能性。
1.煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,其栽培容易受到氣候、土壤等諸多生態(tài)因子的制約,因而煙草的栽培區(qū)域受到限制。土壤中的鹽分是制約煙草生長的重要因素,它的含量過高不僅造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)降低,同時(shí)還使土壤板結(jié)。某科研團(tuán)隊(duì)為獲得抗逆性強(qiáng)的耐鹽煙草品種,將抗鹽基因H與質(zhì)粒重組,再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。請回答:(4)若要獲得抗鹽能力更強(qiáng)的抗鹽基因,可以對基因H進(jìn)行改造,最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì),該過程可以通過蛋白質(zhì)工程完成,該過程的基本思路是__________________________________________________________________________________________________________________________。?
①預(yù)期耐鹽蛋白質(zhì)的功能,②設(shè)計(jì)耐鹽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),
③推測應(yīng)有的氨基酸序列,④找到并改變對應(yīng)的基因序列,
【解析】(4)若要獲得抗鹽能力更強(qiáng)的抗鹽基因,可以對基因H進(jìn)行改造,最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì),該過程可以通過蛋白質(zhì)工程完成,基本思路是:①預(yù)期耐鹽蛋白質(zhì)的功能;②設(shè)計(jì)耐鹽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu);③推測應(yīng)有的氨基酸序列;④找到并改變對應(yīng)的基因序列;⑤獲得所需要的蛋白質(zhì)。
【易錯(cuò)警示】啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子比較
2.玉米是世界上的第三大糧食作物,廣泛種植于世界各地。研究表明,轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中的抗蟲基因是從細(xì)菌中分離出的Bt毒蛋白基因,這種基因編碼的蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入害蟲的腸道,能有效殺死玉米螟(一種農(nóng)業(yè)害蟲)。結(jié)合上述資料請回答下列問題:(1)Bt毒蛋白基因在基因工程中稱為________________,其除這種編碼蛋白質(zhì)的基因外,還可以是____________________________;在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中,除要有Bt毒蛋白基因外,還必須有啟動(dòng)子、終止子和________________。 ?【解析】(1)Bt毒蛋白基因在基因工程中被稱為目的基因;基因工程中的目的基因除這種編碼蛋白質(zhì)的基因外,還可以是具有調(diào)控作用的因子,構(gòu)建目的基因表達(dá)載體,需要目的基因、啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因,標(biāo)記基因的作用是為了篩選成功導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞。
　　具有調(diào)控作用的因子　　
2.玉米是世界上的第三大糧食作物,廣泛種植于世界各地。研究表明,轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中的抗蟲基因是從細(xì)菌中分離出的Bt毒蛋白基因,這種基因編碼的蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入害蟲的腸道,能有效殺死玉米螟(一種農(nóng)業(yè)害蟲)。結(jié)合上述資料請回答下列問題:(2)在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Bt毒蛋白基因時(shí),需要提供模板、原料、引物、________________________________________等條件,緩沖液中Mg2+的作用是_____________________。?【解析】(2)在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Bt毒蛋白基因時(shí),需要提供模板、原料、引物和耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)等條件,DNA聚合酶需要Mg2+激活。
　耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　　
　　激活DNA聚合酶　
2.玉米是世界上的第三大糧食作物,廣泛種植于世界各地。研究表明,轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中的抗蟲基因是從細(xì)菌中分離出的Bt毒蛋白基因,這種基因編碼的蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入害蟲的腸道,能有效殺死玉米螟(一種農(nóng)業(yè)害蟲)。結(jié)合上述資料請回答下列問題:(3)Bt毒蛋白基因與載體結(jié)合過程中需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶。若某限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)是 ,請寫出Bt毒蛋白基因被限制酶切割后所形成的黏性末端:__________________,DNA連接酶對所連接的兩端堿基序列__________ (填“有”或“沒有”)專一性要求。 ?
2.玉米是世界上的第三大糧食作物,廣泛種植于世界各地。研究表明,轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中的抗蟲基因是從細(xì)菌中分離出的Bt毒蛋白基因,這種基因編碼的蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入害蟲的腸道,能有效殺死玉米螟(一種農(nóng)業(yè)害蟲)。結(jié)合上述資料請回答下列問題:(4)為了防止抗蟲玉米通過花粉傳播帶來的生態(tài)學(xué)問題,科研小組考慮將抗蟲基因?qū)胗衩赘饧?xì)胞的____________中以防止基因污染,同時(shí)在大規(guī)模種植的抗蟲玉米田中設(shè)置一個(gè)或多個(gè)區(qū)域來種植普通玉米,目的是__________________________________________________________________。 ?
　?延緩抗毒蛋白的玉米螟出
現(xiàn)(或減緩害蟲抗性基因頻率增加的速度) 　
【解析】(4)為了防止抗蟲玉米通過花粉傳播帶來的生態(tài)學(xué)問題,科研小組考慮將抗蟲基因?qū)胗衩赘饧?xì)胞的線粒體中以防止基因污染,這樣可以避免目的基因隨著花粉傳播到近源物種中,同時(shí)在大規(guī)模種植的抗蟲玉米田中設(shè)置一個(gè)或多個(gè)種植普通玉米的區(qū)域,這樣可以給玉米螟提供普通玉米食物,目的是延緩抗毒蛋白的玉米螟出現(xiàn)(或減緩害蟲抗性基因頻率增加的速度)。
【感悟高考】1.(2023·湖北選擇考)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒),并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)A.若用HindⅢ酶切,目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PυuⅠ酶切,在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
【解析】選D。本題考查基因工程相關(guān)知識。若用HindⅢ酶切,目的基因的插入方向可正可反,所以轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同,A正確;若用PυuⅠ酶切,重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR),所以在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落,不一定含有目的基因,B正確;DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離大小不同的DNA片段,重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同,能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否,C正確;SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR),因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落,在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落,D錯(cuò)誤。
2.(2023·廣東選擇考)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)A.裂解:使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C.沉淀:可反復(fù)多次以提高DNA的純度D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色
【解析】選D。裂解是加蒸餾水讓細(xì)胞吸水漲破,釋放出DNA等物質(zhì),A正確;DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2 ml/L的NaCl溶液,將溶液過濾,即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離,B正確;DNA不溶于酒精,而某些蛋白質(zhì)溶于酒精,可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA純度,C正確;將DNA溶解于NaCl溶液,加入二苯胺試劑,沸水浴5 min,待冷卻后,能呈現(xiàn)藍(lán)色,D錯(cuò)誤。
3.(2021·山東等級考)粗提取 DNA 時(shí),向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌,過濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過濾,在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出 DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是(　　)A.加入適量的木瓜蛋白酶B.在37～40 ℃的水浴箱中保溫 10～15 分鐘C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為 95%的冷卻的酒精D.加入 NaCl 調(diào)節(jié)濃度至 2 ml/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中 NaCl 濃度至 0.14 ml/L
【解析】選A。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質(zhì)類雜質(zhì),由于酶具有專一性,不能水解DNA,過濾后在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出 DNA相對含量較高的白色絲狀物,A正確;在37～40 ℃的水浴箱中保溫 10～15 分鐘不能去除濾液中的雜質(zhì),應(yīng)該放在60～75 ℃的水浴箱中保溫 10～15 分鐘,使蛋白質(zhì)變性析出,B錯(cuò)誤;向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌,過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為 95%的冷卻的酒精,此時(shí)DNA析出,不會(huì)進(jìn)入濾液中,C錯(cuò)誤;加入 NaCl 調(diào)節(jié)濃度至 2 ml/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中 NaCl 濃度至 0.14 ml/L, DNA在此溶液中溶解度小而析出,不會(huì)進(jìn)入濾液中,D錯(cuò)誤。
【加固訓(xùn)練】(2023·廣東選擇考)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n=10)進(jìn)行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序,發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換,突變后的基因?yàn)殡[性基因,據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān),開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉栴}:(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株,若突變體表型確由該突變造成,則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與______________植株的種子大小相近。?【解析】(1)根據(jù)題干信息可知,突變后的基因?yàn)殡[性基因,則野生型DAI基因?yàn)轱@性基因,因此采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株,若突變體表型確由該突變造成,則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。
(2023·廣東選擇考)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n=10)進(jìn)行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序,發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換,突變后的基因?yàn)殡[性基因,據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān),開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。回答下列問題:(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因,用限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和__________進(jìn)行切割,用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá),其上下游序列需具備______________________。?【解析】(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DAI基因后,應(yīng)該用同種限制性內(nèi)切核酸酶對DAI基因和載體進(jìn)行切割,再用DNA連接酶將兩者連接起來。在基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子位于目的基因的首端,終止子位于目的基因的尾端,因此為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá),其上下游序列需具備啟動(dòng)子和終止子。
(3)轉(zhuǎn)化后,T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下,選出單一位點(diǎn)插入的植株,并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖),用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交,將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上,能夠萌發(fā)并生長的陽性個(gè)體即表示其基因組中插入了_______________________________。?②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,選擇陽性率約________%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。?
　DAI基因和卡那霉素抗性基因　
③將②中選出的T2代陽性植株__________(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,陽性率達(dá)到_________%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測該突變,研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段,再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物,通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測,相關(guān)信息如下,在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。?
【解析】(3)①根據(jù)題中信息和圖形分析,將T0代植株的花序浸沒在農(nóng)桿菌(T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液中轉(zhuǎn)化,再將獲得的T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基(含有卡那霉素)上,若在選擇培養(yǎng)基上有能夠萌發(fā)并生長的陽性個(gè)體,則說明含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因組中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽性植株都含有DAI基因,由于T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn),所以不確定是單一位點(diǎn)插入還是多位點(diǎn)插入,若是單一位點(diǎn)插入,相當(dāng)于一對等位基因的雜合子,其自交后代應(yīng)該出現(xiàn)3∶1的性狀分離比,而題目要求選出單一位點(diǎn)插入的植株,因此應(yīng)該選擇陽性率約75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。
③將以上獲得的T2代陽性植株自交,再將得到的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上,若某培養(yǎng)基上全部為具有卡那霉素抗性的植株即為需要選擇的植株,即陽性率達(dá)到100%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)圖形分析,野生型和突變型基因片段的長度都是150 bp,野生型的基因沒有限制酶X的切割位點(diǎn),而突變型的基因有限制酶X的切割位點(diǎn),結(jié)合圖中的數(shù)據(jù)分析可知,電泳圖中野生型只有150 bp,突變型有50 bp和100 bp,如圖:
【預(yù)測高考】鎖定新情境:靶向基因操作技術(shù)　　TALEN是一種靶向基因操作技術(shù),該技術(shù)利用了TAL靶向識別單元對靶向基因的識別作用和Fk1蛋白對靶向基因的切割作用實(shí)現(xiàn)了對特定靶向基因的敲除。相關(guān)操作如下:TAL靶向識別單元的構(gòu)建。TAL靶向識別單元為間隔32個(gè)氨基酸的雙連氨基酸(即兩個(gè)相連的氨基酸)序列。不同的雙連氨基酸分別與靶向基因中的A、T、C、G有恒定的對應(yīng)關(guān)系,根據(jù)靶向基因的堿基序列可以設(shè)計(jì)出雙連氨基酸序列。
基于核心素養(yǎng)的新考向:1.(結(jié)構(gòu)與功能觀)目的基因的獲取與擴(kuò)增。根據(jù)TAL靶向識別單元中雙連氨基酸序列和Fk1蛋白的氨基酸序列,可按照?_________________________________________________________________________________________,?最終合成目的基因(寫出具體步驟)。再通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增前,需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)出___________種引物;擴(kuò)增時(shí),需先加熱至90～95 ℃,再冷卻至50～60 ℃,再加熱至70～75 ℃,此操作的目的是_____________________________________________________________________________________________________________。?
??先推測出mRNA序列,再推測出目的基因
的脫氧核苷酸序列,利用化學(xué)法以單個(gè)脫氧核苷酸為原料　
??加熱使DNA變性后解聚為
單鏈,冷卻使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上,再加熱促進(jìn)DNA聚合酶發(fā)揮作用,開始互
【解析】1.已知TAL靶向識別單元中雙連氨基酸序列和Fk1蛋白的氨基酸序列,可先推測出mRNA序列,再推測出目的基因的脫氧核苷酸序列,然后利用化學(xué)法以單個(gè)脫氧核苷酸為原料,最終合成目的基因,再通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增前,需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)出2種引物;擴(kuò)增時(shí),需先加熱至90～95 ℃使DNA變性后解聚為單鏈,再冷卻至50～60 ℃使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上,再加熱至70～75 ℃促進(jìn)DNA聚合酶發(fā)揮作用,開始互補(bǔ)鏈的合成。
2.(歸納與概括)利用質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體。在構(gòu)建的基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子應(yīng)位于基因的上游,它是_____________________________的部位;標(biāo)記基因的作用是___________________________。?【解析】2.在構(gòu)建的基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子位于基因的首端,它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位;標(biāo)記基因的作用是便于重組DNA分子的篩選。
　　RNA聚合酶識別和結(jié)合　　
　?便于重組DNA分子的篩選　
3.(分析與比較)目的基因的表達(dá)與檢測。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后,在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,稱為__________。從分子水平上,通過_____________________________________方法可檢測基因工程操作是否成功。?【解析】3.目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后,在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,稱為轉(zhuǎn)化。分子水平上的檢測:①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因用PCR技術(shù);②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA用PCR技術(shù);③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)用抗原—抗體雜交技術(shù)。
雜交(或PCR技術(shù))　　　

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