(新高考)2023年高考生物一輪復(fù)習(xí)講義第10單元解惑練5CRISPRCas9技術(shù)(含解析)

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解惑練5　CRISPR/Cas9技術(shù)1．CRISPR/Cas9技術(shù)敲除掉部分基因原理(1)CRISPR/Cas9是細(xì)菌的一種后天免疫防御機(jī)制——CRISPR序列示意圖如下(其中，菱形框表示高度可變的間隔序列，正方形表示相對(duì)保守的重復(fù)序列)，其中的“間隔序列”來源于病毒或外源質(zhì)粒的一小段DNA，是細(xì)菌對(duì)這些外來入侵者的“記錄”。(2)病毒或外源質(zhì)粒上存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對(duì)應(yīng)。“原間隔序列”的選取并不是隨機(jī)的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個(gè)堿基往往都很保守，我們稱為PAM(原間隔序列臨近基序)。(3)當(dāng)病毒或外源質(zhì)粒DNA首次入侵到細(xì)菌體內(nèi)時(shí)，細(xì)菌會(huì)對(duì)外源DNA潛在的PAM序列進(jìn)行掃描識(shí)別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細(xì)菌基因組上CRISPR序列中的兩個(gè)“重復(fù)序列”之間。這就是“間隔序列”產(chǎn)生的過程。(4)當(dāng)外源質(zhì)?；虿《驹俅稳肭炙拗骶鷷r(shí)，會(huì)誘導(dǎo)CRISPR序列的表達(dá)。同時(shí)，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA和Cas基因的表達(dá)產(chǎn)物等一起合作，通過對(duì)PAM序列的識(shí)別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，來找到外源DNA上的靶序列，并對(duì)其切割，降解外源DNA。這也就實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒或外源質(zhì)粒再次入侵的免疫應(yīng)答。2．CRISPR/Cas9技術(shù)的運(yùn)用和發(fā)展(1)具體運(yùn)用如下圖所示，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)?/span>RNA(指導(dǎo)RNA)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)?/span>RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。對(duì)于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。(2)CRISPR/Cas9基因魔剪：當(dāng)研究人員要用基因魔剪來編輯一個(gè)基因組時(shí)，他們會(huì)人工構(gòu)建一個(gè)指導(dǎo)RNA，它與將要被切割的DNA代碼相匹配。魔剪蛋白Cas9與指導(dǎo)RNA形成復(fù)合物，將魔剪帶到基因組中將要進(jìn)行切割的地方。(3)原始的CRISPR－Cas9會(huì)由于RNA定位偏差而出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，現(xiàn)在通過改進(jìn)，可以大幅降低脫靶效應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些新的系統(tǒng)，除了最開始的Cas9，后面又找到了Cas12的一系列酶，機(jī)理上有一定不同，但還是用以切割DNA；還有Cas13則用于切割RNA?；?/span>Cas12和Cas13的開發(fā)以及機(jī)制研究，又發(fā)展出了新的工具用于快速檢測(cè)病毒，效率可以達(dá)到幾分鐘檢測(cè)一個(gè)樣品，并且用到了現(xiàn)在的新冠病毒檢測(cè)中。跟蹤訓(xùn)練1．CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA，受此機(jī)制啟發(fā)，科學(xué)家們研發(fā)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，這是一種對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，其原理是由一個(gè)向?qū)?/span>RNA分子引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。通過設(shè)計(jì)向?qū)?/span>RNA中20個(gè)堿基的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的任一目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割(見下圖)。請(qǐng)據(jù)圖分析回答下列問題：(1)CRISPR/Cas9基因編輯復(fù)合體中Cas9蛋白是由相應(yīng)基因指導(dǎo)，在細(xì)胞的__________中合成的，其工作原理是特異性地切斷目標(biāo)DNA的______________________________________(填具體部位)；向?qū)?/span>RNA中的識(shí)別序列與目標(biāo)DNA的識(shí)別遵循____________________原則，該復(fù)合體中，決定其在DNA上切割位點(diǎn)的是_____________________________________。(2)中國科學(xué)家從肺癌患者血液中提取某種細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)加入一個(gè)幫助這種細(xì)胞定向清除腫瘤的新基因序列，然后再把這些細(xì)胞注入患者的血液，以達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的。這些細(xì)胞應(yīng)該是人體的__________，這種治療方法屬于__________(填“體內(nèi)”或“體外”)基因治療。(3)分析上述信息可知，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與早期基因工程相比最明顯的優(yōu)勢(shì)是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案　(1)核糖體　磷酸二酯鍵　堿基互補(bǔ)配對(duì)向?qū)?/span>RNA中的識(shí)別序列　(2)T淋巴細(xì)胞　體外(3)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可人為地選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割，目的性更強(qiáng)解析　(3)與早期基因工程相比，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯，故其最明顯的優(yōu)勢(shì)是可人為地選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割，目的性更強(qiáng)。2．(2022·湖南高三模擬)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以按照人們的意愿精準(zhǔn)剪切、改變?nèi)我獍谢虻倪z傳信息，對(duì)該研究有突出貢獻(xiàn)的科學(xué)家被授予2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。其原理是由一條單鏈向?qū)?/span>RNA(sgRNA)引導(dǎo)Cas9蛋白到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而達(dá)到基因定點(diǎn)敲除、敲入、突變的目的。通過設(shè)計(jì)向?qū)?/span>RNA中20個(gè)堿基的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割(如圖所示)。請(qǐng)據(jù)圖分析回答下列問題：(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA，準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列。Cas9借助向?qū)?/span>RNA對(duì)目標(biāo)DNA分子進(jìn)行精準(zhǔn)定位，依賴于________________________________________________________________________________________________________________________________________________；Cas9蛋白能對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確切割，是因?yàn)?/span>_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________，由此可見，Cas9在功能上屬于_______________________________________________酶。(2)在使用Cas9對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行編輯時(shí)，應(yīng)使用Cas9蛋白和__________(填“相同”或“不同”)的向?qū)?/span>RNA進(jìn)行基因編輯。在設(shè)計(jì)向?qū)?/span>RNA識(shí)別序列時(shí)，若目標(biāo)DNA的α鏈切點(diǎn)附近序列為…GAATCTCCA…，則向?qū)?/span>RNA上識(shí)別序列為_________________________________________________________________________________________________。(3)已知玉米中賴氨酸含量較低，原因是與賴氨酸合成過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶——天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的活性，受細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度影響較大。當(dāng)賴氨酸濃度達(dá)到一定量時(shí)就影響這兩種酶的活性，從而使賴氨酸含量很難提高，不能滿足需求?，F(xiàn)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶基因進(jìn)行改造，首先需要構(gòu)建由啟動(dòng)子、__________________________________(目的基因)、標(biāo)記基因、終止子等組成的基因表達(dá)載體，然后使用____________法導(dǎo)入玉米細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)化后CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在玉米體細(xì)胞中特定的基因位點(diǎn)改寫遺傳信息，再經(jīng)______________________技術(shù)培育成賴氨酸高產(chǎn)的玉米植株。答案　(1)向?qū)?/span>RNA識(shí)別序列與目標(biāo)DNA之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)　Cas9蛋白能識(shí)別特定核苷酸序列并在特定位點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵(Cas9蛋白具有專一性)　限制性內(nèi)切核酸　(2)不同　…GAAUCUCCA…　(3)Cas9蛋白基因和sgRNA基因　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化　植物組織培養(yǎng)解析　(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA，能準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列。Cas9能借助向?qū)?/span>RNA與目標(biāo)DNA進(jìn)行精確定位的原因在于向?qū)?/span>RNA上的堿基序列與目標(biāo)DNA分子上的堿基序列可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則實(shí)現(xiàn)向?qū)?/span>RNA與目標(biāo)DNA分子特定序列的特定識(shí)別，進(jìn)而定位；對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的切割則依賴于Cas9的專一識(shí)別，Cas9蛋白能識(shí)別特定核苷酸序列并在特定位點(diǎn)剪切特定的堿基序列，使磷酸二酯鍵斷裂。由此可見，Cas9在功能上屬于限制性內(nèi)切核酸酶。