基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外____________和____________等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫做__________技術。 例如，通過轉基因技術，可以實現利用大腸桿菌生產人的胰島素。在此實例中，目的基因是_______________，受體細胞是________________，目的基因的表達產物是____________。
2021人教版（新教材）必修二 遺傳和進化
第1節(jié) 重組DNA技術的基本工具
重組DNA技術所需要的三種基本工具是什么？他們的作用是什么?基因工程載體需要具備什么條件？
DNA重組技術的基本工具是什么？
主要從原核生物中分離純化
根據你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的。
一、限制性核酸內切酶 ——分子手術刀
現在已經從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內核酸切酶(限制酶)。
練習：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘質沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）
大腸桿菌（Escherichia cli R）
（1）識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列
大腸桿菌的EcRⅠ限制酶只能識別GAATTC序列，
（2）在特定的位點切割DNA分子。
特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開
大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成,少數的識別序列由4、5或8個核苷酸組成
1.已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。 （1）則能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割； （2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
……GAATTC…………CTTAAG……
不同來源的DNA片段混合
如何將不同種來源的DNA片段連接起來？
……G　　AATTC…………CTTAA　　G……
1.DNA連接酶的作用是：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被________切開的兩個__________之間的____________。
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?
以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸連接成一條互補的DNA鏈
將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板
與DNA相關的五種酶的比較
關于下圖所示黏性末端的敘述，正確的是
A.①與③是由相同限制酶切割產生的B.DNA連接酶可催化①與③的連接C.經酶切形成④需要脫去2分子水D.DNA連接酶與DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
通常是利用______作為載體，將目的基因送入受體細胞中。質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有__________能力的很小的雙鏈_____DNA分子。 在基因工程中使用的載體除質粒外，還有____________、_____________________等。
DNA聚合酶的識別和結合位點
三、基因進入細胞的載體——分子運輸車
質粒作為運載體的條件： ①質粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，便于_____________________； ②質粒含有復制原點，可在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體細胞______________； ③質粒DNA分子上有特殊的____________，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，供重組DNA的____________。
外源DNA片段（目的基因）插入
普通的細菌一般是對抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中______（能/不能）生長。如果給普通細菌導入一個含有四環(huán)素抗性基因的質粒，四環(huán)素抗性基因的____________可使細菌獲得抵抗四環(huán)素的性狀。
如何利用標記基因的篩選呢？
圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因導入受體細胞的質粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關限制酶的作用部位如圖所示，現欲培養(yǎng)轉基因抗病植株，回答下列問題。
（1）上述操作中不宜選用Sma I，原因是Sma I會破壞__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcR I，原因是用EcR I切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因只有一側含有黏性末端，不能插入到質粒中
（一）提取DNA的方法
1.提取生物大分子的基本思路
選用一定的物理或化學方法，分離具有不同物理或化學性質的生物大分子
2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提?。?br/>利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同
利用這一特點，選擇適當的鹽濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀；
或者讓其他成分溶解，DNA析出
（二）DNA等大分子的理化性質
①根據DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最??？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？
②如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？
當氯化鈉的物質的量濃度為 2 ml／L時，DNA的溶解度最大，濃度為 0．14 ml／L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出
在NaCl溶液濃度低于0.14 ml/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 ml/L時，DNA溶解度最??；當NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但細胞中某些蛋白質則溶于酒精。利用這一原理，將DNA與蛋白質進一步分離。
2.DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性
① 蛋白酶——水解蛋白質， 對DNA沒有影響
② 高 溫——大多數蛋白質不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才會變性
③ 洗滌劑——瓦解細胞膜， 但對DNA沒有影響
沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應呈現藍色
（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液
（三）除去濾液中的雜質(純化)
（四）DNA的析出與鑒定
從下列材料中選取2～3種
菜花、香蕉、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜；魚卵、豬肝、雞血、哺乳動物的紅細胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌
凡是含有DNA的生物材料都可以考慮,但是，選用DNA含量相對較高的組織，成功的可能性更大。
新鮮的雞血（注意要加入檸檬酸鈉，防止血液凝固）
不能。因為哺乳動物成熟的紅細胞中無細胞核。
能否選用牛、羊、豬紅細胞血做實驗材料？為什么？
動物細胞的破碎較易，以雞血為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。
答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲溶液，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。
討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？
討論1：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？
答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
②實例：提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
①植物細胞需要先用一定的洗滌劑溶解細胞膜
答：研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。
討論2：如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？
1.攪拌的目的（注意應沿一個方向快速攪拌，但也不能過快過猛，防止打碎DNA ）
加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA
2.這個步驟過濾獲得什么？
獲得含核物質的濾液（獲取含DNA的濾液）（注意：此時釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質結合在一起，應用3——4層紗布進行過濾，除去一些顆粒較大的雜質）
3.濾液中可能含有哪些細胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質（為了純化提取的DNA需要將濾液作進一步處理）
（三）除去濾液中的雜質
方案一、在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2ml/L，過濾除去不溶的雜質，再加入蒸餾水，調節(jié)NaCl溶液濃度為0.14ml/L，析出DNA，過濾除去溶液中的雜質，再用2ml/L的NaCl溶液溶解DNA。
思考1：加入2ml/L的NaCl溶液，攪拌1min，注意應沿一個方向，目的是？
目的是使DNA充分溶解
思考2：過濾溶解有DNA的2ml/L的NaCl溶液，獲得什么？
思考3：這一步過濾的目的是？
獲得含DNA的濾液，除去不溶的雜質
思考4：加蒸餾水的目的是？
調節(jié)NaCl溶液物質的量為接近0．14ml/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
思考5：這一步攪拌的目的是？（輕輕地沿一個方向不停地均與攪拌）
稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物
思考6：這一步過濾含DNA黏稠物的0．14ml/L的NaCl溶液，獲得什么？
獲得DNA黏稠物（ 紗布上的DNA黏稠物）
獲得DNA黏稠物。除去溶液中的雜質
為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？
1.用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；2.用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。 因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。
討論：方案二與方案三的原理有什么不同？
方案二：利用蛋白酶分解雜質蛋白， 使提取的DNA與蛋白質分開；方案三：利用DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同， 使蛋白質變性，與DNA分離
思考：攪拌的目的(玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌)
卷起DNA絲狀物，獲取含雜質較少的DNA
加入與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分數95％)，靜置2－3min，溶液中會出現白色絲狀物，這就是粗提取的DNA
用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水
冷卻的酒精溶液(體積分數95％)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。
⑴ 向兩支試管中分別加入 2ml/L NaCl 溶液5ml⑵ 其中一支試管中加入DNA絲狀物，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解⑶ 向兩支試管中各加入二苯胺試劑4ml⑷ 混勻后，置于沸水浴中加熱5min⑸ 待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化。觀察現象：
溶解絲狀物的溶液變?yōu)樗{色
原理：DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，后者與二苯胺試劑反應生成藍色物質。
思考：可以單獨用甲基綠鑒定某種物質是否是DNA嗎？
不可以，甲基綠同樣會和RNA結合呈綠色！
1.以血液為實驗材料時，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。2.加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3.二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
稱取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml濃硫酸，用棕色瓶保存。臨用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml體積分數為0.2%的乙醛溶液。
觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多；二苯胺鑒定出現藍色說明實驗基本成功，如果不呈現藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現錯誤，需要重新制備
（一）是否提取出了DNA
（二）分析DNA中的雜質
本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。
⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細胞液 獲得含核物質的濾液 ⑵過濾含粘稠物的0.14ml/LNaCl溶液 獲取紗布上的DNA粘稠物 ⑶過濾溶解有DNA的2ml/LNaCl溶液 得到含DNA的濾液
1.本實驗中有三次過濾 ,獲得什么？
第一次攪拌加蒸餾水的雞血細胞液 加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA第二次攪拌加2ml/L NaCl溶液的濾液 目的是使DNA充分溶解在2ml/ LNaCl溶液中第三次攪拌加蒸餾水至0.14ml/L NaCl溶液 稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物第四次攪拌放入2ml/L NaCl溶液中紗布上的粘稠物 使DNA黏稠物充分溶解在2ml/L NaCl溶液中第五次攪拌體積分數為95%的酒精
2.實驗中有五次用玻璃棒攪拌?分別有什么作用?
3.本實驗兩次用蒸餾水
第一次：加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA
4.本實驗兩次析出DNA
第一次：用0.14 ml／L 的NaCI溶液析出DNA，過濾除去溶液中的雜質
第二次：用冷卻的95％的酒精，獲得含雜質較少的DNA（利用DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質則溶于酒精）
第二次：調節(jié)NaCl溶液物質的量為0．14ml/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
實驗成功的關鍵及注意事項
1.破碎細胞，釋放DNA的過程中，若是血細胞，加水后必須充分攪拌，不應少于5min；若是菜花，則應與研磨液混合，研磨時間不少于10min
2.用冷酒精濃縮和沉淀DNA時，所用的95%的酒精必須經過預冷后才能使用
3.在用玻璃棒攪拌時，玻璃棒不能直接插燒杯底部，并且攪拌要輕緩，以便獲得較完整的DNA分子
4.由于玻璃表面帶電荷，DNA中的磷酸基業(yè)帶電荷而被吸附于玻璃表面，故實驗中用塑料杯和試管可減少損失
1.材料中核物質沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠
實驗現象不明顯的原因分析
2.加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞
3.二苯胺配制時間過長，變成淺藍色，影響鑒定效果
4.析出含DNA的黏稠物時，蒸餾水一次快速加入，影響實驗結果
5.實驗中有多次攪拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作時不注意區(qū)分，影響實驗結果（注意：攪拌都沿一個方向進行）

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