?細胞工程、基因工程
1．（2021全國甲卷·38）PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進行了相關(guān)操作：①分析PCR擴增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}：
（1）若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是_________（用數(shù)字序號表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________，PCR 反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是_______ 。
（3）為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與_______ 特異性結(jié)合。
（4）PCR（多聚酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)是指_______。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
【答案】（1）④②③① （2）Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶） 延伸 Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成 （3）兩條單鏈DNA （4）一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)
【分析】
PCR是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過這一技術(shù)，可以在短時間內(nèi)大量擴增目的基因。利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。
【詳解】
（1）PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴增DNA片段→①分析PCR擴增結(jié)果。
（2）在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，操作③中使用的酶是Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶），PCR 反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性的結(jié)果是Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成。
（3）DNA復(fù)制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。
（4）據(jù)分析可知，PCR（多聚酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)是指一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
【點睛】
本題考查PCR技術(shù)及應(yīng)用，難度較小，解答本題的關(guān)鍵是明確PCR技術(shù)的原理，具體反應(yīng)過程，以及在臨床病原菌檢測中的應(yīng)用。
2．（2021全國乙卷·38）用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點如圖所示。

回答下列問題：
（1）常用的DNA連接酶有E. coli DNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA連接酶連接。上圖中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。
（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。
（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細胞中能___________；質(zhì)粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞，方法是______________。
（4）表達載體含有啟動子，啟動子是指__________________。
【答案】（1）EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV （2）磷酸二酯鍵 （3）自我復(fù)制 一至多個限制酶切位點 用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞 （4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程
【分析】
基因工程至少需要三種工具：限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶、運載體。
【詳解】
（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA連接酶連接。
（2）DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。
（3）質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點，能保證質(zhì)粒在受體細胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞。
（4）啟動子是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得需要的蛋白質(zhì)。
【點睛】
本題考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的概念、原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要
注意的細節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識準確答題。
3．（2020·東北師大附中高三一模）Anti基因是小型豬器官表面抗原基因，人工合成的reAnti基因的模板鏈與Anti基因的模板鏈互補?？茖W(xué)家利用合成的reAnti基因培育出轉(zhuǎn)基因克隆豬，用于解決人類器官移植時免疫排斥。
(l)利用PCR技術(shù)對reAnti基因進行擴增，其原理是 ___，在構(gòu)建基因表達載體時，用兩種不同的限制酶切割reAnti基因和運載體DNA來獲得不同的黏性末端，原因是____。
(2)豬胎兒成纖維細胞培養(yǎng)過程中，需要用 ___酶將組織分散成細胞懸液。培育轉(zhuǎn)基因豬時，應(yīng)使用 ___技術(shù)將含有reAnti基因的表達載體導(dǎo)入豬成纖維細胞。再將該轉(zhuǎn)基因豬的細胞核注入____時期的卵母細胞中，構(gòu)建重組胚胎。
(3)胚胎培養(yǎng)液中除了一些無機鹽和有機鹽外，還需要添加“兩酸、兩素”以及動物血清，其中的“兩酸”是指____。
(4)用 ___技術(shù)檢測出轉(zhuǎn)基因克隆豬的細胞核DNA中含有reAnti基因，但器官表面不含有抗原，原因是____。
【答案】DNA雙鏈復(fù)制 防止目的基因和運載體DNA自身環(huán)化和反向連接（使目的基因定向連接到運載體上） 胰蛋白酶（膠原蛋白酶） 顯微注射 減數(shù)第二次分裂中期 氨基酸和核苷酸 DNA分子雜交技術(shù) reAnti基因抑制了Anti基因的翻譯過程，不能合成相應(yīng)的抗原（reAnti基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA與Anti基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA形成了雙鏈，不能翻譯合成相應(yīng)的抗原）
【解析】
（l）利用PCR技術(shù)對reAnti基因進行擴增，其原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在構(gòu)建基因表達載體時，用兩種不同的限制酶切割reAnti基因和運載體DNA來獲得不同的黏性末端，是為了防止目的基因和運載體DNA自身環(huán)化和反向連接（使目的基因定向連接到運載體上）。
（2）動物組織的細胞之間相連的物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以用胰蛋白酶或膠原蛋白酶對動物組織進行處理，使其水解成小分子物質(zhì)，從而使動物組織分散成細胞懸液。
基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌，枯草桿菌，土壤農(nóng)桿菌，酵母菌和動植物細胞等。其中，對于細菌或植物細胞，常用質(zhì)粒作為載體將目的基因?qū)敫惺軕B(tài)細胞內(nèi)；動物細胞則用顯微注射的方法，將含有reAnti基因的表達載體導(dǎo)入豬成纖維細胞。再將該轉(zhuǎn)基因豬的細胞核注入減數(shù)第二次分裂中期的卵母細胞中，構(gòu)建重組胚胎。
（3）胚胎培養(yǎng)液中除了一些無機鹽和有機鹽外，還需要添加“兩酸、兩素”以及動物血清，其中的“兩酸”是指氨基酸和核苷酸，兩素指維生素和激素。
（4）用DNA分子雜交技術(shù)技術(shù)檢測出轉(zhuǎn)基因克隆豬的細胞核DNA中含有reAnti基因，但器官表面不含有抗原，原因是reAnti基因抑制了Anti基因的翻譯過程，不能合成相應(yīng)的抗原（reAnti基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA與Anti基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA形成了雙鏈，不能翻譯合成相應(yīng)的抗原）。
4．（2020·西北狼聯(lián)盟高三一診模擬）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種自身免疫病，致殘性強。研究表明，該病的病理改變與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）密切相關(guān)，而一種人鼠嵌合的抗TNF-α單克隆抗體能有效治療RA。下圖為該單克隆抗體制備過程示意圖。

（1）圖中的抗原A是______________，常用的促融劑是_______________。細胞融合完成后，融合體系中除含有未融合的細胞和雜交瘤細胞外，可能還有骨髓瘤細胞自身融合細胞、淋巴細胞自身融合細胞。體系中出現(xiàn)多種類型細胞的原因是________________。
（2）HAT培養(yǎng)基的作用是經(jīng)選擇性培養(yǎng)篩選出雜交瘤細胞，之后還需要進行__________培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得能分泌單一抗體的雜交瘤細胞。最后獲得的雜交瘤細胞只能產(chǎn)生一種單一抗體的原因是___________________。
（3）單克隆抗體的特點是__________________。單克隆抗體的制備涉及細胞工程中的動物細胞融合技術(shù)和____________技術(shù)。
（4）單克隆抗體主要的用途有：_______________________________（至少答兩點）。
【答案】腫瘤壞死因子-α（或TNF-α） 聚乙二醇（PEG） 細胞融合是隨機的，且融合率達不到100% 克隆化培養(yǎng) 每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體 特異性強、靈敏度高、可大量制備 動物細胞培養(yǎng) 作為診斷試劑、用于治療疾病、用于運載藥物
【解析】
（1）要制備抗TNF-a單克隆抗體需要給小鼠注射腫瘤壞死因子a(TNF-a)，即圖中的抗原A。常用物理或化學(xué)方法促融，最常用的化學(xué)促融劑是聚乙二醇(PEG)，細胞融合完成后，由于細胞融合是隨機的，且融合率達不到100%，所以細胞融合完成后，融合體系中除含有未融合的細胞和雜交瘤細胞外，可能還有骨髓瘤細胞自身融合細胞、淋巴細胞自身融合細胞。
（2）HAT培養(yǎng)基的作用是選擇性培養(yǎng)篩選出雜交瘤細胞，在抗體檢測之前需要進行克隆化培養(yǎng)，以增加雜交瘤細胞數(shù)量。經(jīng)多次篩選，就可獲得能分泌單一抗體的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞只能產(chǎn)生一種單一抗體的原因是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。
（3）單克隆抗體典型優(yōu)點是特異性強、靈敏度高、可大量制備。動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是動物細胞工程的基礎(chǔ)，單克隆抗體技術(shù)是動物細胞工程的應(yīng)用之一。故單克隆抗體的制備涉及細胞工程中的動物細胞融合技術(shù)和動物細胞培養(yǎng)技術(shù)。
（4）單克隆抗體最廣泛的用途是作為診斷試劑，也可用于治療疾病、用于運載藥物，主要是用于癌癥治療、也有少量是是用于其他治療的。
5．波爾山羊被稱為世界“肉用山羊之王”，某公司通過胚胎工程技術(shù)能快速繁殖大量波爾山羊?；卮鹣铝袉栴}：
(1)山羊體外受精主要包括__________和受精等幾個主要步驟。用__________(填激素名稱)處理方法促進其排卵，從輸卵管中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。精子獲能處理通常采用培養(yǎng)法和_________________。
(2)培養(yǎng)早期胚胎時，所用培養(yǎng)液的成分比較復(fù)雜，除了一些___________類外，還需要添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分，以及血清等物質(zhì)。不同胚胎移植時間一般不同，山羊一般要培養(yǎng)到___________階段才能進行移植。，
(3)為了使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致，處理方法是_________________。
(4)移植后的胚胎能在受體子宮中存活的生理基礎(chǔ)是____________________。
【答案】卵母細胞的采集和培養(yǎng)、精子的采集和獲能 促性腺激素 化學(xué)誘導(dǎo)法 無機鹽和有機鹽 桑椹胚階段或囊胚階段 對供體和受體母畜進行同期發(fā)情處理 受體子宮對外來胚胎不發(fā)生排斥反應(yīng)
【解析】
（1）山羊體外受精主要包括卵母細胞的采集和培養(yǎng)、精子的采集和獲能以及受精等幾個主要步驟。用促性腺激素處理方法促進其排卵，從輸卵管中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。精子獲能處理通常采用培養(yǎng)法和化學(xué)誘導(dǎo)法，化學(xué)誘導(dǎo)法即將精子放在一定濃度的肝素或鈣離子載體A23187溶液中獲能。
（2）培養(yǎng)早期胚胎時，所用培養(yǎng)液除了一些無機鹽和有機鹽類外，還需要添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分，以及血清等物質(zhì)。不同胚胎移植時間一般不同，山羊一般要培養(yǎng)到桑樵胚階段或囊胚階段才能進行移植。
（3）為了使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致，處理方法是對供體和受體母畜進行同期發(fā)情處理。
（4）移植后的胚胎能在受體子宮中存活的生理基礎(chǔ)是受體子宮對外來胚胎不發(fā)生排斥反應(yīng)。
6．在人體內(nèi)胰島素基因表達可合成出一條稱為前胰島素原的肽鏈，此肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)酶Ⅰ切割掉氨基端一段短肽后成為胰島素原。進入高爾基體的胰島素原經(jīng)酶Ⅱ切割，去除中間片段C后，產(chǎn)生A、B兩條肽鏈，再經(jīng)酶Ⅲ作用生成由51個氨基酸殘基組成的胰島素。 目前，利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)胰島素。
（1）人體細胞內(nèi)合成前胰島素原的細胞器是_______。胰島素原由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w，體現(xiàn)了生物膜具有_______性。
（2）你認為酶Ⅰ～Ⅲ是否為同種酶？_______。你作出此判斷的理由是_______。
（3）利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)胰島素原過程中：
①可根據(jù)胰島素原的氨基酸序列，設(shè)計并合成編碼胰島素原的_______序列，用該序列與_______構(gòu)建胰島素原基因重組表達載體。根據(jù)DNA的結(jié)構(gòu)及組成，分析不同物種的DNA能拼接在一起的原因是_______。
②將重組表達體導(dǎo)入工程菌內(nèi)，誘導(dǎo)目的基因表達。用胰島素原的_____（填“抗體”或“抗原”）檢測工程菌的提取物。若提取物發(fā)生反應(yīng)，則用該工程菌進行_____（填“液體”或“固體”）發(fā)酵。
【答案】核糖體 流動 不同 酶具有專一性，它們催化的底物不同 DNA 質(zhì)粒 不同物種的DNA都具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，基本組成單位都是4種脫氧核苷酸 抗體 液體
【解析】
（1）胰島素原的化學(xué)本質(zhì)是多肽（蛋白質(zhì)），合成場所在核糖體；胰島素原由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w，依賴于生物膜的流動性；
（2）酶具有專一性，由題干信息可知：酶Ⅰ的作用是切割氨基端，酶Ⅱ的作用是切割去除胰島素原的中間片段C，酶Ⅲ的作催化51個氨基酸殘基組成胰島素，它們催化的底物不同，可知三種酶不同；
（3）①根據(jù)胰島素原的氨基酸序列，可設(shè)計并合成編碼胰島素原的DNA序列（即目的基因），用該序列與質(zhì)粒（運載體）構(gòu)建胰島素原基因重組表達載體；由于不同物種的DNA都具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，基本組成單位都是4種脫氧核苷酸，故不同物種的DNA能拼接在一起；
②檢測目的基因是否表達，應(yīng)用抗原-抗體雜交技術(shù)，即用胰島素原的抗體檢測工程菌的提取物；工程菌通常用液體進行發(fā)酵。
7．通過基因工程研制的某新型基因治療藥物，其本質(zhì)是利用腺病毒和人P53基因（抑癌基因）拼裝得到的重組病毒。人的P53蛋白可對癌變前的DNA損傷進行修復(fù)，使其恢復(fù)正常，或誘導(dǎo)其進入休眠狀態(tài)或細胞凋亡，阻止細胞癌變。該藥物的載體采用第一代人5型腺病毒，其致病力很弱，其基因不整合到宿主細胞的基因組中，無遺傳毒性；載體經(jīng)基因工程改造后，只對細胞實施一次感染，不能復(fù)制，不會污染。請回答下列問題：
（1）在該藥物的生產(chǎn)中，為了獲得更高的安全性能，在載體一般應(yīng)具備的條件中，科學(xué)家選擇性地放棄了一般載體都應(yīng)該具有的_________________（在“能自我復(fù)制”“有多個限制性酶切位點”“在宿主細胞中能穩(wěn)定保存”中選答）。檢測P53基因基因是否插入到染色體上，可從分子水平上檢測，方法是___________。
（2）如果要獲取人類基因組中抑癌基因P53，可以采取的方法通常包括_____________和人工方法合成。目的基因的大量擴增則可以采用_________________技術(shù)，該技術(shù)中需使用一種特殊的酶是_________________。
（3）如果要獲得胚胎干細胞進行研究，則胚胎干細胞可來源于______________的內(nèi)細胞團，或胎兒的原始性腺，也可以通過_________________技術(shù)得到重組細胞后再進行相應(yīng)處理獲得。在培養(yǎng)液中加入_________________，如牛黃酸等化學(xué)物質(zhì)時就可以誘導(dǎo)胚胎干細胞向不同類型的組織細胞分化，這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段。
【答案】能自我復(fù)制 DNA分子雜交技術(shù) 自然界已有物種分離 PCR 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶） 囊胚期 核移植 分化誘導(dǎo)因子
【解析】
（1）據(jù)題意可知，載體經(jīng)基因工程改造后，只對細胞實施一次感染，不能復(fù)制，不能污染。故在載體一般應(yīng)具備的條件中，科學(xué)家選擇性地放棄了一般載體都應(yīng)該具有的自我復(fù)制功能。檢測P53基因的表達產(chǎn)物，可從分子水平上檢測，采用DNA分子雜交技術(shù)。
（2）如果要獲取人類基因組中抑癌基因P53，可以采取的方法通常包括從從基因文庫獲取和通過化學(xué)方法人工合成。目的基因的大量擴增則可以采用PCR技術(shù)，該技術(shù)中因需要高溫處理，故需使用的一種特殊的酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
（3）在研究中如果要獲得胚胎干細胞進行研究，則胚胎干細胞可來源于囊胚期的內(nèi)細胞團，或胎兒的原始性腺，也可以通過核移植技術(shù)得到重組細胞后再進行相應(yīng)處理獲得。在培養(yǎng)液中加入分化誘導(dǎo)因子，可以誘導(dǎo)胚胎干細胞向不同類型的組織細胞分化。
8.研究人員利用小鼠的單倍體ES細胞（只有一個染色體組），成功培育出轉(zhuǎn)基因小鼠。其主要技術(shù)流程如圖所示，請分析回答下列問題：

（1）利用PCR技術(shù)可以擴增目的基因，PCR反應(yīng)體系中除含緩沖液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物外，還應(yīng)含有____；引物應(yīng)選用下圖中____（填圖中字母）。

（2）在基因工程操作步驟中，過程①②稱為 ___。已知氨芐青霉素不能有效殺死小鼠細胞，而一定濃度的G418能有效殺死不具有Neo′的小鼠細胞。結(jié)合上圖推測， 過程①選用的兩種限制酶是 ___（填圖中的編號），③處的培養(yǎng)液應(yīng)添加____（填“氨芐青霉素”或“G418”）。
（3）圖中桑椹胚需通過____技術(shù)移入代孕小鼠子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進行該操作前需對受體小鼠進行____處理。
【答案】熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（或Taq酶） A和D 基因表達載體的構(gòu)建 Ⅰ和Ⅱ G418 胚胎移植 同期發(fā)情
【解析】
（1）根據(jù)分析可知，PCR反應(yīng)體系中除含緩沖液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物以外，還應(yīng)含有耐高溫的DNA聚合酶。為了擴增目的基因的片段，根據(jù)圖示可知需要在引物A和D作用下以目的基因的兩條鏈為模板合成子代目的基因。
（2）由圖可知，過程①②是將目的基因和運載體連接形成重組質(zhì)粒，即基因表達載體的構(gòu)建過程。重組質(zhì)粒上的抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，其作用是有利于篩選出含有目的基因的細胞。根據(jù)題意可知，氨芐青霉素不能有效殺死小鼠細胞，而一定濃度的G418能有效殺死不具有Neo′的小鼠細胞，因此應(yīng)選擇Neo′作為標(biāo)記基因，即質(zhì)粒上Neo′不能用限制酶切割，則過程①應(yīng)選用Ⅰ和Ⅱ兩種限制酶，圖中③處的培養(yǎng)液應(yīng)添加G418以便于起到篩選的作用。
（3）將桑椹胚通過胚胎移植技術(shù)移入代孕小鼠子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進行該操作前需對受體小鼠進行同期發(fā)情處理，以保證供體與受體處于相同或相近的生理狀態(tài)。
9.家蠶細胞具有高效表達外源基因能力。將人干擾素基因?qū)爰倚Q細胞并大規(guī)模培養(yǎng)，可以提取干擾素用于制藥。
（1）進行轉(zhuǎn)基因操作前，需用________酶短時處理幼蠶組織，以便獲得單個細胞。
（2）為使干擾素基因在家蠶細胞中高效表達，需要把來自cDNA文庫的干擾素基因片段正確插入表達載體的__________和__________之間。導(dǎo)入家蠶細胞后若要檢測干擾素基因在家蠶細胞中是否表達，可以采用的方法有___________________。
（3）培養(yǎng)家蠶細胞時，貼壁生長的細胞會產(chǎn)生接觸抑制。通常將多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反應(yīng)器中，這樣可以_________________，增加培養(yǎng)的細胞數(shù)量，也有利于空氣交換。
（4）“?；~塘”生態(tài)系統(tǒng)能充分利用廢棄物中的能量，形成“無廢棄物農(nóng)業(yè)”，這主要是遵循生態(tài)工程的__________原理。同時，通過飼養(yǎng)家禽、家畜，栽培食用菌，提高農(nóng)民經(jīng)濟收入，使保護環(huán)境和發(fā)展經(jīng)濟相互協(xié)調(diào)，這又體現(xiàn)了生態(tài)工程的_________原理。
【答案】胰蛋白酶（或膠原蛋白酶） 啟動子 終止子 分子雜交技術(shù)和抗原-抗體雜交法 增大細胞貼壁生長的附著面積 物質(zhì)循環(huán)再生 整體性
【解析】
（1）動物細胞培養(yǎng)時，需要用胰蛋白酶處理動物組織，以便獲得單個細胞；
（2）基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因。啟動子位于目的基因的首端，終止子位于目的基因的尾端，故為使干擾素基因在家蠶細胞中高效表達，需要把來自cDNA文庫的干擾素基因片段正確插入表達載體的啟動子和終止子之間；基因表達包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個步驟，要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄，可采用分子雜交技術(shù)，要檢測目的基因是否翻譯，可采用抗原-抗體雜交法；
（3）培養(yǎng)家蠶細胞時，貼壁生長的細胞會產(chǎn)生接觸抑制，通常將多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反應(yīng)器中，這樣可以增大細胞貼壁生長的附著面積，增加培養(yǎng)的細胞數(shù)量，也有利于空氣交換；
（4）“?；~塘”生態(tài)系統(tǒng)能充分利用廢棄物中的能量，形成“無廢棄物農(nóng)業(yè)”，這主要是遵循生態(tài)工程的物質(zhì)循環(huán)再生原理；同時，通過飼養(yǎng)家禽、家畜，栽培食用菌，提高農(nóng)民經(jīng)濟收入，使保護環(huán)境和發(fā)展經(jīng)濟相互協(xié)調(diào)，這又體現(xiàn)了生態(tài)工程的整體性原理。
10.2018年11月，一對名為“露露”和“娜娜”的基因編輯嬰兒的誕生引發(fā)了國內(nèi)巨大的爭議?；蚓庉嬤^程的實質(zhì)是用特殊的引導(dǎo)序列將“基因剪刀--Cas9酶”精準定位到所需修飾的基因上然后進行編輯?；卮鹣铝袉栴}：
（1）科學(xué)家用______法將特殊的引導(dǎo)序列與“基因剪刀--Ca9酶”導(dǎo)入目的細胞，上述實例中目的細胞為______。
（2）“露露”與“娜娜”其實也是試管嬰兒，試管嬰兒需讓成熟且______的精子與成熟的卵細胞結(jié)合形成受精卵，然后進行早期胚胎培養(yǎng)。該時期所用培養(yǎng)液中含有的物質(zhì)有無機鹽和有機鹽類、氨基酸、維生素、______、______、水和血清等。
（3）一個處于囊胚期的早期胚胎經(jīng)過______技術(shù)可形成兩個甚至多個胚胎，該技術(shù)操作的關(guān)鍵是要做到將______，若科學(xué)家想在早期胚胎時就知道“露露”的性別，可通過______實現(xiàn)。
【答案】顯微注射 受精卵 獲能 激素 核苷酸 胚胎分割 內(nèi)細胞團均等分割 取囊胚期胚胎的滋養(yǎng)層細胞進行染色體（或DNA）分析
【解析】
(1) 將特殊的引導(dǎo)序列與“基因剪刀——Ca9酶”導(dǎo)入目的細胞是受精卵細胞，采用顯微注射法。
（2）體外受精需要將成熟的精子獲能后與成熟的卵細胞結(jié)合形成受精卵；早期胚胎培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基需要加入無機鹽和有機鹽類、氨基酸、維生素、激素、核苷酸、水和血清等。
（3）將囊胚期的早期胚胎采用胚胎分割技術(shù)可形成兩個甚至多個胚胎，該技術(shù)操作的關(guān)鍵是要做到將內(nèi)細胞團均等分割，取囊胚期胚胎的滋養(yǎng)層細胞進行染色體（或DNA）分析可以判斷胎兒的性別。
11.下圖是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒PO具有四環(huán)素抗性基因 ( telr)和氨芐青霉索抗性基因(ampr)。請回答下列問題：

(1)基因工程中所用的目的基因可以從自然界中已有的物種中分離出來，也可以 _________。利用PCR技術(shù)擴增目的基因片段時，常使用的酶是____ 。
(2)重組載體構(gòu)建的過程中所需的酶有 ____和 ____。
(3)為進一步鑒定菌體是否含有重組質(zhì)粒P3，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表（“+”代表生長，“-”代表不生長）。
菌落類型
平板類型
A
B
C
無抗生素
+
+
+
氨芐青霉素
+
-
+
四環(huán)素
+
-
-
氨芐青霉素+四環(huán)素
+
-
-
根據(jù)表中結(jié)果判斷，A、B、C菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是____、____、____。
(4)將目的基因?qū)雱游锛毎某Ｓ梅椒ㄊ莀___。
【答案】用人工的方法合成 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（或“Taq酶”或“Taq DNA聚合酶”） 限制性核酸內(nèi)切酶（或“限制酶”或“EcoR V”） DNA連接酶 已導(dǎo)入質(zhì)粒PO 未導(dǎo)入質(zhì)粒 已導(dǎo)入質(zhì)粒P3 顯微注射技術(shù)
【解析】
(1) 基因工程中所用的目的基因可以從自然界中已有的物種中分離出來，也可以用人工的方法合成。利用PCR技術(shù)擴增目的基因片段時，所控制的溫度條件至少為50℃左右，常使用的酶是具有耐高溫特性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶（或“Taq酶”、“Taq DNA聚合酶”）。
(2) 重組載體構(gòu)建的過程中，需使用限制酶（EcoRV）切割載體質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，再用DNA連接酶將切割后的載體質(zhì)粒和目的基因連接起來。
(3) 由圖可知：用限制酶（EcoRV）切割后破壞了四環(huán)素抗性基因（tetr），但是沒有破壞氨芐青霉素抗性基因（ampr），因此含有重組質(zhì)粒P3的菌落在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長，但在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長。分析表中信息：A菌落在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中都能夠生長，說明其菌體中含有的氨芐青霉素抗性基因（ampr）和四環(huán)素抗性基因（tetr）的結(jié)構(gòu)均完好，因此已導(dǎo)入質(zhì)粒PO。B菌落在含有任何抗生素的培養(yǎng)基中都不能生長，說明其菌體中不含有ampr tetr，所以未導(dǎo)入質(zhì)粒。C菌落在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長，但在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長，說明其菌體中含有的ampr的結(jié)構(gòu)完好，而含有的tetr的結(jié)構(gòu)被破壞，因此C菌落已導(dǎo)入質(zhì)粒P3。
(4) 將目的基因?qū)雱游锛毎?，常用顯微注射技術(shù)。
12.利用基因工程生產(chǎn)胰島素有三種方法：一是將胰島素基因轉(zhuǎn)入細菌細胞，進行微生物培養(yǎng)，提取胰島素；二是將胰島素基因轉(zhuǎn)入小鼠等動物細胞，進行細胞培養(yǎng)，提取胰島素；三是將胰島素基因轉(zhuǎn)入高等哺乳動物的受精培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因動物并從其乳汁或尿液中提取胰島素。
（1）三種方法中，哪種方法得到的胰島素需要進一步加工和修飾以使其獲得生物活性?____________。方法二和方法三將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的方法是_________________
（2）轉(zhuǎn)胰島素基因?？赏ㄟ^分泌乳汁來生產(chǎn)人胰島素，在轉(zhuǎn)入牛受精卵的基因表達載體中，人胰島素基因的首端必須含有________________________。轉(zhuǎn)入目的基因的牛受精卵要在___________________期取____________________細胞進行性別鑒定。為提高胚胎的利用效率，可以通過胚胎分割技術(shù)得到同卵雙犢，在分割時，應(yīng)將_______________________均等分割。
（3）大腸桿菌和酵母菌均可作為生產(chǎn)胰島素的工程菌，該類工程菌的優(yōu)點是_______。(至少答出兩點)
（4）用基因工程生產(chǎn)的胰島素被注射到患者血液中容易被分解，使治療效果受到影響?？茖W(xué)工作者通過對傳統(tǒng)胰島素進行改造，生產(chǎn)出不易被分解的高效胰島素，這屬于生物工程中__________________________的范疇。
【答案】方法一 顯微注射法 乳腺蛋白基因的啟動子 囊胚 滋養(yǎng)層 囊胚的內(nèi)細胞團 單細胞、繁殖快 蛋白質(zhì)工程
【解析】
（1）細菌沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，其生產(chǎn)的胰島素需在體外進行加工修飾以獲得生物活性；將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ秋@微注射法；
（2）轉(zhuǎn)胰島素基因牛可通過分泌乳汁來生產(chǎn)人胰島素，為使目的基因正常表達，人胰島素基因的首端必須含有乳腺蛋白基因的啟動子；進行性別鑒定時，可選取發(fā)育到囊胚期的滋養(yǎng)層細胞進行鑒定；利用胚胎分割技術(shù)時，為保證子代的成活率和生長一致性，應(yīng)將囊胚的內(nèi)細胞團均等分割；
（3）大腸桿菌和酵母菌均為單細胞生物，繁殖速度快，可快速獲得大量產(chǎn)物，且產(chǎn)物容易提取，故均可作為生產(chǎn)胰島素的工程菌；
（4）對胰島素基因進行修飾，生產(chǎn)出不易被分解的高效胰島素，這屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。
13.如圖的兩幅圖是制備單克隆抗體的示意圖，請據(jù)圖回答下列問題：

（1）圖1和圖2所示過程中，都必須用到的動物細胞工程技術(shù)是________。用PCR技術(shù)擴增無限增殖基因除需要原料、能量、模板外還需要________和________。
（2）圖1中②過程與植物原生質(zhì)體融合的不同之處是用________誘導(dǎo)，圖2中B所示的細胞特點是________。
（3）培養(yǎng)雜交瘤細胞時應(yīng)保證被培養(yǎng)的細胞處于________的環(huán)境?？贵w在抵抗外來病原體入侵方面具有十分重要的作用，這體現(xiàn)了免疫系統(tǒng)的________功能。
（4）十九大提出“綠水青山就是金山銀山”，要實現(xiàn)這一目標(biāo)不僅需要對破壞的生態(tài)環(huán)境進行恢復(fù)，還要考慮當(dāng)?shù)厝说慕?jīng)濟發(fā)展和生活需要，這主要遵循了生態(tài)工程的________。
【答案】動物細胞培養(yǎng) 引物 Taq酶 滅活的病毒 既能無限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體 無菌無毒 防衛(wèi) 整體性原理
【解析】
（1）制備單克隆抗體的技術(shù)屬于生物技術(shù)的動物細胞工程，都需要使用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)。PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)；其原理是DNA復(fù)制，需要一定的條件，包括模板DNA、能量、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。
（2）圖1中的②表示B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，常在聚乙二醇（滅活的病毒、電刺激等）誘導(dǎo)下完成，與植物原生質(zhì)體融合的不同之處是用滅活的病毒誘導(dǎo)，圖2中B為雜交瘤細胞既能無限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體。
（3）培養(yǎng)雜交瘤細胞時應(yīng)保證被培養(yǎng)的細胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環(huán)境中。免疫系統(tǒng)具有監(jiān)控，防衛(wèi)，清除功能，抗體抵抗外來病原體入侵體現(xiàn)了免疫系統(tǒng)的防衛(wèi)功能。
（4）十九大提出“綠水青山就是金山銀山”，要實現(xiàn)這一目標(biāo)不僅需要對破壞的生態(tài)環(huán)境進行恢復(fù)，還要考慮當(dāng)?shù)厝说慕?jīng)濟發(fā)展和生活需要，這主要遵循了生態(tài)工程的整體性原理。
14.為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與Ti質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中?；卮鹣铝袉栴}：

（1） PCR技術(shù)所用到的關(guān)鍵酶是__________，利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是__________。
（2）圖1是花色基因C兩側(cè)被EcoR I酶切后所形成的末端結(jié)構(gòu)，請寫出EcoR I酶識別序列并標(biāo)出切點：__________（用“↓”表示切點位置）。圖2中EcoRI酶所識別的位點應(yīng)在Ti質(zhì)粒的__________片段上。
（3）將導(dǎo)人目的基因的菊花細胞培養(yǎng)成植株需要利用__________技術(shù)，其原理是__________。
（4）在個體生物學(xué)水平上，如何鑒定轉(zhuǎn)基因菊花培育是否成功？____________________
【答案】熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶） 要根據(jù)這一序列合成引物 G↓AATTC T-DNA 植物組織培養(yǎng) 植物細胞具有全能性 觀察轉(zhuǎn)基因菊花是否表現(xiàn)出基因C所控制的花色
【解析】
（1）由于PCR技術(shù)應(yīng)用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，在高溫情況下進行，該過程需要的關(guān)鍵酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶；該過程中要有一段已知目的基因的核苷酸系列，以便根據(jù)這一序列合成引物；
（2）根據(jù)酶切后形成的序列，可以推測出EcoR I酶識別的序列為GAATTC，且在酶切以后單獨形成一個G，所以酶切位點為G↓AATTC；由于后續(xù)需要將目的基因?qū)氲绞荏w細胞中，所以會將目的基因轉(zhuǎn)移至Ti質(zhì)粒的T-DNA片段上；
（3）目的基因?qū)氲街参锛毎?，從而培育出新的植一般都需要植物組織培養(yǎng)技術(shù)的協(xié)助；該過程應(yīng)用的原理是植物細胞具有全能性；
（4）目的基因的檢測在個體水平上需要觀察到明顯的性狀變化或蛋白質(zhì)的合成，因此該過程需要觀察轉(zhuǎn)基因菊花是否表現(xiàn)出基因C所控制的花色。
15.酵母菌是一類在自然界中分布廣泛的單細胞真菌，可以利用酵母菌制作果酒。請回答下列問題：
（1）果酒的制作離不開酵母菌。酵母菌中將葡萄糖分解為酒精的酶分布于__________。酵母菌大量繁殖除了需要果汁外，還要控制的條件有___________（答兩點）等。
（2）某小組將三種酵母菌分別接種在相同濃度的培養(yǎng)液中，在相同且適宜條件下密閉發(fā)酵。實驗中需輕輕搖晃瓶子并擰松瓶蓋，請分析其中的原理：______________。每隔一段時間對發(fā)酵瓶進行稱重，然后計算其失重量。失重量最大的發(fā)酵瓶相對應(yīng)的菌種對酒精的耐力________________。
（3）固定化酵母細胞多采用________法固定，與固定化酶相比，固定化細胞的優(yōu)缺點有____________________。
【答案】細胞質(zhì)基質(zhì) 有氧（氧氣）、溫度20℃左右 酒精發(fā)酵過程中有CO2產(chǎn)生，輕輕搖晃有利于放氣，擰松但不打開瓶蓋可在一定程度上防止雜菌污染 較大 包埋 優(yōu)點：可催化一系列反應(yīng)、成本低，操作簡單、易回收；缺點：不容易與反應(yīng)物接觸，反應(yīng)效率低
【解析】
（1）酵母菌將葡萄糖分解為酒精的過程屬于無氧呼吸，在細胞質(zhì)基質(zhì)中進行，故酵母菌中將葡萄糖分解為酒精的酶也分布于細胞質(zhì)基質(zhì)中。酵母菌大量繁殖需要果汁為其提供碳源、氮源、水和無機鹽，還要控制的條件有有氧、溫度20℃左右等。
（2）某小組將三種酵母菌分別接種在相同濃度的培養(yǎng)液中，在相同且適宜條件下密閉發(fā)酵。酒精發(fā)酵過程中有CO2產(chǎn)生，故實驗中需輕輕搖晃瓶子并擰松瓶蓋而不打開，有利于放氣，同時可以防止雜菌污染。每隔一段時間進行稱重，然后計算發(fā)酵瓶的失重量，發(fā)酵瓶失重是由于有CO2放出，因此失重量最大的發(fā)酵瓶相對應(yīng)的菌種釋放CO2多，產(chǎn)生酒精多，對酒精的耐力較大。
（3）固定化酵母細胞多采用包埋法固定，與固定化酶相比，固定化細胞可催化一系列反應(yīng)、成本低、操作簡單、易回收，但不容易與反應(yīng)物接觸、反應(yīng)效率低。
16.GOLS2基因表達可提高植物細胞內(nèi)糖類含量，降低植物葉片氣孔開度?？蒲腥藛T將擬南芥GOLS2基因?qū)瞬⒄系剿救旧w上。請回答下列問題：
（1）從cDNA文庫中獲得的目的基因___________ （填“含有”或“不含有”）啟動子和終止子。通過PCR技術(shù)獲取GOLS2基因的原理是_________________________，需設(shè)計_____種引物。
（2）GOLS2基因可以整合到水稻染色體上的遺傳學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)是____________。需將GOLS2基因拼接在運載體上才能成功轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化指的是___________________。
（3）基因表達載體的組成除了GOLS2基因外，還必須有___________等；在構(gòu)建基因表達載體過程中，常把兩個啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在GOLS2基因上游，雙啟動子的作用可能是________________，進一步提高細胞內(nèi)糖類含量。
【答案】不含有 DNA 雙鏈復(fù)制 2 不同生物DNA分子的基本結(jié)構(gòu)相同 目的基因進人受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程 標(biāo)記基因、啟動子、終止子 保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（表達）
【解析】
（1）cDNA基因文庫中的DNA是通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，所以從cDNA文庫中獲得的目的基因不含有啟動子和終止子。通過PCR技術(shù)獲取GOLS2基因的原理是DNA雙鏈復(fù)制，需設(shè)計2種引物。
（2）由于不同生物DNA分子的基本結(jié)構(gòu)相同，所以GOLS2基因可以整合到水稻染色體上?；蚬こ讨械霓D(zhuǎn)化指的是目的基因進人受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。
（3）基因表達載體的組成除了GOLS2基因外，還必須有標(biāo)記基因、啟動子、終止子等；在構(gòu)建基因表達載體過程中，常把兩個啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在GOLS2基因上游，雙啟動子的作用可能是保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（表達），進一步提高細胞內(nèi)糖類含量。
17.人體移植器官短缺是一個世界性難題。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸有了新的解決思路：

I.尋求可替代器官
剔除豬的某些基因，用豬的器官作為供體。目前科學(xué)家借助CPISPR—Cas9基因編輯技術(shù)能夠剔除豬的某些相關(guān)基因，如圖為Cas9蛋白依據(jù)sgRNA片段切割DNA示意圖（不同的sgRNA可以識別不同的DNA序列），請回答下列問題：
（1）DNA重組技術(shù)主要用到的工具酶包括DNA連接酶和_____________，圖中充當(dāng)該酶的物質(zhì)是_________________。
（2）Cas9—sgRNA復(fù)合體能夠精準識別某核苷酸序列的原因可能是_____________。
II.自體器官培養(yǎng)
大體思路是：將病人的體細胞核放入去核的卵母細胞中，讓重組細胞發(fā)育為早期胚胎，利用胚胎干細胞誘導(dǎo)分化為特定的器官。
（3）重組細胞體外培養(yǎng)需要一定的O2和CO2，CO2的主要作用是__________；胚胎干細胞的功能特點為：______________。
（4）該過程的核心技術(shù)是：_________，該過程依據(jù)的原理是_________。這種方法獲得的器官移植時不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這是因為：_____________。
【答案】限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） Cas9—sgRNA復(fù)合體 sgRNA（是單鏈）可與特定（靶）核苷酸序列堿基互補配對 維持培養(yǎng)液的pH值 具有（發(fā)育的）全能性 （動物體細胞）核移植技術(shù) 動物體細胞的細胞核具有全能性 該器官的遺傳物質(zhì)與原機體基本相同，進入機體后，不會成為抗原，不會發(fā)生免疫排
【解析】
（1）DNA重組技術(shù)主要用到的工具酶包括DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶，圖中充當(dāng)該酶的物質(zhì)是Cas9—sgRNA復(fù)合體。
（2）Cas9—sgRNA復(fù)合體能夠精準識別某核苷酸序列的原因可能是單鏈sgRNA可與特定核苷酸序列堿基互補配對。
（3）重組細胞體外培養(yǎng)需要一定的O2和CO2，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH值；胚胎干細胞的功能特點為：具有發(fā)育的全能性。
（4）該過程的核心技術(shù)是：核移植技術(shù)，該過程依據(jù)的原理是動物體細胞的細胞核具有全能性。這種方法獲得的器官移植時不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這是因為：該器官的遺傳物質(zhì)與原機體基本相同，進入機體后，不會成為抗原，不會發(fā)生免疫排。
18.2019 年中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所利用 CRISPR—Cas9 基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了世界首例核心節(jié)律基因 BMAL1 敲除獼猴模型，并成功用基因敲除猴的體細胞通過克隆技術(shù)培育了5只克隆疾病猴，為節(jié)律紊亂相關(guān)疾病機理的研究提供了比較理想的動物模型。CRISPR—Cas9 基因編輯系統(tǒng)由單鏈向?qū)?RNA（sgRNA）和 Cas9 蛋白組成?；卮鹣铝袉栴}：
（1）科學(xué)家常用______法將 CRISPR—Cas9 基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入獼猴細胞，編輯系統(tǒng)利用 sgRNA 來識別靶基因 DNA，并引導(dǎo) Cas9 蛋白剪切 DNA，使靶基因發(fā)生改變，實現(xiàn)基因敲除。sgRNA 能識別靶基因 DNA 的原因是______________________ 。
（2）在體外培養(yǎng)獼猴體細胞時，需要一定比例的 O2 和 CO2，故通常采用________或_________________________（填實驗器材），將其置于 CO2 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所使用的培養(yǎng)基屬于_________________________（填“合成”或“天然”）培養(yǎng)基，培養(yǎng)基除了滅菌外，還需要通過_____________________________來保證無菌無毒環(huán)境。
（3）進行體細胞克隆選擇去核卵母細胞作為受體細胞，可能原因是 _____________________ （答出兩點）。
（4）克隆猴被用于人類疾病研究與治療中所具有的突出優(yōu)點是_____________________。（答出一點）
【答案】顯微注射 sgRNA 的堿基序列能與靶 DNA 的堿基序列發(fā)生互補結(jié)合 培養(yǎng)皿 松蓋培養(yǎng)瓶 合成 添加一定量的抗生素并定期更換培養(yǎng)液 去核卵母細胞的體積較大，易于進行實驗操作；含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，可以滿足早期胚胎發(fā)育的需要；含有使已經(jīng)分化的細胞核恢復(fù)分裂能力的物質(zhì) 親緣關(guān)系近；克隆動物能減少個體差異的影響
【解析】
（1）將目的基因注入動物細胞常用顯微注射，sgRNA本質(zhì)是RNA，基因 DNA本質(zhì)是DNA分子，都是由核苷酸組成的長鏈，遵循堿基互補配對原則，所以二者能夠識別的原因是sgRNA 的堿基序列能與靶DNA的堿基序列發(fā)生互補結(jié)合。
（2）動物細胞培養(yǎng)可以在培養(yǎng)皿和松蓋培養(yǎng)瓶中進行，將其置于 CO2 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)基需要明確各種化學(xué)成分，所以是合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基需要添加一定量的抗生素（可以殺菌）并定期更換培養(yǎng)液來保證無菌無毒環(huán)境。
（3）去核卵母細胞的體積較大，易于進行實驗操作；含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，可以滿足早期胚胎發(fā)育的需要；含有使已經(jīng)分化的細胞核恢復(fù)分裂能力的物質(zhì)，所以可以作為受體細胞。
（4）猴子與人的親緣關(guān)系近；克隆動物能減少個體差異的影響，所以克隆猴被用于人類疾病研究與治療。
19.動物細胞融合是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。利用細胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。回答下列問題。
（1）細胞融合技術(shù)突破了有性雜交方法的局限，使___________雜交成為可能。誘導(dǎo)動物細胞融合時，常用的誘導(dǎo)因素有______________（答出2點）和滅活的病毒等。
（2）滅活的病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理是：病毒表面含有的____________能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝聚，細胞膜上的____________重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。
（3）把從免疫小鼠的脾臟中提取的B細胞與骨髓瘤細胞混合，體外誘導(dǎo)細胞融合，第一次篩選時，未融合的親本細胞和____________都會死亡，而保留的細胞是_____________，這種細胞的特點是______________________。
【答案】遠緣（或不同物種之間的） 聚乙二醇（或PEG）、電激 糖蛋白和一些酶 蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子 融合的具有同種細胞核的細胞 雜種細胞（或雜交痼細胞） 既能迅速大量繁殖，也能產(chǎn)生抗體
【解析】
（1）細胞融合技術(shù)突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能。誘導(dǎo)動物細胞合時，常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇（PEG）、電激和滅活的病毒等。
（2）滅活病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。
（3）進行細胞融合時，會得到融合的具有相同細胞核的細胞，細胞融合的具有不同細胞核的細胞和未融合的親本細胞。融合的具有不同細胞核的細胞也就是雜種細胞或雜交瘤細胞?！凹饶苎杆俅罅糠敝?，也能產(chǎn)生抗體”是雜交瘤細胞的特點。
20.回答下列與生物工程相關(guān)的問題：
（1）基因工程是指將自然界中已有的一種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，使后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。而被稱為第二代基因工程的蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因____________，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。
（2）基因工程的工具酶之一是限制酶，它主要是從____________中獲得，其特點是___________。質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制酶切位點，這些限制酶切位點的作用是____________。
（3）基因工程的另一種工具酶是DNA連接酶。T4DNA連接酶相比E·coliDNA連接酶，其獨特的作用是____________________。
（4）動物基因工程通常用__________作受體細胞，當(dāng)胚胎發(fā)育到__________階段時，通過__________技術(shù)移入母體子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，暫不移入的胚胎可使用冷凍方法保存。
【答案】修飾或合成 原核生物（或微生物） 能夠識別DNA分子特定的（脫氧）核苷酸序列，并在特定位點切割DNA 供外源DNA片段（基因）插入 可以連接雙鏈DNA片段的平末端 MⅡ中期的卵母細胞（或受精卵） 桑椹胚或囊胚 胚胎移植
【解析】
（1）根據(jù)蛋白質(zhì)工程的定義可知，蛋白質(zhì)工程是是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求；
（2）限制酶是基因工程的“手術(shù)刀”，能夠識別DNA分子特定的（脫氧）核苷酸序列，并在特定位點切割DNA，主要從原核生物中獲得；質(zhì)粒分子限制酶切位點的作用是供外源DNA片段（基因）插入；
（3）E·coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端，故T4DNA連接酶相比E·coliDNA連接酶，其獨特的作用是可以連接雙鏈DNA片段的平末端；
（4）因受精卵的全能性高，故動物基因工程的受體細胞通常是受精卵；為充分發(fā)揮優(yōu)良個體的繁殖潛力，可用胚胎移植的方法來實現(xiàn)，胚胎移植的時期是桑椹胚或囊胚期。
21.現(xiàn)代生物工程技術(shù)推動了醫(yī)藥學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展。例如，為解決不孕不育夫婦的生育問題而出現(xiàn)的試管嬰兒技術(shù)，給千萬家庭帶來了福音，但生物技術(shù)是一把雙刃劍，可以造福人類，若使用不當(dāng)也可能給人類帶來災(zāi)難。請回答下列問題：
（1）試管嬰兒技術(shù)是體外受精技術(shù)、早期胚胎培養(yǎng)和___________技術(shù)等人工助孕技術(shù)的俗稱；通過試管嬰兒技術(shù)繁殖后代屬于___________（填“有性”或“無性”）生殖。
（2）體外受精首先需采集卵子，發(fā)育到____期的卵子能與獲能的精子在___________或___________中完成受精作用。
（3）胚胎移植時，受體對移人子宮的外來胚胎基本上不發(fā)生___________，這為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能；通過試管動物技術(shù)培養(yǎng)發(fā)育成的早期胚胎，再經(jīng)過___________可產(chǎn)生多個基因型相同的后代。
（4）“試管嬰兒”技術(shù)誕生后，繼而出現(xiàn)了“設(shè)計試管嬰兒”技術(shù)，后者可以用于治療需要骨髓移植或造血干細胞移植等疾病。與“試管嬰兒”技術(shù)不同的是，“設(shè)汁試管嬰兒”技術(shù)胚胎在移植前需進行___________。
（5）現(xiàn)在大多數(shù)人反對設(shè)計嬰兒性別，其原因是___________。
【答案】胚胎移植 有性 減數(shù)第二次分裂中 獲能溶液 專用的受精溶液 免疫排斥反應(yīng) 胚胎分割和胚胎移植 遺傳學(xué)診斷 此做法破壞了人類正常的性別比例，違反了倫理道德（答案合理即可給分）
【解析】
（1）試管嬰兒技術(shù)是體外受精技術(shù)、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植技術(shù)等人工助孕技術(shù)的俗稱；試管嬰兒技術(shù)中仍有精子和卵細胞結(jié)合成受精卵的過程，其生殖方式仍然是有性生殖。
（2）體外受精主要包括卵母細胞的采集、精子的獲取和受精等幾個主要步驟。采集的卵子，需將其培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期才具備與精子受精的能力，精子獲能后可以在獲能溶液或?qū)Ｓ玫氖芫芤褐信c培育成熟的卵子完成受精作用形成受精卵。
（3）胚胎移植時，受體對移入子宮的外來胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能。通過試管動物技術(shù)培養(yǎng)發(fā)育成的早期胚胎，再經(jīng)過胚胎分割和胚胎移植可產(chǎn)生多個基因型相同的后代。
（4）“試管嬰兒”技術(shù)主要用于治療不孕不育夫婦的生育問題，而“設(shè)計試管嬰兒”技術(shù)可以用于治療需要骨髓移植或者造血干細胞移植等疾病，且胚胎在移植前需進行遺傳學(xué)診斷。
（5）設(shè)計嬰兒性別等會引起性別比例失調(diào)，違反了倫理道德。
22.人血清白蛋白（HSA）具有重要的醫(yī)用價值。下圖是以基因工程技術(shù)獲取HSA的兩條途徑，其中報告基因表達的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色?；卮鹣铝袉栴}。

（1）基因工程中可通過PCR技術(shù)擴增目的基因。生物體細胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時，解開DNA雙鏈的酶是___________；在體外利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是___________上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA分子雙鏈間的___________。
（2）已知堿性磷酸酶能除去核苷酸末端的5磷酸，構(gòu)建表達載體的過程中用該酶處理Ti質(zhì)粒，但HSA基因不用堿性磷酸酶處理，這樣做的目的是___________，經(jīng)過上述處理后的Ti質(zhì)粒在DNA連接酶的作用下可與HSA基因之間形成___________個磷酸二酯鍵，再經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)構(gòu)完整的重組DNA分子。
（3）過程①中需將植物細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng)后，還應(yīng)轉(zhuǎn)接到含___________的培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化的植物細胞。③過程中將目的基因?qū)刖d羊受體細胞，采用最多，也是最為有效的方法是___________，還可以使用動物病毒作為載體，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。
（4）為檢測HSA基因的表達情況，可提取受體細胞的___________，用抗血清白蛋白的抗體進行雜交實驗。
【答案】解旋酶 加熱至90~95℃ 氫鍵 防止Ti質(zhì)粒發(fā)生自身連接 2 無色物質(zhì)K 顯微注射技術(shù) 蛋白質(zhì)
【解析】
（1）生物體細胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時，在解旋酶的作用下可以解開DNA雙鏈；在體外利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，加熱至90~95℃引起模板DNA解鏈為單鏈，上述兩個解鏈過程均破壞了DNA分子雙鏈間的氫鍵。
（2）為了防止Ti質(zhì)粒發(fā)生自身連接，構(gòu)建表達載體的過程中用該酶處理Ti質(zhì)粒，但HSA基因不用堿性磷酸酶處理。目的基因兩端的序列均與質(zhì)粒連接，故在DNA連接酶的作用下可與HSA基因之間形成2個磷酸二酯鍵，再經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)構(gòu)完整的重組DNA分子。
（3）由于報告基因表達的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色，故過程①中需將植物細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng)后，還應(yīng)轉(zhuǎn)接到含無色物質(zhì)K的培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化的植物細胞。③過程常用顯微注射法將目的基因?qū)刖d羊受體細胞，還可以使用動物病毒作為載體，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。
（4）為檢測HSA基因的表達情況，看其是否表達出HAS，可提取受體細胞的蛋白質(zhì)，用抗血清白蛋白的抗體進行雜交實驗，看是否出現(xiàn)雜交帶。
23.電影《我不是藥神》中的格列寧是一種治療癌癥的靶向藥物，此類靶向藥物可稱為“生物導(dǎo)彈”。利用單克隆抗體來診斷和治療癌癥可能會成為攻克癌癥的重要手段，以下為單克隆抗體制備流程圖：

（1）若該圖中的單克降抗體與藥物結(jié)合制成“生物導(dǎo)彈”治療腸癌，則圖中特定抗原通常是_________。靶向藥物比普通的化療藥物療效高、毒副作用小是因為______________________。
（2）圖中誘導(dǎo)細胞融合時常用的化學(xué)試劑是_____________，選擇性培養(yǎng)基上未融合的親本細胞和_____________的細胞都會死亡，只有__________才能生長。
（3）近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)丁酸鈉對雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體有一定的影響，某科研小組進行了相關(guān)實驗，結(jié)果如下表：
丁酸鈉對雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體的影響
丁酸鈉的濃度（mmo1/L）
時間（h）
48
96
144
0
1∶320
1∶640
1∶1200
0．25
1∶320
1∶1280
1∶2500
0．5
1∶160
1∶2500
1∶2500
0．75
1∶320
1∶320
1∶640
注：（表中比值表示抗體效價，1：#中#值越高表明越有利于抗體的產(chǎn)生）
該實驗過程中培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)瓶放在了含的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，的主要作用是___________，該實驗的自變量為________________。在該實驗基礎(chǔ)上，請設(shè)計實驗：探究培養(yǎng)時間為144h，促進雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體的丁酸鈉的最適濃度。
簡述設(shè)計思路：_______________________。
【答案】（腸）癌細胞（膜）表面的蛋白質(zhì) 既不損傷正常細胞，又減少了用藥劑量 聚乙二醇 融合的具有同種核的細胞 融合的雜種細胞 維持培養(yǎng)液的pH 丁酸鈉的濃度和培養(yǎng)時間 在丁酸鈉濃度范圍內(nèi)，設(shè)置系列更小濃度梯度實驗，培養(yǎng)時間144h，其余條件與原實驗相同，檢測各組抗體效價。（能夠正確體珂自變量的控制即濃度范圍和梯度、無關(guān)變量的控制、因變量檢測指標(biāo)）
【解析】
（1）單克隆抗體在癌癥治療中可作為“生物導(dǎo)彈”，單克隆抗體有兩個V區(qū)，其中一個V區(qū)可以識別癌細胞表面特定的抗原（癌細胞表面的蛋白質(zhì)），另一個V區(qū)可以和T細胞、抗癌藥物、放射性物質(zhì)等結(jié)合，使其定向殺傷癌細胞，將癌細胞消滅掉而不影響正常細胞，所以療效高，毒副作用小。
（2）誘導(dǎo)動物細胞融合常用的誘導(dǎo)因素有電激、聚乙二醇（PEG）、滅活的病毒等。若該過程是制備單克隆抗體，在誘導(dǎo)細胞融合中，所形成的融合細胞有兩兩融合細胞3種：AA型、BB型、AB型，用來培養(yǎng)的融合細胞應(yīng)該是AB型的雜交瘤細胞，從中選擇出它的方法是用選擇性培養(yǎng)基進行篩選，同種自身融合的細胞都不能存活，存活生長的是異種細胞融合的雜交細胞，雜交瘤細胞的特點是：既能無限繁殖，又能產(chǎn)生特異性抗體。
（3）細胞培養(yǎng)應(yīng)在含有5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行，其中CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH。從表格中看出，實驗處理不同的素是丁酸鈉的濃度和處理時間，是實驗的自變量。檢測的指標(biāo)是抗體效價為因變量。實驗數(shù)據(jù)顯示，培養(yǎng)時間為144小時，丁酸鈉的濃度為0.25～0.5 mmo1/L時，抗體效價最高。在這個濃度范圍內(nèi)，為探究更適宜的濃度，可以設(shè)置系列更小濃度梯度的實驗相互對照，按照單克隆抗體的制備過程，在雜交瘤細胞的培養(yǎng)液中，分別加入等量的不同濃度的丁酸鈉溶液，再加入等量的同種雜交瘤細胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)144小時，檢測實驗組抗體的效價，確定較適濃度。
24.有些人飲用牛奶后，不能完全消化牛奶中的乳糖。若將乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M中，可以使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中乳糖含量大大減少，而其他營養(yǎng)成分不受影響。請回答下列問題：
(l)為了獲得乳糖酶基因，可以從人體細胞內(nèi)提取____來合成cDNA，再以cDNA為模板，利用 ___（填中文名稱）擴增乳糖酶基因。
(2)質(zhì)粒載體作為基因工程的運載體，應(yīng)具備的基本條件有 ___（答出兩點）等。按其來源不同，基因工程中使用的DNA連接酶分為兩類，即 _____________。
(3)將重組表達載體導(dǎo)入奶牛受精卵常用的方法是____。為了獲得母牛，需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行 _________。
(4)在胚胎移植前，通過____技術(shù)能獲得多個胚胎從而獲得多個轉(zhuǎn)乳糖酶基因牛，這體現(xiàn)了早期胚胎細胞的 ______。
【答案】mRNA 多聚酶鏈式反應(yīng) 有自我復(fù)制能力；有一個或多個限制酶的切割位點；帶有標(biāo)記基因；分子大小適宜 T4 DNA連接酶和E．coli DNA連接酶 顯微注射法 性別鑒定 胚胎分割 全能性
【解析】
（1）為了獲得乳糖酶基因，可以從人體細胞內(nèi)提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄來合成互補DNA，即cDNA，然后通過多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）短時間內(nèi)大量擴增目的基因。
（2）質(zhì)粒載體作為基因工程的運載體，應(yīng)具備的基本條件有：有自我復(fù)制能力；有一個或多個限制酶的切割位點；帶有標(biāo)記基因；分子大小適宜等?；蚬こ讨惺褂玫腄NA連接酶為：T4 DNA連接酶和E．coli DNA 連接酶。
（3）將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法，為了獲得母牛，需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行性別鑒定。
（4）胚胎分割是指采用機械方法將早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)，通過該技術(shù)能獲得多個胚胎從而獲得多個轉(zhuǎn)乳糖酶基因牛，體現(xiàn)了早期胚胎細胞的全能性。
25.糖尿病已經(jīng)成為危害人類健康的嚴重疾病之一。糖尿病不僅與人們不健康的生活方式有關(guān)，也與患者體內(nèi)胰島素的缺乏有關(guān)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)胰島素的批量生產(chǎn)就成為了目前糖尿病治療的新思路，請回答下列相關(guān)問題：
（1）對于胰島素基因的獲取，一是通過提取____________細胞中的胰島素mRNA，經(jīng)過 _____________過程合成，之后通過 _________技術(shù)大量擴增；二是通過分析胰島素的______________________________序列，進行人工合成。
（2）利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)胰島素的批量生產(chǎn)的過程中，關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)是 ________。這一關(guān)鍵操作的目的是：①使目的基因 ______________________________ ；②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
（3）為了將改造后的分子順利導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，一般需要用Ca2+處理大腸桿菌，使之成為 ______ 細胞。得到的人胰島素需要體外加工才具有生物活性，原因是大腸桿菌 _____________________________________ 。
【答案】胰島B 反轉(zhuǎn)錄 PCR 氨基酸 基因表達載體的構(gòu)建 在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給后代 感受態(tài) 沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，不能對蛋白質(zhì)進行加工
【解析】
（1）對于胰島素基因的獲取，一是通過提取胰島B細胞的胰島素mRNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程合成，之后通過PCR技術(shù)大量擴增；二是氨基酸序列法獲取目的基因，通過分析胰島素的氨基酸序列，進行人工合成。
（2）基因工程的操作步驟中，構(gòu)建基因表達載體是基因工程操作步驟中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。構(gòu)建基因表達載體的目的包括：①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給后代；②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
（3）為了將改造后的分子順利導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，一般需要用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細胞。由于大腸桿菌屬于原核生物，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，不能對蛋白質(zhì)進行加工，因此得到的人胰島素需要體外加工才具有生物活性。
26.GRFT是一種來源于紅藻的外源凝集素，能作為治療艾滋病的候選藥物。某實驗小組將GRFT基因?qū)霟煵菁毎娜旧w基因組中，發(fā)現(xiàn)煙草中GRFT基因的表達量可達60%~90%。請回答下列問題：
（1）將GRFT基因?qū)霟煵菁毎娜旧w基因組的方法為__________，該方法能將GRFT基因?qū)藷煵菁毎娜旧w基因組，利用的是T—DNA具有_________的特點。
（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒時可插入NPTII基因，具有該基因的轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體離體培養(yǎng)時會出現(xiàn)退綠現(xiàn)象，據(jù)此可知重組質(zhì)粒中的NPTII基因?qū)嵸|(zhì)上是一種_________，其作用是_________?；蚬こ讨械倪\載體除了質(zhì)粒外，還有___________。
（3）欲大量獲得GRFT，可利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)將轉(zhuǎn)基因煙草細胞培育到______階段，原因是該階段的細胞具有______________________的特點。
【答案】農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 可轉(zhuǎn)移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體的DNA上 標(biāo)記基因 鑒別受體細胞中是否有目的基因，從而將含自的基因的細胞篩選出來 動植物病毒以及λ噬菌體的衍生物 愈傷組織 分裂、代謝旺盛
【解析】
（1）將GRFT基因?qū)霟煵菁毎娜旧w基因組的方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，該方法能將GRFT基因?qū)霟煵菁毎娜旧w基因組，農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的T-DNA具有可轉(zhuǎn)移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體的DNA上的特點。
（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒時可插入NPTII基因，具有該基因的轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體離體培養(yǎng)時會出現(xiàn)退綠現(xiàn)象，據(jù)此可知重組質(zhì)粒中的NPTII基因?qū)嵸|(zhì)上是一種標(biāo)記基因，其作用是鑒別受體細胞中是否有目的基因，從而將含自的基因的細胞篩選出來?；蚬こ讨械倪\載體除了質(zhì)粒外，還有動植物病毒以及λ噬菌體的衍生物。
（3）欲大量獲得GRFT，可利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)將轉(zhuǎn)基因煙草細胞培育到愈傷組織階段;原因是該階段的細胞分裂、代謝旺盛，可從培養(yǎng)液中大量獲得GRFT。
27.大約有超過1/3的非洲人靠木薯獲取超過一半的熱量，然而以木薯為主食會營養(yǎng)不均衡，鐵和鋅的缺乏在非洲非常常見，嚴重影響了人體的健康?？茖W(xué)家從植物擬南芥中獲得IRTⅠ基因（編碼鐵轉(zhuǎn)運蛋白）和FERⅠ基因（編碼鐵儲存蛋白），從而獲得鐵、鋅含量高的木薯?；卮鹣铝袉栴}：
（1）從擬南芥細胞中獲得IRT1基因的mRNA得到cDNA，依據(jù)的原理是_________，該cDNA不包括基因中的_________部分。
（2）基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心，構(gòu)建成的基因表達載體中，IRT1基因和FERI基因的首端，需加上_______（填“擬南芥”或“木薯”）細胞中能表達基因的啟動子。標(biāo)記基因的作用是____________。
（3）將目的基因?qū)肽臼砑毎胁捎米疃嗟氖莀_____法，生產(chǎn)實踐發(fā)現(xiàn)，損傷的木薯植物更容易被轉(zhuǎn)化，原因是_________。帶有目的基因的細胞經(jīng)過__________技術(shù)培育成轉(zhuǎn)基因植物。
（4）IRTI基因和FERⅠ基因已經(jīng)整合到基因組中的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)，但運輸鐵的能力沒有提高，根據(jù)中心法則的內(nèi)容分析，最可能的原因是___________。
【答案】在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則可以合成cDNA 啟動子和內(nèi)含子 木薯 鑒別和篩選出含有目的基因的細胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 傷口處細胞分泌的酚類化合物，利于農(nóng)桿菌的侵染 植物組織培養(yǎng) IRT1基因未表達（未轉(zhuǎn)錄或未翻譯）
【解析】
（1）在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則可以合成cDNA，從而以擬南芥細胞中獲得IRT1基因的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，但是cDNA不包括基因中的啟動子和內(nèi)含子。
（2）從擬南芥中獲得得IRT1基因和FER1基因是逆轉(zhuǎn)錄出來得cDNA，而后導(dǎo)入到木薯細胞中，所以需要加上木薯細胞中能表達基因的啟動子。標(biāo)記基因的作用是鑒別和篩選出含有目的基因的細胞。
（3）基因工程中導(dǎo)入植物細胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)實踐發(fā)現(xiàn)，損傷的木薯植物更容易被轉(zhuǎn)化，原因是傷口處細胞分泌的酚類化合物，利于農(nóng)桿菌的侵染。帶有目的基因的細胞經(jīng)過植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育成轉(zhuǎn)基因植物。
（4）IRT1基因和FER1基因已經(jīng)整合到基因組中的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)，但運輸鐵的能力沒有提高，所以最可能的原因是IRT1基因未成功表達。
28.2018年7月，某生物公司的百白破疫苗檢驗不符合規(guī)定。為生產(chǎn)高效價疫苗和簡化計劃免疫程序，科學(xué)家研制出基因工程乙肝-百白破(rHB-DTP)四聯(lián)疫苗，經(jīng)各項檢測均通過rHB-DTP四聯(lián)疫苗制檢規(guī)程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳桿菌、白喉桿菌和破傷風(fēng)桿菌的四種類毒素。請分析回答下列問題：
(1)為獲取百日咳桿菌類毒素的基因，可從百日咳桿菌的細胞中提取對應(yīng)____________，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA片段，獲得的cDNA片段與百日咳桿菌中該基因堿基序列__________________(填“相同”或“不同”)。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比較小，且序列已知，獲得目的基因可采用__________，然后通過____________大量擴增，此技術(shù)的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
(3)把目的基因?qū)荏w細胞時，科學(xué)家采用了改造后的腺病毒作為載體，寫出你認為科學(xué)家選它的理由________________________________________________。(寫出2點)
(4)研究發(fā)現(xiàn)，如果將白喉桿菌類毒素20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼幔庖咝Ч?，請寫出此種技術(shù)的基本流程____________________________________。
(5)實驗證明，一定時間內(nèi)間隔注射該疫苗3次效果更好，其主要原因是體內(nèi)產(chǎn)生的_________數(shù)量增多，當(dāng)同種抗原再次侵入人體時二次免疫的特點是____________，免疫預(yù)防作用更強。
【答案】mRNA 不同 化學(xué)方法人工合成（人工化學(xué)合成） PCR技術(shù) 能自主復(fù)制 有多個限制酶切位點、有標(biāo)記基因 從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列 記憶細胞 短時間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的抗體和記憶細胞
【解析】
(1)為獲取百日咳桿菌類毒素的基因，可從百日咳桿菌的細胞中提取對應(yīng)mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA片段，獲得的cDNA片段與百日咳桿菌中該基因堿基序列不同。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比較小，且序列已知，獲得目的基因可采用化學(xué)方法人工合成（人工化學(xué)合成），然后通過PCR技術(shù)大量擴增。
(3)改造后的腺病毒有多個限制酶切位點、有標(biāo)記基因，且能自主復(fù)制，因此可作為載體將目的基因?qū)荏w細胞。
(4)將白喉桿菌類毒素20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼崂玫氖堑鞍踪|(zhì)工程原理，基本流程是：從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列。
(5)實驗證明，一定時間內(nèi)間隔注射該疫苗3次效果更好，其主要原因是體內(nèi)產(chǎn)生的記憶細胞數(shù)量增多，當(dāng)同種抗原再次侵入人體時會引發(fā)二次免疫，二次免疫的特點是短時間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的抗體和記憶細胞，免疫預(yù)防作用更強。
29.含有限制酶的細胞中通常還具有相應(yīng)的甲基化酶，這兩種酶對 DNA 分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以對 DNA 序列進行修飾，使限制酶不能對這一序列進行識別和切割?；卮鹣铝袉栴}：
（1）目前，基因工程中使用的限制酶主要是從__________生物中分離純化獲得的，鑒定其化學(xué)本質(zhì)可用_____________________。構(gòu)建“基因組文庫”和“cDNA文庫”的過程中需要使用DNA連接酶的是____________(填“基因組文庫”、“cDNA 文庫”或“基因組文庫和 cDNA 文庫”）。
（2）含有某種限制酶的細胞，可以利用限制酶切割外源 DNA，但不破壞細胞自身的 DNA，其原因可能有①_______________________；②__________________________。
（3）DNA分子復(fù)制過程需要引物，引物是一小段____________。體外擴增DNA的PCR技術(shù)的中文名稱是______________，PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性和延伸三步。在循環(huán)之前，常要進行一次預(yù)變性，以便_______________________
【答案】原核 雙縮脲試劑 基因組文庫和cDNA文庫 細胞自身的 DNA 分子沒有該限制酶的識別序列 甲基化酶對細胞自身的 DNA 分子進行了修飾 DNA或RNA(核酸) 多聚酶鏈式反應(yīng) 增加大分子模板DNA徹底變性的概率
【解析】
（1）基因工程中常會使用到限制性內(nèi)切酶，而限制性內(nèi)切酶主要是從原核生物中分離純化獲得的，限制性內(nèi)切酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，故鑒定其化學(xué)本質(zhì)可用雙縮脲試劑；在構(gòu)建我們現(xiàn)代的“基因組文庫”和“cDNA”文庫的過程中，所獲取的基因都需要導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存起來，因此都需要使用到的DNA連接酶。
（2）對于某種限制酶切割一定的DNA序列來言，如果細胞自身的DNA分子沒有該限制酶的識別序列，或者甲基化酶對細胞自身的DNA分子進行了修飾，那么由于酶的專一性，這種限制性酶就不會對細胞本身發(fā)揮作用，可以切割外源的DNA，但是不會破壞細胞自身的DNA。
（3）DNA分子復(fù)制過程的引物是一小段DNA或RNA(核酸)。PCR技術(shù)的中文名稱是多聚酶鏈式反應(yīng)，PCR在循環(huán)之前，常要進行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。
30.通過基因工程利用小球藻生產(chǎn)人胰島素能克服利用細菌生產(chǎn)時的諸多不利影響。小球藻可大規(guī)模種植，并且所生產(chǎn)的胰島素可以直接用于醫(yī)療和保健，該技術(shù)能提高小球藻的藥用價值，形成高附加值的生物技術(shù)產(chǎn)品，同時也能降低醫(yī)用蛋白的價格，使人胰島素的應(yīng)用得到普及?；卮鹣铝袉栴}：
（1）基因工程操作的核心步驟是_______________，其目的是使目的基因在受體細胞中________________，并且可以通過復(fù)制遺傳給下一代，同時，使目的基因表達和發(fā)揮作用。
（2）組成基因表達載體的單體是__________，基因表達載體上的啟動子的作用是_____________________。
（3）在生物體外常用PCR技術(shù)來擴增目的基因。PCR的原理是__________________________________。在PCR體系中需要加入dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），dNTP脫去兩個磷酸后形成的物質(zhì)能作為DNA合成的原料，則dATP和ATP在組成成分上的差別是___________________，在PCR體系中____________（填“需要”或“不需要”）加入ATP。
【答案】構(gòu)建基因表達載體 穩(wěn)定存在 脫氧核苷酸 RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，這種結(jié)合完成后才能驅(qū)動目的基因通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA DNA的雙鏈復(fù)制 構(gòu)成dATP的是脫氧核糖，構(gòu)成ATP的是核糖 不需要
【解析】
（1）基因工程的核心步驟是構(gòu)建基因表達載體；構(gòu)建基因表達載體的目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以通過復(fù)制遺傳給下一代，同時，使目的基因表達和發(fā)揮作用。
（2）基因表達載體的本質(zhì)是DNA，其基本組成單位是脫氧核苷酸；基因表達載體中的啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，這種結(jié)合完成后才能驅(qū)動目的基因通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA。
（3）PCR的原理是DNA的雙鏈復(fù)制。在PCR體系中需要加入dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），dNTP脫去兩個磷酸后形成的物質(zhì)能作為DNA合成的原料，則dATP和ATP在組成成分上的差別是構(gòu)成dATP的是脫氧核糖，構(gòu)成ATP的是核糖。在PCR體系中不需要ATP。
31.人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，在維持血漿滲透壓、抗凝血等方面起著重要作用，具有重要的醫(yī)用價值。如圖是用基因工程技術(shù)獲取重組HSA（rHSA）的兩條途徑。

（1）為獲取HSA基因，首先要提取人血細胞中的mRNA，利用_______法合成cDNA，再利用PCR技術(shù)進行快速擴增，在這一過程中，需要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成_______，PCR過程中，溫度降低到55℃的目的是_________________。
（2）構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體時，需要選擇水稻胚乳細胞啟動子，而不能選擇其他物種和組織細胞的啟動子，原因可能是_________________。
（3）在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞的過程中，為了吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞，需添加_________物質(zhì)。
（4）選用大腸桿菌作為受體細胞的優(yōu)點有____________（答出兩點即可）。但相比于水稻胚乳細胞，利用大腸桿菌獲得的rHSA也有一些缺點，請從生物膜系統(tǒng)的角度進行分析_____________________。
（5）利用上述方法獲得的rHSA不能直接用于臨床醫(yī)療，你推測的原因是_____________。
【答案】反轉(zhuǎn)錄 引物 兩種引物通過互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合 啟動子具有（物種及組織）特異性 酚類 繁殖快；單細胞；遺傳物質(zhì)少 大腸桿菌沒有生物膜系統(tǒng)（或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體），不能對rHSA進行深加工 rHSA可能沒有生物活性或功能性較差或rHSA可能有安全隱忠
【解析】
（1）獲取HSA基因，提取人血細胞中的mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下利用反轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，再利用 PCR技術(shù)進行快速擴增，PCR過程中，需要一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物，溫度降低到55℃的目的是兩種引物通過互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。
（2）由于啟動子具有物種或組織特異性，構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體時，需要選擇水稻胚乳細胞啟動子。
（3）酚類物質(zhì)會吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞，在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞的過程中，故需添加酚類物質(zhì)。
（4）大腸桿菌受體細胞的優(yōu)點有繁殖快；單細胞。但相比于水稻胚乳細胞，大腸桿菌沒有生物膜系統(tǒng)（或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體），不能對rHSA進行深加工。
（5）利用上述方法獲得的rHSA可能沒有活性，不能直接用于臨床醫(yī)療。

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